專利名稱：適用于pcr的棉花基因組dna快速、批量制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于PCR的棉花基因組DNA快速、批量制備方法。
背景技術：
棉花是我國乃至世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟作物，目前我國是世界上最大的棉花生產(chǎn)國。近年來，隨著分子生物學技術與遺傳育種技術的不斷發(fā)展，一大批具有抗生物脅迫(抗蟲)和抗非生物脅迫(抗除草劑、抗旱)的基因成功轉入棉花。這些優(yōu)質的基因資源為作物豐產(chǎn)和減少環(huán)境污染做出了重大的貢獻。然而在培育新品種時，每一代轉基因棉花的大田檢測工作一直是困擾育種家和分子生物學研究者的一大難題。因為該環(huán)節(jié)工作量大，費時費力。經(jīng)常需要短時間內(nèi)從大田種植的幾千株甚至上萬株棉花中鑒定出轉基因陽性株。這就需要一種簡便、高效、快速的鑒定轉基因大田試驗材料的分子生物學方法。而且，根據(jù)我國轉基因農(nóng)作物安全性申報的要求，轉基因棉花安全性申報也需要進行分子生物學檢測。目前對轉基因作物的檢測方法可分為蛋白檢測方法和核酸檢測方法，而核酸檢測方法中的聚合酶鏈式反應(PCR)技術由于其高靈敏度、高特異性、操作簡便已經(jīng)成為轉基因植物及其產(chǎn)品檢測的主要方法。
進行PCR檢測的前提是快速大量的提取棉花的基因組DNA。目前，對于小麥、玉米、 水稻、大豆和油菜等均已建立起高效快速提取基因組DNA的技術。但對于棉花來說，由于棉花富含棉酚、多糖、單寧等次生代謝產(chǎn)物，該類物質在細胞破碎時極易氧化，并能與核酸和蛋白結合形成復合物，影響高質量棉花DNA的提取，進而影響后續(xù)PCR、酶切等一系列分子生物學操作。比如傳統(tǒng)的CTAB法利用高鹽溶液沉淀蛋白和酸性多糖，低鹽溶液沉淀核酸的原理去除蛋白和糖類物質，但這樣便增加了加入不同濃度NaCl并抽提、離心將其去除的操作，同時為了提高得率往往需要長時間的沉淀、冰浴等步驟。而SDS法以及基于該法改進的各種方法則利用SDS充分裂解細胞釋放核酸物質，并用氯仿異戊醇反復抽提的方法來純化DNA，但是該法對棉花這種富含次級代謝產(chǎn)物的物種來說提取效率很低。很多改進的 SDS法加入抗氧化物質來抑制酚類物質的氧化以提高產(chǎn)率，但效果并不理想。有學者提出 CTAB-SDS結合的改良方法提取棉花基因組DNA，雖然得到了大量的高質量的基因組DNA，但仍步驟復雜、耗時較長，不適于轉基因棉花的快速PCR檢測。另外，以往的取材方法多為取功能葉后包入紙袋或塑料袋中帶回實驗室，然后直接放入冰箱冷凍直至使用。這樣的取材方法增加了材料在離體、運輸、實驗前裝管編號等環(huán)節(jié)的操作時間以及樣品反復凍融的次數(shù)，導致DNA降解，進一步增加了棉花高質量基因組DNA提取的難度。
PCR技術可以實現(xiàn)在體外對目標DNA進行上百萬次的擴增，因此是目前最準確的檢測轉基因作物及其產(chǎn)品的方法之一。該技術對模板DNA的純度要求并不是十分嚴格，而且需要的量也并不是很多。因此，能夠找到一種快速提取并能滿足PCR擴增需求的棉花基因組DNA的方法是解決轉基因棉花育種中陽性株檢測工作量大問題的關鍵。發(fā)明內(nèi)容3
