專利名稱:一株海洋產(chǎn)表面活性劑菌株lhod-1及其應(yīng)用的制作方法
一株海洋產(chǎn)表面活性劑菌株LH0D-1及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種海洋產(chǎn)表面活性劑菌棲鹽田菌株 (Salinicola sp.)及其在處理受石油烴污染海水中的應(yīng)用。
背景技術(shù):
近年來,石油開采業(yè)逐漸由陸地走向海洋。石油的開采和海上運輸業(yè)的發(fā)展,導(dǎo)致由于井噴、運輸船舶的漏油、沉沒以及輸油管道的泄漏等造成的海洋石油烴污染事故屢見不鮮,受污染的海域范圍也在不斷擴(kuò)展。石油進(jìn)入海水后,使海水中大量的溶解氧被石油吸收,油膜覆蓋于水面,使海水與大氣隔離,造成海水缺氧,導(dǎo)致海洋生物死亡,給養(yǎng)殖資源帶來嚴(yán)重的危害。油污還可以使經(jīng)濟(jì)魚類、貝類等海產(chǎn)品產(chǎn)生油臭味,成年魚類、貝類長期生活在被污染的海水中其體內(nèi)蓄積了某些有害物質(zhì),通過食 物鏈進(jìn)入人體后嚴(yán)重危害人類健康。
利用微生物修復(fù)技術(shù)修復(fù)受污染的海水具有經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)境友好等優(yōu)點,是目前的優(yōu)先考慮技術(shù)。在生物修復(fù)過程中,石油烴的疏水性是限制其降解速率的主要因素之一。微生物攝取疏水性石油烴的一個重要策略就是分泌細(xì)胞代謝物即生物表面活性劑。生物表面活性劑含有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán),能夠降低油水界面張力,促使石油污染物分散、增溶、乳化,從而提高其生物可利用性,促使污染物高效生物降解。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種海洋產(chǎn)表面活性劑菌棲鹽田屬菌株,以提高海洋石油烴的降解效果,有效去除海洋石油烴污染,同時提供上述海洋產(chǎn)表面活性劑棲鹽田菌屬菌株在處理海洋石油烴污染的應(yīng)用。
本發(fā)明技術(shù)方案來是一種海洋產(chǎn)表面活性劑棲鹽田菌屬菌株,該菌株屬于棲鹽田菌屬(Salinicola sp.),保藏名稱棲鹽田菌LH0D-1,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,地址北京市中科院北京微生物研究所菌種保藏中心保藏日期2012 年 10 月 29 日,保藏號=CGMCC No. 6715。
所述海洋產(chǎn)表面活性劑棲鹽田菌屬菌株的篩選分離和鑒定過程為取受石油烴污染的海洋沉積物,在實驗室利用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)后,分離純化菌株,根據(jù)菌株對含油平板的曬油斑的形成和表面張力的測定,最終篩選出一株能產(chǎn)生表面活性劑的菌株,編號為 LH0D-1,然后根據(jù)菌落的形態(tài)特征、生理生化特征,及其16S rDNA基因序列與Genebank 中已登錄序列進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn),菌株LH0D-1經(jīng)鑒定為棲鹽田菌屬,命名為棲鹽田菌 (Salinicola sp. ) LH0D-1。
所述的海洋產(chǎn)表面活性劑棲鹽田菌菌株在處理受石油烴污染海水的具體過程為 取經(jīng)分離純化的海洋產(chǎn)表面活性劑棲鹽田菌CGMCC 6715單菌落,于擴(kuò)大活化培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h,菌液濃度達(dá)到1. OX IO8-L OX 109cfu/ml,按海水與菌液體的體積比為40-60:1,將海洋產(chǎn)表面活性劑棲鹽田菌CGMCC 6715接種于含柴油的海水中,25-28 °C恒溫振蕩培養(yǎng)1-1Odo所述恒溫振蕩培養(yǎng)的條件為25°C培養(yǎng)7d。所述活化擴(kuò)大培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件優(yōu)選為蛋白胨5.0 g,酵母膏1.0 g,磷酸高鐵0.1 g,陳海水 1000 mL, pH 7. 6-8. 2,121°C滅菌 20 min。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點本發(fā)明從受污染的海洋沉積物中得到產(chǎn)表面活性劑的新菌株,提高了石油烴污染的降解效率,在IOd內(nèi)對海水中柴油的去除率達(dá)到80%以上。
—株海洋產(chǎn)表面活性劑棲鹽田菌屬菌株,菌株屬于棲鹽田菌屬(Salinicolasp.),保藏名稱棲鹽田菌LH0D-1,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心,地址北京市中科院北京微生物研究所菌種藏中心保藏日期2012年10月29日,保藏號CGMCC No. 6715。圖1是棲鹽田菌CGMCC 6715的電鏡圖片;
