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一種高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細(xì)胞瞬間表達(dá)的方法及其應(yīng)用的制作方法

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專利名稱::一種高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細(xì)胞瞬間表達(dá)的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域
,公開(kāi)了一種高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細(xì)胞瞬間表達(dá)的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
:白粉病是小麥的主要真菌病害之一,培育抗病品種是目前最經(jīng)濟(jì)有效的方法。常規(guī)育種周期長(zhǎng),轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)育種是高效培育抗病小麥抗病新品種的有效策略。但小麥基因組龐大、組織培養(yǎng)周期長(zhǎng)且轉(zhuǎn)基因頻率太低,限制了利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法高通量、快速鑒定白粉病抗病候選基因及相關(guān)基因功能的研究,使得有效抗白粉病基因的發(fā)掘受阻。因此,建立快速而有效的鑒定白粉病抗病候選基因功能的技術(shù)體系顯得尤為重要。單細(xì)胞瞬間表達(dá)技術(shù)可將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞內(nèi)在一定時(shí)間內(nèi)(降解之前)可獲得瞬間超量表達(dá),亦可將外源基因片段構(gòu)建呈“發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)”導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)瞬間表達(dá)后引起內(nèi)源基因沉默(TIGS),同時(shí)在單細(xì)胞基礎(chǔ)上研究瞬間表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的外源基因表達(dá)改變對(duì)病原菌侵染的影響,分析外源基因的抗病功能。對(duì)抗病基因工程的上游已經(jīng)篩選和克隆出的包括抗病基因類似物、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)傳導(dǎo)因子及大量的抗病基因類似物片段等,利用單細(xì)胞瞬間表達(dá)技術(shù)這種高效而快速的功能驗(yàn)證方法,來(lái)鑒定它們的功能,可以有效地推動(dòng)其在分子育種中的研究和利用。利用單細(xì)胞瞬間表達(dá)技術(shù)在大麥中鑒定白粉病抗病基因的功能已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用(NelsonAJ,BushnellffR.Transientexpressionofanthocyaningenesinbarleyepidermalcells:potentialforuseinevaluationofdiseaseresponsegenes.TransgenicRes,1997,6(3):233-244;SchultheissH,DechertC.AsmallGTP—bindinghostproteinsrequiredforentryofpowderymildewfungusintoepidermalcellsofbarley.PlantPhysiol,2002,128(4):1447-1454X—個(gè)高效的小麥基因槍瞬間表達(dá)技術(shù)體系的包括三個(gè)要素1、方便觀察和統(tǒng)計(jì)的報(bào)告基因;2、高效的基因槍轉(zhuǎn)化參數(shù);3、適合的目標(biāo)基因表達(dá)產(chǎn)物與白粉菌互作效率的統(tǒng)計(jì)參數(shù)。