一種利用病毒載體誘導(dǎo)番茄抗tylcv的方法
【專利摘要】本發(fā)明為一種利用病毒載體誘導(dǎo)番茄抗TYLCV的方法，其特征在于：利用病毒載體在番茄體內(nèi)表達(dá)病毒序列而誘導(dǎo)番茄對(duì)病毒產(chǎn)生抗性，根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的TYLCV基因組序列，利用生物信息學(xué)軟件(DNAStar，Madison，WI，USA)分析尋找其保守區(qū)段(ΔRep)，設(shè)計(jì)引物，以TYLCV侵染的番茄葉片總DNA為模板，擴(kuò)增克隆目的保守片段(約350nts)。將該片段反向重復(fù)插入TYLCV隨機(jī)序列兩側(cè)(約200nts)。再用限制性酶BamHI和EcoRI介導(dǎo)克隆至沉默載體TRV2中，構(gòu)建基于RNA干擾的表達(dá)hpRNA的植物沉默載體TRV2-ΔRep，利用電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，浸潤(rùn)番茄幼苗上部剛剛完全展開的葉片，從而使番茄獲得對(duì)TYLCV的抗性。采用本發(fā)明的方法，可以快速使番茄獲得對(duì)TYLCV的抗性，大大節(jié)約了傳統(tǒng)育種的成本。
【專利說明】一種利用病毒載體誘導(dǎo)番茄抗TYLCV的方法
一、【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及簡(jiǎn)便誘導(dǎo)番茄對(duì)TYLCV產(chǎn)生抗性的方法，具體是一種利用番茄自身抗病毒的規(guī)律，通過在番爺植株體內(nèi)表達(dá)病毒序列從而使番爺植株產(chǎn)生對(duì)病毒的抗性。
二、【背景技術(shù)】:
[0002]番爺黃化曲葉病毒(Tomato yellow lea fcurl virus,TYLCV)是世界范圍內(nèi)廣泛存在的一種植物單鏈DNA病毒，該病毒對(duì)番茄生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害。自2006年該病害首次在我國(guó)上海地區(qū)發(fā)現(xiàn)以來，該病害已經(jīng)蔓延到了浙江、江蘇、山東、河北等地，對(duì)我國(guó)的番茄生產(chǎn)構(gòu)成了很大的威脅。RNA干擾(也稱RNA沉默)是近年發(fā)現(xiàn)的植物對(duì)病毒的自然抗性機(jī)制，利用該機(jī)制進(jìn)行番茄抗TYLCV的研究有望獲得廣譜高抗的番茄材料，同時(shí)可為進(jìn)一步揭示RNA介導(dǎo)的抗病機(jī)理研究提供理論依據(jù)，因而具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0003]本發(fā)明提出一種通過利用病毒載體在番茄植株體內(nèi)表達(dá)TYLCV序列從而誘導(dǎo)番茄對(duì)TYLCV產(chǎn)生抗性的方法。
[0004]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:利用病毒載體在番茄體內(nèi)表達(dá)病毒序列而誘導(dǎo)番茄對(duì)病毒產(chǎn)生抗性，根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的TYLCV基因組序列，利用生物信息學(xué)軟件(DNAStar，Madison,WI,USA)分析尋找其保守區(qū)段(Λ Rep)，設(shè)計(jì)引物，以TYLCV侵染的番茄葉片總DNA為模板，擴(kuò)增克隆目的保守片段(約350nts)。將該片段反向重復(fù)插入TYLCV隨機(jī)序列兩側(cè)(約200nts)。再用限制性酶BamHI和EcoRI介導(dǎo)克隆至沉默載體TRV2中，構(gòu)建基于RNA干擾的表達(dá)hpRNA的植物沉默載體·TRV2- Δ Rep,利用電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，浸潤(rùn)番茄幼苗上部剛剛完全展開的葉片，從而使番茄獲得對(duì)TYLCV的抗性。采用本發(fā)明的方法，可以快速使番茄獲得對(duì)TYLCV的抗性，大大節(jié)約了傳統(tǒng)育種的成本。
[0005]本發(fā)明的有益效果是:這種方法可以快速使番茄獲得對(duì)TYLCV產(chǎn)生抗性，省去傳統(tǒng)育種多代雜交選育的過程，節(jié)省了勞動(dòng)力，降低成本。
四、【具體實(shí)施方式】:
[0006]1.病毒序列的選擇與克隆
[0007]根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的TYLCV基因組序列，利用生物信息學(xué)軟件(DNAStar，Madison，WI，USA)分析尋找其保守區(qū)段(Λ Rep)，設(shè)計(jì)引物，以TYLCV侵染的番茄葉片總DNA為模板，擴(kuò)增克隆目的保守片段(約350nts)。
[0008]2.病毒表達(dá)載體構(gòu)建
[0009]將該片段反向重復(fù)插入雙生病毒隨機(jī)序列兩側(cè)(約200nts)。再用限制性酶BamHI和EcoRI介導(dǎo)克隆至沉默載體TRV2中，構(gòu)建基于RNA干擾的表達(dá)hpRNA的植物沉默載體TRV2- Δ R印，利用電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105。
[0010]3病毒載體的接種[0011]將農(nóng)桿菌在平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落用液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)至OD值
0.6~1.0，利用注射器注射浸潤(rùn)番茄幼苗上部剛剛完全展開的葉片，番茄苗嶺控制在3~4片 真葉期。
【權(quán)利要求】
1.一種利用病毒載體誘導(dǎo)番爺抗TYLCV的方法,其特征在于:利用病毒載體表達(dá)病毒序列從而誘導(dǎo)番茄對(duì)TYLCV產(chǎn)生抗性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用病毒載體誘導(dǎo)番茄抗TYLCV的方法，其特征在于:所使用的病毒載體為TRV2，所表達(dá)的序列為TYLCV序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用病毒載體誘導(dǎo)番茄抗TYLCV的方法，其特征在于:構(gòu)建的載體利用電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌，再通過農(nóng)桿菌浸潤(rùn)番茄葉片將病毒載體導(dǎo)入番茄植株內(nèi)表達(dá)。·
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103849649SQ201210508803
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月3日
【發(fā)明者】張輝, 朱為民, 朱龍英, 萬延慧, 劉娜, 田守波 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 上?？茍@種子有限公司