本發(fā)明目的在于，提供一種適用于PCR的棉花基因組DNA快速、批量制備方法， 該方法將棉花植株頂部的幼嫩葉片裝入離心管中，加入提取液和鋼珠，對樣品進行破碎處理，然后水浴，加抽提液抽提，用異丙醇沉淀DNA，再用乙醇洗一遍，沉淀溶于水即為提取的 DNA。本發(fā)明解決了棉花基因組DNA提取步驟復雜、耗時耗力的問題，提供了一種能夠快速、 批量的提取滿足PCR檢測需求的DNA的方法，采用該方法能夠從棉花葉片中高效、快速、簡便的提取滿足PCR檢測的模板DNA，能夠應用于轉基因棉花育種和安全性申報等環(huán)節(jié)中的分子生物學檢測。
本發(fā)明所述的適用于PCR的棉花基因組DNA快速、批量制備方法，按下列步驟進
a、取健康的棉花葉片0.05-0. 15g放入2mL離心管內(nèi)，加入600 μ L的提取液為 NaCl、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、聚乙烯聚吡咯烷酮、β -巰基乙醇和RNase A的混合物，并加入兩粒鋼珠；
b、將步驟a裝有樣品的離心管放入細胞破碎儀內(nèi)，于30HZ的頻率破碎5min處理， 將處理后的離心管放入溫度65°C水浴鍋中水浴IOmin ；
C、取出離心管，在室溫下加入700 μ L氯仿異戊醇的抽提液抽提一次，7000rpm離心 6min,
d、吸上清于新的離心管中，加等體積的異丙醇混勻，室溫放置lOmin，12000rpm離心6min,棄上清,得到DNA粗提沉淀；
e、將所得DNA粗提沉淀用ImL體積濃度為75%的乙醇洗滌，12000rpm離心3min， 棄上清液，得到DNA沉淀，再加60 μ L滅菌雙蒸水，溫度_20°C保存即可。
步驟a中所述的提取液為NaCl 500mmol/L、三羥甲基氨基甲烷50mmol/L，pH=8. O、 十二烷基硫酸鈉2%、聚乙烯聚吡咯烷酮6%、β -巰基乙醇1%和終濃度為20 μ g/mL的RNase A的混合物。
步驟a中鋼珠的粒徑為4_6mm。
步驟a中的棉花葉為從大田棉花植株頂部取幼嫩葉片裝入2mL離心管投入液氮罐中帶回實驗室儲存于-80°C冰箱，或從任何室內(nèi)栽培的棉花植株上取幼嫩葉片裝入2mL離心管投入液氮中并存于-80°C冰箱。
步驟C中抽提液體積比氯仿異戊醇=24:1。
本發(fā)明所述的適用于PCR的棉花基因組DNA快速、批量制備方法，該方法中的提取液中β_巰基乙醇屬于易揮發(fā)成分，該成分能夠阻止酚類物質的褐化，所以在使用前根據(jù)葉片的老幼程度加入占混合液體積比1%_3%的用量。本發(fā)明的基本原理為提取液中聚乙烯聚吡咯烷酮(PVP)和β -巰基乙醇，能有效的去除多酚；十二烷基硫酸鈉(SDS)能夠溶解細胞膜上的脂質與蛋白，分離核酸和蛋白；氯仿抽提能夠去除大部分的色素、蛋白、酚類、多糖等物質。DNA的沉淀只采用異丙醇，DNA的洗滌采用60%-80%的乙醇。與其他DNA提取的方法相比，本發(fā)明所得DNA可于溫度-20°C長期保存?zhèn)溆靡部芍苯邮褂谩?br> 利用本發(fā)明在提取棉花基因組總DNA的實施例中均獲得了大量的DNA，提取的DNA 顏色為嫩黃色至淺褐色(依葉片的老幼程度)。經(jīng)核酸分析儀檢測，0D260/280均在I. 7-2. O 之間，光吸收曲線均表現(xiàn)較好的峰值，提取的DNA含有輕微的蛋白和雜質的污染。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳上檢測表明，該方法提取的棉花總DNA有清晰主帶，同時將所提DNA經(jīng)PCR檢測，均得到清晰、大小正確的擴增條帶；說明該方法提取的DNA能夠滿足PCR檢測的要求。