近幾年,單細(xì)胞瞬間表達(dá)技術(shù)在小麥中也有初步的應(yīng)用(Schweizer,Pokornyetal.ATransientAssaySystemfortheFunctionalAssessmentofDefense-RelatedGenesinWheat.MolecularPlant-Microbelnteractions.1999,12:647-654),但是該技術(shù)在小麥中還存在基因槍轉(zhuǎn)化的效率受人為操作的主觀影響而效率較低、在小麥中缺乏高效的基因槍轉(zhuǎn)化參數(shù)的篩選、選用報(bào)告基因表達(dá)效率不穩(wěn)定等一些問(wèn)題。為了建立高效小麥單細(xì)胞瞬間表達(dá)體系,本發(fā)明緊扣上述三要素,以小麥離體葉片為受體,使用綠色熒光蛋白(GFP)基因作為報(bào)告基因,對(duì)表達(dá)效率影響較大的多個(gè)轉(zhuǎn)化參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,建立了適合小麥單細(xì)胞瞬間表達(dá)的技術(shù)體系,并利于該體系對(duì)族毛麥Sgtl基因在小麥白粉病抗病中的功能研究,為下一步該基因在小麥抗白粉病轉(zhuǎn)基因育種中的利用提供依據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷,對(duì)小麥離體葉片基因槍轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,建立了高效的小麥單細(xì)胞瞬間表達(dá)體系。本發(fā)明的另一目的是提供一種高頻小麥葉片瞬間表達(dá)體系分析外源基因的抗白粉病功能的方法。本發(fā)明的又一目的是提供含有抗白粉病相關(guān)基因族毛麥SGTl基因的表達(dá)載體。本發(fā)明的又一目的是提供該表達(dá)載體在小麥抗白粉病轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細(xì)胞的方法,使用綠色熒光蛋白GFP基因作為報(bào)告基因,以小麥第一葉的離體葉片為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化,小麥葉片采用固體保鮮培養(yǎng)基固定,基因槍轉(zhuǎn)化采用直徑為IUm的鎢粉,用量為300ug/槍,質(zhì)粒DNA用量為750ng/槍,轟擊距離采用可裂膜氦壓為1350psi,可裂膜與受體膜距離為6mm,受體與阻擋網(wǎng)距離為6cm。本發(fā)明所述高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細(xì)胞的方法在白粉病抗病基因篩選和/或功能鑒定中的應(yīng)用。一種利用本發(fā)明所述的高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細(xì)胞的方法分析外源基因的抗白粉病功能的方法,包括如下步驟I)采用權(quán)利要求I所述的方法將含有候選基因的質(zhì)粒通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片;2)接種白粉菌,觀察基因瞬間表達(dá)的葉片單細(xì)胞對(duì)白粉菌的抗性作用,以白粉菌吸器指數(shù)大小作為抗性高低的衡量標(biāo)準(zhǔn)。利用上述的方法篩選到的含有Hv-SGTl基因的表達(dá)載體。所述的Hv-SGTl的表達(dá)載體優(yōu)選以PBI220為出發(fā)載體,將Hv-SGTl基因插入PBI220的BamHI和SacI酶切位點(diǎn)間所得。本發(fā)明所述的含Hv-SGTl的表達(dá)載體在培育抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。有益效果I)基因槍轉(zhuǎn)化過(guò)程中,基因槍轉(zhuǎn)化效率受多個(gè)因素的綜合影響,本發(fā)明運(yùn)用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究了離體葉片固定方法、每槍金粉用量、每槍DNA用量、可裂膜氦壓等因素的影響,并且雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)綜合考察了轟擊距離A(可裂膜與載體膜之間的距離)和B(阻擋網(wǎng)與受體組織之間的距離)組合對(duì)表達(dá)效率的影響。