專利名稱：利用透性化細胞β-半乳糖苷酶制備低聚半乳糖的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種低聚半乳糖的制備方法，特別是一種利用透性化細胞β -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖的方法，屬于酶制劑制備與功能性低聚糖生產領域。
背景技術：
隨著公眾飲食結構的變化，具有調節(jié)生理活性功能的食品——功能性食品需求量增大，其中功能性低聚糖尤其受到人們的青睞。我國于2007年啟動了 “國家公眾營養(yǎng)改善OLIGO (低聚糖)項目”，使功能性低聚糖的市場需求大幅增加。其中，低聚半乳糖因具有水溶性好、粘度低，對熱和酸穩(wěn)定等優(yōu)點，可用于提高食品色澤、風味、質地以及延長貨架期； 同時，低聚半乳糖還可增殖腸道內的雙歧桿菌，改善人體腸道菌群分布與脂質代謝，并可促進鈣、維生素吸收，提高人體免疫力，因此開發(fā)低成本制備低聚半乳糖的技術方法具有重要意義。目前，低聚半乳糖多以乳糖為底物，利用β-半乳糖苷酶的催化活性將乳糖水解生成的半乳糖基轉移至乳糖上而制得，其中β-半乳糖苷酶的提取純化是制約低聚半乳糖工業(yè)化生產的關鍵。β -半乳糖苷酶廣泛存在于動、植物和微生物中，已報道的產酶微生物包括細菌、霉菌和酵母菌等，其中酵母菌產酶的最適PH為中性，適于牛乳水解及治療乳糖不耐癥；但由于乳酸克魯維酵母產生的半乳糖苷酶為胞內酶，使得提取純化過程復雜、且難度大、效率低，因此利用游離β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的工藝成本較高。細胞膜具有選擇透過性，采用透性化技術處理細胞，可改變其通透性，同時保持細胞整體結構完整，并可保證胞內酶仍具有催化活性。滲透處理方法包括物理法(如滲透壓法、反復凍融法、熱休克法和超聲細胞破碎法)、化學法(如表面活性劑法、有機溶劑法和螯合劑法)以及生物化學法(如抗生素法和酶法)等。專利CN 1225389Α利用無水乙醇和氯仿，經過冷凍干燥處理得到透性化乳酸克魯維酵母細胞β -半乳糖苷酶，但制備過程中因使用氯仿，使產品不能直接用于食品行業(yè)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種利用透性化細胞β -半乳糖苷酶，操作簡便且低成本的制備低聚半乳糖的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種無毒性的透性化細胞β -半乳糖苷酶的制備方法，該透性化細胞半乳糖苷酶是由乳酸克魯維酵母經細胞滲透處理技術而獲得，能夠以乳糖為底物催化合成低聚半乳糖。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所選產半乳糖苷酶的菌株為乳酸克魯維酵母，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(北京)，菌種名稱乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis), CICC 編號1773。本發(fā)明的技術方案如下一種利用透性化細胞β_半乳糖苷酶制備低聚半乳糖的方法，其特征在于，向乳糖溶液中加入透性化細胞β -半乳糖苷酶，乳糖溶液濃度為10(T500g/L，透性化細胞β -半乳糖苷酶加入量為20(Tl500mg/g乳糖，30^450C，反應2 15h后，離心分離，得到的上清液即為低聚半乳糖溶液。本發(fā)明所述透性化細胞β -半乳糖苷酶的制備方法為由乳酸克魯維酵母經細胞滲透處理技術獲得，所用乳酸克魯維酵母購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種名稱乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)，CICC 編號1773。上述細胞滲透處理技術為向每克乳酸克魯維酵母細胞中加入5(T200mL的PBS緩沖液(50mmol/LpH 8. ONaH2PO4-Na2HPO4)制得懸浮細胞；再向其中加入無水乙醇，無水乙醇與懸浮細胞的體積比為2:5 1:1，于25°C下振蕩fl5min，離心后棄去上清液，所得沉淀經PBS緩沖液洗滌兩次后即得透性化細胞β -半乳糖苷酶。上述乳酸克魯維酵母的發(fā)酵條件為溫度28 30°C，搖床轉速10(T250rpm，接種量5 10% (v/v)，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8tT30h。