圖2是棲鹽田菌CGMCC 6715的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳 圖3是棲鹽田菌CGMCC 6715菌株在油平板上形成的噬油斑;
圖4是棲鹽田菌CGMCC 6715表面活性劑的乳化性能;
圖5是投加棲鹽田菌CGMCC 6715菌株后降解效果。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明,但不以任何形式限制本發(fā)明。實施例1海洋產(chǎn)表面活性劑菌株的篩選方法
一、材料準(zhǔn)備1、菌源和實驗廢水
(I)菌源為受石油烴污染的遼寧省大連市7. 16溢油事故現(xiàn)場沉積物。(2)實驗廢水自然海水1000 mL, 121 V滅菌20 min,加入100 mg經(jīng)0. 2 um的微孔濾膜過濾后的柴油。2、培養(yǎng)基
(I)選擇培養(yǎng)基自然海水1000 mL,121 °C滅菌20 min,加入100 mg經(jīng)0. 2 um的微孔濾膜過濾后的柴油。(2)分離培養(yǎng)基蛋白胨5.0 g,酵母膏1.0 g,磷酸高鐵0.1 g,陳海水1000 mL,瓊脂粉 20 g,pH 7. 6-8. 2,121 °C滅菌 20 min。(3)活化擴(kuò)大培養(yǎng)基蛋白胨5. 0 g,酵母膏1. 0 g,磷酸高鐵0.1 g,陳海水1000mL, pH 7. 6-8. 2,121 °C滅菌 20 min。二、菌株的分離與篩選1、菌株的富集
移取2 g左右沉積物樣品置于盛有20 mL生理鹽水的三角瓶中震蕩搖勻后,靜置后,取上清液加入含有100 mg/L柴油的選擇培養(yǎng)基,溫度25 °C, 180 r/ min培養(yǎng)7 d,再將菌液轉(zhuǎn)接至新鮮的培養(yǎng)基,如此富集3次。
2、菌株的分離純化將富集液稀釋后,均勻涂布于分離培養(yǎng)基平板上,25 V培養(yǎng)5 d,待菌落長出后,挑取形態(tài)各異的單菌落,在分離培養(yǎng)基平板上劃線分離,直至得到純的單菌落。將分離純化的細(xì)菌接種至斜面培養(yǎng)基,并于冰箱4 °C保存。
3、表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選通過對含油平板的噬油斑的形成(見圖3)和表面張力的測定,來確定菌株的產(chǎn)表面活性劑能力。
通過挑取新鮮培養(yǎng)的菌落,接種于以以柴油為唯一碳源的平板上,25 °C培養(yǎng)3-5d 后觀察噬油斑的有無,然后挑選出有噬油斑的菌落接種于斜面上,25°C條件下培養(yǎng)3-5d 后,于4 °C冰箱保存。
取產(chǎn)生噬油斑的4種形態(tài)不同單菌落接種于活化擴(kuò)大培養(yǎng)基中,25 °C培養(yǎng)5 d, 離心去除菌體,采用上海衡平儀器儀表廠生產(chǎn)的BZY-1表面張力儀測定液體表面張力,結(jié)果如表I所示。
表I菌株發(fā)酵液表面張力值菌株編號表面張力值(mN · nf1)菌株編號表面張力值(mN · nf1)LH0D-132. 63#48. 72#41. 44#42. 6經(jīng)過篩選獲得一株編號為LH0D-1的菌株,即海洋產(chǎn)表面活性劑菌株LH0D-1 實施例2海洋產(chǎn)表面活性劑菌株LH0D -1的鑒定1、對海洋產(chǎn)表面活性劑菌株的鑒定對海洋產(chǎn)表面活性劑棲鹽田菌CGMCC 6715進(jìn)行了生理生化鑒定以及16S rDNA分子鑒定,從分子水平,并結(jié)合細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征及生理生化特征分析確定菌株的種屬。
16S rDNA序列分析主要按照以下步驟①細(xì)菌核酸DNA的提取采用TAKARA細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒獲得菌株的DNA②16SrDNA基因的PCR擴(kuò)增Pl 27f (5’ -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)P2 1492r (5,-AAG TCG TAACAAGGT AAC C_3,)在50 uL體系中,加入I uL模板DNA (O.1 ug),0. 5 uL Pl和P2 (終濃度為O. 5 uM),IuL dNTP (O. 2 mM), O. 5 uL Taq 酶和 5uL 10XPCR 緩沖液。PCR擴(kuò)增條件為94°C 預(yù)變性 5 min,94 °C變性30 s 65 °C退火30 s, 72 °C延伸I min,循環(huán)30次,最后72 °C終延伸10min2、16S rDNA序列的測定本發(fā)明采用對16S rDNA序列測定和分析的方法對細(xì)菌進(jìn)行分子水平的鑒定。以細(xì)菌的DNA為模板,以16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增的通用引物為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到長度為 1448 bp的擴(kuò)增帶,用1%的瓊脂糖電泳監(jiān)測,如圖2所示,產(chǎn)物經(jīng)純化后,測定其全序列。