找到了優(yōu)化的基因槍轟擊參數(shù),建立了高效的轉(zhuǎn)化體系。2)本發(fā)明提供了一種高頻小麥葉片瞬間表達(dá)體系分析外源基因的抗白粉病功能的方法,運(yùn)用優(yōu)化的基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)體系在感病小麥品種離體葉片表皮細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)簇毛麥SGTl基因,結(jié)果表明該基因瞬間表達(dá)使互作細(xì)胞吸器指數(shù)降低,對(duì)白粉病菌侵入和吸器形成有抑制作用,可增強(qiáng)對(duì)白粉病菌的抗性。本發(fā)明建立的單細(xì)胞瞬間表達(dá)體系可成功應(yīng)用于白粉病抗病基因功能的鑒定。圖I離體葉片的兩種固定方式-固體培養(yǎng)基法(A)和載玻片法(B)圖2報(bào)告基因Cl-Lc(A)、GFP⑶、⑶S(C)在小麥葉片表皮細(xì)胞中的表達(dá)圖3基因槍轉(zhuǎn)化參數(shù)的瞬間表達(dá)分析,A:每槍鎢粉用量對(duì)瞬間表達(dá)效率的影響;B:每槍質(zhì)粒DNA用量對(duì)瞬間表達(dá)效率的影響;C:可裂膜氦壓對(duì)瞬間表達(dá)效率的影響;D:轟擊距離A(可裂膜與載體膜之間距離)+B(阻擋網(wǎng)與受體組織之間距離)對(duì)瞬間表達(dá)效率的影響圖4pBI220=Hv-SGTl過(guò)量表達(dá)載體構(gòu)建圖譜圖5⑶S基因在小麥葉片表皮細(xì)胞中的表達(dá)及目標(biāo)基因與白粉菌的互作,a-d:白粉菌成功侵入表達(dá)GUS基因的表皮細(xì)胞后形成的吸器,200X;e-h:白粉菌附著孢未能侵入表達(dá)⑶S和目標(biāo)基因的表皮細(xì)胞,200X。geec:表達(dá)⑶S基因的表皮細(xì)胞;ha:吸器;app:附著孢;co:接種孢子;hy:菌絲。具體實(shí)施例方式實(shí)施例I高基因槍轉(zhuǎn)化小麥離體葉片體系的建立I.I材料與方法帶不同報(bào)告基因的表達(dá)載體報(bào)告基因花青素苷合成調(diào)節(jié)基因Cl-Lc的表達(dá)載體pBecks400.RecKMcCormacAC,WuHX,BaoMZ,WangYB,XuRJ,ElliottMC,ChenDF.Theuseofvisualmarkergenesascell-specificreportersofAgrobacterium-mediatedT-DNAdeliverytowheat(TriticumaestivumL.)andbarley(HordeumvulgareL.).Euphytica,1998,99(I):17-25.)。綠色熒光蛋白基因GFP的表達(dá)載體psGFP(TakashiTamura,KojiroHara,YubeYamaguchi,NozomuKoizumiandHiroshiSano.Osmoticstresstoleranceoftransgenictobaccoexpressingageneencodingamembrane-locatedreceptor-1ikeproteinfromtobaccoplants.PlantPhysiol,2003,131:454-462.)。P-1,3-葡萄糖苷酸酶基因⑶S的表達(dá)載體pAHC25(ChristensenAH,QuailPH,Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996,5:213-218.)。高感白粉病小麥品種揚(yáng)麥158的種子分別種在小塑料盆缽中,放置在無(wú)病原菌的光照箱中于25°C、每天12h光照培養(yǎng)7d。剪下一葉期小麥幼苗葉片約4cm長(zhǎng)的端部,取5飛片葉片,背面朝上,并排貼在加了20mg/L6-BA的水瓊脂固體培養(yǎng)基表面,用塑料插地牌制作的阻擋扣固定兩端(圖1A);用雙面膠貼在載玻片上,剪切口用濕潤(rùn)的吸水紙壓住以保濕,接受基因槍轟擊(圖1B)?;驑屖褂胇^1000/抱系統(tǒng),采用直徑1.011111鎢粉,表達(dá)載體質(zhì)粒用北京天根公司質(zhì)粒小提中量試劑盒提取并用酶標(biāo)儀定量,終濃度為IUg/Ul。