上述乳酸克魯維酵母發(fā)酵所用液體培養(yǎng)基組成與配制方法為酵母膏3. 0g，麥芽浸膏3. 0g，蛋白胨5. 0g，乳糖20. 0g，蒸餾水1. 0L, pH 7. 0,121°C高壓滅菌20min。本發(fā)明利用透性化乳酸克魯維酵母細胞β -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖，其有益效果在于(I)利用透性化細胞半乳糖苷酶制備低聚半乳糖，避免了胞內酶的提取純化過程，簡化了工藝操作，降低了生產成本。(2)透性化細胞中β -半乳糖苷酶所處環(huán)境仍為胞內環(huán)境，使其表現(xiàn)出比游離酶更高的催化合成低聚半乳糖的活性，更有利于發(fā)揮其催化功能。(3)本發(fā)明采用無水乙醇處理乳酸克魯維酵母制備透性化細胞，未引入氯仿等具有毒性的化學試劑，無食品安全問題，可廣泛應用于食品行業(yè)。(4)透性化細胞中β -半乳糖苷酶類似囊化固定化酶形式，易于從反應體系中分離回收，并可多次重復利用，可顯著降低低聚半乳糖的生產成本。


圖1透性化細胞β -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖色譜分析圖；圖2 (a)透性化細胞β -半乳糖苷酶最適pH曲線圖；圖2 (b)透性化細胞β -半乳糖苷酶最適溫度曲線圖；圖3乳酸克魯維酵母發(fā)酵時間對產β -半乳糖苷酶酶活的影響曲線圖。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不僅限于實施例。實施例中所用的無水乙醇、蛋白胨、酵母膏、麥芽糖等均為市售產品。乳酸克魯維酵母，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(北京)，菌種名稱乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis), CICC 編號1773。實施例中低聚半乳糖的含量及收率采用高效液相色譜檢測計算而得，色譜條件為示差檢測器，Aminex ΗΡΧ-87Η色譜柱，流動相為O. 05Μ H2SO4,流速O. 6mL/min,柱溫65°C，進樣量20 μ L。低聚半乳糖的含量通過標準糖樣品(葡萄糖、半乳糖、乳糖)的標準曲線計算得到。低聚半乳糖收率=低聚半乳糖實際生成量/低聚半乳糖理論生成量X 100%。以乳糖為底物，采用透性化細胞β-半乳糖苷酶催化乳糖制備的低聚半乳糖溶液經高效液相色譜檢測分析，包含有葡萄糖、半乳糖、轉移二糖、低聚半乳糖以及部分未被分解的乳糖，各組分的保留時間及出峰順序如圖1所示。實施例1:乳酸克魯維酵母透性化細胞的制備對乳酸克魯維酵母進行發(fā)酵實驗，培養(yǎng)基組成為酵母膏3.0g，麥芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸餾水L0L，pH 7.0，121°C高壓滅菌20min。發(fā)酵條件為28°C，搖床轉速lOOrpm，接種量5%(v/v)，培養(yǎng)8h，所得乳酸克魯維酵母發(fā)酵液的酶活約為1. OOU/mL。將發(fā)酵液在5000rpm、4°C下離心5min，沉淀經水洗后加入PBS緩沖液稀釋至50g/L，制得懸浮細胞。按無水乙醇與懸浮細胞稀釋液體積比為2:5加入無水乙醇,251€下震蕩處理lmin。在5000rpm、4°C下離心5min后,沉淀用PBS緩沖
液洗滌兩次，棄去上清液，取沉淀即可得到透性化細胞β -半乳糖苷酶，并用PBS緩沖液稀釋至20g/L。透性化細胞β-半乳糖苷酶制備低聚半乳糖取100mL100g/L乳糖溶液，按透性化細胞加入量為(200mg/g乳糖)加入100mL20g/L的透性化細胞溶液，在30° C、160rpm的水浴搖床中反應2h，取100 μ L酶解液稀釋20倍，在12000rpm下離心2min，上清液過0. 45 μ m水膜后進高效液相色譜檢測，得到低聚半乳糖含量為10g/L，收率為10%。實施例2 乳酸克魯維酵母透性化細胞的制備對乳酸克魯維酵母進行發(fā)酵實驗，培養(yǎng)基組成為酵母膏3.0g，麥芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸餾水L0L，pH 7.0，121°C高壓滅菌20min。發(fā)酵條件為30°C，搖床轉速160rpm，接種量8% (v/v)，培養(yǎng)12h，所得乳酸克魯維酵母發(fā)酵液的酶活約為7. 00U/mL。將發(fā)酵液在5000rpm、4°C下離心5min，沉淀經水洗后加入PBS緩沖液稀釋至50g/L，制得懸浮細胞。按無水乙醇與懸浮細胞稀釋液體積比為4:5加入無水乙醇,25°C下震蕩處理lOmin。