tacacatgca cgtcagagcg gcagcacggg gagcttgctc cctggtggcg agcggcggac 60 gggtgagtaa tgcataggaa tctgcccggt agtgggggat aacgtgggga aacccacgct 120aataccgcat acgtcctacg ggagaaagcg gaggatcttc ggacttcgcg ctatcggatg 180 agcctatgtc ggattagcta gttggtaagg taacggctta ccaaggcgac gatccgtagc 240tggtctgaga ggatgatcag ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag300
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ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tggactgcac1380 cagaagtggt tagcttaacc ttcgggagag cgatcaccac ggtgtggttc atgactgggg 1440 tgaagtcg 1448 實施例3海洋產(chǎn)表面活性劑菌株LHOD-1細(xì)胞形態(tài),生理生化特征 海洋產(chǎn)表面活性劑棲鹽田菌CGMCC 6715的生理生化特征見表2,細(xì)胞形態(tài)見圖1。表2海洋產(chǎn)表面活性劑菌株LH0D-1的細(xì)胞形態(tài)及生理生化特征
權(quán)利要求
1.一株海洋產(chǎn)表面活性劑棲鹽田菌菌株,其特征在于該菌株屬于棲鹽田菌菌屬 (Salinicola sp.),保藏名稱為Salinicola sp. LH0D-1,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏日期2012年10月29日,保藏號=CGMCC No. 6715。
2.如權(quán)利要求1所述的海洋產(chǎn)表面活性劑棲鹽田菌菌株在處理石油烴污染海水中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用,其特征在于所述的海洋產(chǎn)表面活性劑棲鹽田菌菌株在處理受石油烴污染海水的具體過程為取經(jīng)分離純化的海洋產(chǎn)表面活性劑棲鹽田菌CGMCC 6715單菌落,于擴(kuò)大活化培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,菌液濃度達(dá)到1.0X 108 -1.0X 109cfu/ml ;按海水與菌液體積比為40-60:1,將海洋產(chǎn)表面活性劑棲鹽田菌CGMCC 6715接種于含有柴油的海水中,25-28 °C恒溫振蕩培養(yǎng)l-10d。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用,其特征在于所述恒溫振蕩培養(yǎng)的條件為25°C培養(yǎng)7d。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用,其特征在于所述活化擴(kuò)大培養(yǎng)基的培養(yǎng)基為蛋白胨 5.0 g,酵母膏1. O g,磷酸高鐵 O.1 g,陳海水 1000 mL,pH 7. 6-8. 2,121°C滅菌 20 min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海洋產(chǎn)表面活性劑菌株,該菌屬屬于棲鹽田菌屬(Salinicolasp.),保藏名稱為Salinicolasp.LHOD-1,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏日期2012年10月29日,保藏號CGMCCNo.6715。該菌株具有產(chǎn)表面活性劑能力,對海洋中的石油烴污染具有較強的乳化效果,能幫助去除海水中的石油烴污染,并且對海水養(yǎng)殖生物沒有毒害致病作用。
文檔編號C12N1/20GK102994428SQ20121050154
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者關(guān)曉燕, 周遵春, 董穎, 王擺, 楊愛馥, 陳仲, 姜北, 蔣經(jīng)偉, 高杉 申請人:遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院