待優(yōu)化的參數(shù)包括葉片固定方式(圖I)、鎢粉用量、質(zhì)粒DNA用量、可破裂膜的氦壓、轟擊距離(A-可裂膜與載體膜之間的距離;B-阻擋網(wǎng)與受體組織之間的距離)、真空度。鎢粉的準(zhǔn)備和質(zhì)粒的包裹如下制備鶴粉稱取30mg的鶴粉于I.5mleppendorf管中,加入Iml70%酒精,潤(rùn)旋3-5min后靜置15min,使鶴粉完全沉淀。12000rpm離心Imin后棄上清。加入Iml(1(11120水,渦旋混勻后,離心棄上清(重復(fù)三次)。最后加入500ii150%甘油渦旋混勻,以備用。包裹子彈吸取16-135ill渦旋均勻的鎢粉(10槍,100-800iig/槍)于1.5ml的eppendorf管中,加入220無(wú)菌水,邊潤(rùn)旋邊向eppendorf管內(nèi)滴加50ii12.5MCaCl2,然后加入20u10.IM亞精氨(現(xiàn)配先用),10uI質(zhì)粒DNA(總量應(yīng)為0.25-1.5yg/槍),冰上渦旋lOmin。靜置Imin后離心2s,棄上清。加入600iU70%酒精,充分渦旋,離心2s,棄上清。然后加入600iill00%酒精,充分渦旋,離心2s,棄上清。最后加入100iill00%酒精(IOiil/槍),充分渦旋,以備使用。I.2結(jié)果與分析I.2.I報(bào)告基因Cl-Lc、GFP、⑶S均能在小麥的葉片表皮細(xì)胞中表達(dá)本研究首先采用花青素合成酶調(diào)節(jié)基因(Cl-Lc),綠色熒光蛋白基因(GFP),^-半乳糖苷酶基因(GUS)分別作為報(bào)告基因轉(zhuǎn)化小麥葉片獲得瞬間表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),雖然花青素合成酶基因和GFP基因表達(dá)載體使用的是CAMV35S啟動(dòng)子,而GUS使用的是Ubi啟動(dòng)子,但三者在小麥葉片表皮細(xì)胞中的表達(dá)效率沒(méi)有顯著差異,每張葉片均可獲得幾十甚至上百個(gè)表達(dá)細(xì)胞(圖2),而且報(bào)告基因在表皮長(zhǎng)細(xì)胞、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞、氣孔間短細(xì)胞等各種類型的表皮細(xì)胞中都能夠正常表達(dá)。三種報(bào)告基因中,以花青素的觀察最為簡(jiǎn)單,表達(dá)細(xì)胞肉眼可見(jiàn)紅色花青素積累(圖2A),但由于表達(dá)細(xì)胞顏色會(huì)逐漸加深至紅褐色,在顯微鏡下無(wú)法看清楚表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的白粉菌的結(jié)構(gòu),而且脫色時(shí)會(huì)和葉綠素一樣迅速褪去。GFP的觀察可在活體進(jìn)行,在熒光顯微鏡下使用藍(lán)光激發(fā),可見(jiàn)到呈亮綠色熒光的轉(zhuǎn)化細(xì)胞(圖2B),但是在表達(dá)GFP的細(xì)胞內(nèi)也無(wú)法看清楚白粉菌的結(jié)構(gòu)。GUS基因產(chǎn)物不能進(jìn)行活體觀察,必需經(jīng)過(guò)化學(xué)染色和脫色再觀察,但在將轉(zhuǎn)化陽(yáng)性細(xì)胞染成藍(lán)色的同時(shí)也能特異地將白粉菌的吸器染成藍(lán)色(圖2C),易于觀察和統(tǒng)計(jì)。綜合上述特點(diǎn),后續(xù)的研究在優(yōu)化基因槍轟擊參數(shù)的實(shí)驗(yàn)中采用GFP做報(bào)告基因,而在驗(yàn)證基因功能的實(shí)驗(yàn)中采用GUS做報(bào)告基因。I.2.2葉片固定方式的選擇在基因槍轟擊到實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因瞬間表達(dá),再到后續(xù)接種白粉菌研究其互作特性的過(guò)程中,離體的葉片要保持其細(xì)胞活力至少52個(gè)小時(shí),加上要盡量減少葉片在轟擊過(guò)程中的損傷,以及避免轟擊時(shí)由于可裂膜破裂產(chǎn)生的沖力而打飛葉片影響轟擊的效率,葉片的固定方式值得進(jìn)行探究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)培養(yǎng)基和載破片兩種固定方式的比較發(fā)現(xiàn)小麥葉片寬且平整,表面無(wú)絨毛及較厚的蠟質(zhì)層,采用含保鮮劑固體培養(yǎng)基固定,便于保濕透氣,進(jìn)而保持了葉片細(xì)胞的活性;兩端用自制的阻擋扣壓緊,使葉片在基因槍轟擊過(guò)程中也不會(huì)被打飛掉;接種白粉菌后葉片在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),既能使葉片保持活性,延緩轟擊損傷造成的細(xì)胞死亡,又能保證濕度有利于白粉菌的發(fā)育。