在5000rpm、4°C下離心5min后,沉淀用PBS緩沖液洗滌兩次，棄去上清液，取沉淀即可得到透性化細胞β -半乳糖苷酶，并用PBS緩沖液稀釋至300g/L。透性化細胞半乳糖苷酶制備低聚半乳糖取100mL300g/L乳糖溶液，按透性化細胞加入量為(1000mg/g乳糖)加入100mL300g/L的透性化細胞溶液，在45° C、160rpm的水浴搖床中反應6h，取100 μ L酶解液稀釋20倍，在12000rpm下離心2min，上清液過0. 45 μ m水膜后進高效液相色譜檢測，得到低聚半乳糖的含量為54g/L，收率為18%。實施例3 乳酸克魯維酵母透性化細胞的制備對乳酸克魯維酵母進行發(fā)酵實驗，培養(yǎng)基組成為酵母膏3.0g，麥芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸餾水L0L，pH 7.0，121°C高壓滅菌20min。發(fā)酵條件為30°C，搖床轉速250rpm，接種量10% (v/v)，培養(yǎng)20h。所得乳酸克魯維酵母發(fā)酵液的酶活約為8. 69U/mL。將發(fā)酵液在5000rpm、4°C下離心5min，沉淀經水洗后加入PBS緩沖液稀釋至50g/L，制得懸浮細胞。按無水乙醇與懸浮細胞稀釋液體積比為1:1加入無水乙醇，25°C下震蕩處理15min。在5000rpm、4°C下離心5min后，沉淀用PBS緩沖液洗滌兩次，棄去上清液，取沉淀即可得到透性化細胞β -半乳糖苷酶，并用PBS緩沖液稀釋至125g/L。采用oNPG比色法測定透性化細胞β -半乳糖苷酶的酶活力。以最高酶活力為100%，各次測定的酶活力與最高酶活力之比為相對酶活。由圖2 (a) (b)可知，透性化細胞β_半乳糖苷酶的酶學性質最適反應pH為7. O 9. O,為中性和弱堿性酶；最適溫度為37° C，溫度高于50°C時基本檢測不到酶活，該酶可用于乳清和乳糖的水解。透性化細胞半乳糖苷酶制備低聚半乳糖取100mL500g/L乳糖溶液，按透性化細胞加入量為(250mg/g乳糖)加入100mL125g/L的透性化細胞溶液，在37° C、200rpm的水浴搖床中反應IOh，取100 μ L酶解液稀釋20倍，在12000rpm下離心2min，上清液過O. 45 μ m水膜后進高效液相色譜檢測，得到低聚半乳糖的含量為100g/L，收率為20%。實施例4 乳酸克魯維酵母透性化細胞的制備對乳酸克魯維酵母進行發(fā)酵實驗，培養(yǎng)基組成為酵母膏3.0g，麥芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸餾水L0L，pH 7.0，121°C高壓滅菌20min。發(fā)酵條件為:30°C，搖床轉速160rpm，接種量10% (v/v)，分別培養(yǎng)4、8、12、16、20、22、24、30h，采用oNPG比色法測定透性化細胞β _半乳糖苷酶的酶活力，如圖3所示，可知乳酸克魯維酵母的最佳發(fā)酵時間為20h，此時所得發(fā)酵液的酶活約為8. 69U/mL。將發(fā)酵液在5000rpm、4°C下離心5min,沉淀經水洗后加入PBS緩沖液稀釋至50g/L,制得懸浮細胞。按無水乙醇與懸浮細胞稀釋液體積比為1:1加入無水乙醇，25°C下震蕩處理lOmin。在5000rpm、4°C下離心5min后,沉淀用PBS緩沖液洗漆兩次,棄去上清液,取沉淀即可得到透性化細胞β -半乳糖苷酶，并用PBS緩沖液稀釋至150g/L。透性化細胞β -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖取100mL100g/L乳糖溶液，按透性化細胞加入量為(1500mg/g乳糖)加入100mL150g/L的透性化細胞溶液，在37° C、160rpm的水浴搖床中反應15h，取100 μ L酶解液稀釋20倍，在12000rpm下離心2min，上清液過0. 45 μ m水膜后進高效液相色譜檢測，得到低聚半乳糖的含量為14g/L，收率為14%。實施例5乳酸克魯維酵母透性化細胞的制備對乳酸克魯維酵母進行發(fā)酵實驗，培養(yǎng)基組成為酵母膏3.0g，麥芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸餾水L0L，pH 7.0，121°C高壓滅菌20min。發(fā)酵條件為30°C，搖床轉速160rpm，接種量10%(v/v)，培養(yǎng)20h，所得乳酸克魯維酵母發(fā)酵液的酶活約為8. 69U/mL。將發(fā)酵液在5000rpm、4°C下離心5min，沉淀經水洗后加入PBS緩沖液稀釋至50g/L，制得懸浮細胞。