因此,采用含保鮮劑固體培養(yǎng)基固定離體葉片的方法的優(yōu)點(diǎn)明顯,在后續(xù)的基因功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中被一直使用。I.2.3基因槍轟擊參數(shù)對(duì)表達(dá)效率的影響用帶有報(bào)告基因GFP的質(zhì)粒對(duì)影響較大的鎢粉用量,質(zhì)粒DNA用量,氦壓,轟擊距離A(可裂膜與載體膜之間的距離)和B(阻擋網(wǎng)與受體組織之間的距離)組合等轉(zhuǎn)化參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化以獲得較高的瞬間表達(dá)頻率。鎢粉用量在50-500ug/槍的范圍內(nèi),隨著濃度的增加,瞬間表達(dá)效率也隨之提聞,300-500iig/槍的范圍內(nèi),GFP瞬間表達(dá)頻率差異不大(圖3-a)。這與王華忠等(2006)報(bào)道的金粉的用量對(duì)表達(dá)效率的影響的結(jié)果一致,可見(jiàn)使用鎢粉與金粉的差異不大,且鎢粉濃度較高,不僅不利于包裹上DNA后微彈的分散,而且還可能因轟擊損傷細(xì)胞數(shù)目的增加而影響表達(dá)效率的提高,故采用300yg/槍鎢粉是適宜的。鎢粉用量為300ug/槍時(shí),質(zhì)粒DNA濃度在250-1500Ug/槍的范圍內(nèi),隨著濃度的增加,GFP瞬間表達(dá)效率也隨之提高,在750ng/槍,GFP表達(dá)的效率最高,超過(guò)IOOOng/槍后則GFP表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯下降(圖3-b),可能因?yàn)橘|(zhì)粒濃度高影響了鎢粉顆粒的分散,從而影響轟擊的效果。在研究氦壓對(duì)表達(dá)效率的影響時(shí),鎢粉用量為300iig/槍,質(zhì)粒濃度為750ng/槍,采用可承受750psi、900psi、1100psi、1350psi、1550psi氦壓的五種可破裂膜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,當(dāng)使用1350psi的可破裂膜時(shí),單張葉片轟擊后表達(dá)GFP的細(xì)胞個(gè)數(shù)最多(圖3-c),且明顯高于其他參數(shù)組。在研究轟擊距離對(duì)表達(dá)效率的影響時(shí),鎢粉用量為300iig/槍,質(zhì)粒濃度為750ng/槍。轟擊距離A-可裂膜與載體膜之間的距離采用(3,6,9,12mm)4個(gè)梯度;B-阻擋網(wǎng)與受體組織之間的距離(6,9,12cm)3個(gè)梯度,共計(jì)12個(gè)組合。結(jié)果表明,轟擊距離A_6mm和B-6cm的組合,單張葉片轟擊后表達(dá)GFP的細(xì)胞個(gè)數(shù)最多(圖3_d)。最適的轟擊參數(shù)主要是轟擊損傷(細(xì)胞損傷)和轟擊效率(接受金粉的細(xì)胞數(shù))之間的平衡。綜合上述影響因素,選擇以下參數(shù)用于基因槍轉(zhuǎn)化鎢粉用量300yg/槍;質(zhì)粒DNA濃度750ng/槍,氦壓1350psi;可裂膜與受體膜距離6mm;受體與阻擋網(wǎng)距離6cm。實(shí)施例2簇毛麥SGTl基因Hv-SGTl過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建以簇毛麥SGTl基因cDNA(SEQIDNO.I)為模板,使用引物對(duì)SGTlATG-BamHIF(TTGGATCCTCGACGCAGACATGG,SEQIDNO.2)和SGH-TGA-KpnI-R(GCGGTACCTCATTAATACTCCCAC,SEQIDNO.3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,回收擴(kuò)增片段。用BamHI和KpnI對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切,將酶切產(chǎn)物插入到BamHI和KpnI雙酶切后的載體pBI220((JeffersonRA,KavanaghTA,BevanMW.GUSfusions:beta-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ.1987,6:3901-3907.))JfHv-SGTl置于35S啟動(dòng)子后面的多克隆位點(diǎn)處。由此將目標(biāo)基因Hv-SGTl克隆到強(qiáng)啟動(dòng)子35S的下游,獲得表達(dá)載體pBI220:Hv-SGTl(圖4)。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證,表明載體構(gòu)建成功。實(shí)施例3利用瞬間表達(dá)方法將Hv-SGTl基因轉(zhuǎn)入感病小麥葉片,研究其與小麥白粉病的互作效果3.I材料與方法將目標(biāo)基因Hv-SGTl的表達(dá)載體與⑶S表達(dá)載體pAHC25(ChristensenAH,QuailPH.Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996,5:213-218.)質(zhì)粒DNA混合同時(shí)包裹鎢粉(目標(biāo)基因載體與GUS基因載體濃度的摩爾比例為2:1),用基因槍轟擊小麥葉片共轉(zhuǎn)化。葉片轟擊后4h接種白粉病菌孢子。接種方法將一塑料片卷成圓桶狀置于瓷盤上,從上面均勻抖落新鮮的白粉病菌孢子,接種密度要高,至少I個(gè)表皮細(xì)胞表面落有I個(gè)孢子。瞬間表達(dá)后的處理過(guò)程為接種后48h進(jìn)行⑶S染色(配方為0.lmol/LNa2HPO4/NaH2PO4緩沖液(pH7.0),含10mmol/LEDTA,5mmol/L鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀,0.lmg/mlX-Gluc,0.l%TritonX-100,20%甲醇,)真空滲透lOmin,37°C染色24h,然后用70%酒精脫色2天直至葉片變成白色為止,最后利用濃度為0.6%的考馬斯亮藍(lán)對(duì)白粉菌孢子染色。然后在載玻片上滴加50%甘油作為浮載劑和保存劑,在Olympus顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化陽(yáng)性細(xì)胞表面白粉病菌的發(fā)育情況及細(xì)胞內(nèi)吸器的有無(wú)。吸器指數(shù)定義為在一定數(shù)目的表達(dá)GUS基因并且落有白粉病孢子的陽(yáng)性表皮細(xì)胞中,白粉菌成功侵入并在細(xì)胞內(nèi)形成吸器的細(xì)胞所占的比例。相對(duì)吸器指數(shù)將對(duì)照組侵入頻率矯正為100%,處理組作相應(yīng)矯正。每個(gè)質(zhì)粒載體的轟擊重復(fù)3次,每次重復(fù)轟擊4個(gè)培養(yǎng)皿的葉片,根據(jù)3次重復(fù)的數(shù)據(jù)計(jì)算平均吸器指數(shù)并運(yùn)用卡方測(cè)驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。3.2結(jié)果與分析感白粉病葉片只轉(zhuǎn)GUS基因?qū)φ战臃N白粉菌后經(jīng)GUS染色,可以觀察到大部分GUS陽(yáng)性細(xì)胞表面的孢子都能夠正常萌發(fā),長(zhǎng)出初生芽管和附著孢芽管,附著孢芽管末端形成附著孢緊緊貼附于表皮細(xì)胞表面并向表皮細(xì)胞壁的方向形成侵入釘,進(jìn)一步侵入表皮細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)形成吸器,由于吸器是白粉菌吸收營(yíng)養(yǎng)繼續(xù)生長(zhǎng)并形成次級(jí)菌絲和菌落等(圖5a-d)。而在共轉(zhuǎn)化目的基因Hv-SGTl與⑶S基因的⑶S陽(yáng)性細(xì)胞中,白粉菌的侵染終止在侵入釘侵入表皮細(xì)胞這一步,并不能在細(xì)胞內(nèi)形成吸器,這樣的細(xì)胞視為由于目標(biāo)基因過(guò)量表達(dá)產(chǎn)物在該GUS陽(yáng)性細(xì)胞中的積累抑制吸器的形成,增強(qiáng)了對(duì)白粉病菌的抗性的陽(yáng)性細(xì)胞(圖5e-h)。