按無水乙醇與懸浮細胞稀釋液體積比為1:1加入無水乙醇，25°C下震蕩處理lOmin。在5000rpm、4°C下離心5min后，沉淀用PBS緩沖液洗滌兩次，棄去上清液，取沉淀即可得到透性化細胞β -半乳糖苷酶，并用PBS緩沖液稀釋至250g/L。透性化細胞β -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖取100mL200g/L乳糖溶液，按透性化細胞加入量為(1250mg/g乳糖)加入100mL250g/L的透性化細胞溶液，在37° C、200rpm的水浴搖床中反應2h，取100 μ L酶解液稀釋20倍，在12000rpm下離心2min，上清液過0. 45 μ m水膜后進高效液相色譜檢測，計算低聚半乳糖的收率；反應后的混合物離心(5000rpm, 5min,4°C )，棄去上清液，分離出透性化細胞β _半乳糖苷酶，在透性化細胞中再加入IOOmL 200g/L乳糖溶液，按上述條件反應，經色譜檢測分析、計算低聚半乳糖的收率；重復上述操作，直至無低聚半乳糖生成，可得到透性化細胞半乳糖苷酶的重復利用次數為3次。本發(fā)明公開了一種利用透性化細胞β -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖的方法。本領域技術人員可通過借鑒本發(fā)明內容，適當改變工藝參數，結構設計等環(huán)節(jié)實現(xiàn)。本發(fā)明通過較佳實施例子進行了描述，相關技術人員明顯能在不脫離本發(fā)明核心思想、范圍和內容下對本文有關的 流程進行適當改動或組合，來實現(xiàn)本發(fā)明技術，另外，所有類似的替換和改動對本技術領域人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明核心精神、范圍和內容中。
權利要求
1.一種利用透性化細胞3 -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖的方法，其特征在于，向乳糖溶液中加入透性化細胞P -半乳糖苷酶，乳糖溶液濃度為10(T500g/L，透性化細胞P -半乳糖苷酶加入量為20(Tl500mg/g乳糖，30^500C，反應2 15h后，經離心分離得到的上清液即為低聚半乳糖溶液。
2.如權利要求1所述的方法，其特征是透性化細胞￠-半乳糖苷酶的制備方法為乳酸克魯維酵母經細 胞滲透處理技術獲得，所用乳酸克魯維酵母，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種名稱乳酸克魯維酵母，CICC編號1773。
3.如權利要求2所述的方法，其特征是細胞滲透處理技術為向每克乳酸克魯維酵母細胞中加入5(T200mL的PBS緩沖液制得懸浮細胞；再向其中加入無水乙醇，無水乙醇與懸浮細胞的體積比為2: 5 1:1，于25°C下振蕩f 15min，離心后棄去上清液，所得沉淀經PBS緩沖液洗滌兩次后即得透性化細胞3-半乳糖苷酶。
4.如權利要求3所述方法，其特征是乳酸克魯維酵母的發(fā)酵條件為溫度28 3(TC，搖床轉速10(T250rpm，接種量為體積比5 10%，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h 30h。
5.如權利要求4所述方法，其特征是乳酸克魯維酵母發(fā)酵所用液體培養(yǎng)基為酵母膏·3. 0g，麥芽浸膏3. 0g，蛋白胨5. 0g，乳糖20. 0g，蒸餾水1. 0L,pH 7. 0，121°C高壓滅菌20min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用透性化細胞β-半乳糖苷酶制備低聚半乳糖的方法，向乳糖溶液中加入透性化細胞β-半乳糖苷酶，乳糖溶液濃度為100~500g/L，透性化細胞β-半乳糖苷酶加入量為200~1500mg/g乳糖，30~45℃，反應2~15h后，離心分離，得到的上清液即為低聚半乳糖溶液。利用透性化細胞β-半乳糖苷酶制備低聚半乳糖，避免了胞內酶的提取純化過程，簡化了工藝操作，降低了生產成本。采用無水乙醇處理乳酸克魯維酵母制備透性化細胞，未引入氯仿等具有毒性的化學試劑，無食品安全問題，可廣泛應用于食品行業(yè)。并可多次重復利用，可顯著降低低聚半乳糖的生產成本。
文檔編號C12N9/38GK102994589SQ20121051480
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權日2012年12月4日
發(fā)明者齊崴, 王夢凡, 何志敏, 張帥帥, 邢肖肖, 蘇榮欣 申請人:天津大學