目的基因Hv-SGTl與小麥白粉病的互作效果統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明(表1),該基因使互作細(xì)胞吸器指數(shù)降低至25.5%,對(duì)照為單獨(dú)導(dǎo)入GUS基因的葉片表皮細(xì)胞吸器指數(shù)為42.5%,表明該基因?qū)Π追鄄【秩牒臀餍纬捎幸种谱饔?,可增?qiáng)小麥對(duì)白粉病菌的抗性。表I利用建立的瞬間表達(dá)體系研究Hv-SGTl對(duì)白粉菌吸器形成的影響權(quán)利要求1.一種高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細(xì)胞的方法,其特征在于使用綠色熒光蛋白GFP基因作為報(bào)告基因,以小麥第一葉的離體葉片為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化,小麥葉片采用固體保鮮培養(yǎng)基固定,基因槍轉(zhuǎn)化采用直徑為IUm的鎢粉,用量為300ug/槍,質(zhì)粒DNA用量為750ng/槍,轟擊距離采用可裂膜氦壓為1350psi,可裂膜與受體膜距離為6mm,受體與阻擋網(wǎng)距離為6cm。2.權(quán)利要求I所述的方法在白粉病抗病基因篩選和/或功能鑒定中的應(yīng)用。3.一種利用權(quán)利要求I所述的方法分析外源基因抗白粉病功能的方法,其特征在于包括如下步驟1)采用權(quán)利要求I所述的方法將含有候選基因的質(zhì)粒通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片;2)接種白粉菌,觀察基因瞬間表達(dá)的葉片單細(xì)胞對(duì)白粉菌的抗性作用,以白粉菌吸器指數(shù)大小作為抗性高低的衡量標(biāo)準(zhǔn)。4.利用權(quán)利要求3所述的方法篩選到的含有Hv-SGTl基因的表達(dá)載體。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體,其特征在于所述的Hv-SGTl的表達(dá)載體是以PBI220為出發(fā)載體,將Hv-SGTl基因插入pBI220的BamHI和SacI酶切位點(diǎn)間所得。6.權(quán)利要求4或5所述的含Hv-SGTl的表達(dá)載體在培育抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)一種高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細(xì)胞瞬間表達(dá)的方法及其應(yīng)用。高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細(xì)胞的方法,使用GFP基因作為報(bào)告基因,以小麥第一葉的離體葉片為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化,小麥葉片采用固體保鮮培養(yǎng)基固定,基因槍轉(zhuǎn)化采用直徑為1μm的鎢粉,用量為300ug/槍,質(zhì)粒DNA用量為750ng/槍,轟擊距離采用可裂膜氦壓為1350psi,可裂膜與受體膜距離為6mm,受體與阻擋網(wǎng)距離為6cm。利用該方法在感病小麥品種揚(yáng)麥158的離體葉片表皮細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)簇毛麥SGT1基因,結(jié)果表明該基因瞬間表達(dá)可降低互作細(xì)胞中白粉菌吸器指數(shù),表明該基因?qū)Π追鄄【秩牒臀餍纬捎幸种谱饔?,可增?qiáng)對(duì)白粉病菌的抗性。文檔編號(hào)C12N15/63GK102978230SQ20121050703公開(kāi)日2013年3月20日申請(qǐng)日期2012年12月3日優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日發(fā)明者邢莉萍,曹愛(ài)忠,錢晨,王秀娥,陳佩度申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
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