本發(fā)明所述方法與現(xiàn)有的棉花DNA提取方法相比，具有如下優(yōu)點
快速、簡便本發(fā)明利用機械方法破碎細胞，一次破碎48份樣品，15min內(nèi)即可完成96份樣品的破碎。與傳統(tǒng)的CTAB、SDS法相比，步驟簡單，可在2小時內(nèi)完成96份樣品的提取，一人一天可提取400份樣品,而傳統(tǒng)方法完成96份樣品的提取一般都在5-6小時；
成本低本發(fā)明減少了以往棉花提取過程中繁瑣的去雜步驟，減少了試劑的使用種類，僅采用提取液、氯仿異戊醇、異丙醇和乙醇等幾種試劑就可以完成全部的步驟；
DNA得率高0.05g棉花葉片采用本方法可獲得濃度為60_100yg DNA，可做 500-700次PCR擴增的模板；
DNA質量符合PCR檢測的需求以本發(fā)明所述方法提取的棉花DNA為模板進行PCR 擴增，均得到清晰、大小正確的擴增條帶；
所需材料少，取材范圍廣本發(fā)明對棉花生長周期中幼苗期、開花期和結鈴期的頂端幼嫩葉片以及植株中部的功能葉均適用，但對處于生長后期的老葉和植株底部的衰老葉片提取效果不如幼嫩葉片的好；
提供了一種適合大田樣品采樣、運輸和儲存的方法取棉花植株頂部的幼嫩葉片裝入2mL離心管，投入液氮罐帶回實驗室，儲存于-80°C冰箱中。檢測時直接取出離心管使用，避免了以往采集裝袋、運輸和實驗前分裝管對材料的反復凍融；
本發(fā)明所述方法獲得的DNA同傳統(tǒng)方法獲得的DNA —樣，可稀釋短期使用也可長期儲存。


圖I為本發(fā)明中提取棉花基因組總DNA的電泳圖，其中M，DL2000DNA marker ;泳道1-3為對照I所得的勻漿上清中DNA ;泳道4-6為對照2所得抽提液中DNA ;泳道7_9為本發(fā)明所得DNA ;泳道10-12為對照3提取的DNA ；
圖2為本發(fā)明提取的DNA和由對照3提取的DNA，經(jīng)核酸分析儀測定得出的含量對比圖，其中1-5為隨機挑選的5份樣品的測定值；1為本發(fā)明所得核酸含量，2為對照3所得核酸含量；
圖3為本發(fā)明提取轉ScALDH基因棉花與受體株的DNA經(jīng)PCR擴增后實施的效果圖，其中M，DL2000 DNA marker ;泳道I為質粒陽性對照；泳道2_5為對照I提取的DNA為模板的PCR結果；泳道6-9為對照2提取的DNA為模板的PCR結果；泳道10-13為本發(fā)明提取的DNA為模板的PCR結果；泳道14-17為對照3提取的DNA為模板的PCR結果，其中5、9、13、17為受體轉基因陰性株；
圖4為本發(fā)明提取轉EsDREB基因棉花與受體株的DNA經(jīng)PCR擴增后實施的效果圖，其中M，DL2000 DNA marker ;泳道I為質粒陽性對照；泳道2_5為對照I提取的DNA為模板的PCR結果；泳道6-9為對照2提取的DNA為模板的PCR結果；泳道10-13為本發(fā)明提取的DNA為模板的PCR結果；泳道14-17為對照3提取的DNA為模板的PCR結果，其中5、9、13、17為受體轉基因陰性株；
圖5為本發(fā)明提取轉TcLEA基因棉花與受體株的DNA經(jīng)PCR擴增后實施的效果圖， 其中M，DL2000 DNA marker ;泳道I為質粒陽性對照；泳道2_5為對照I提取的DNA為模板的PCR結果；泳道6-9為對照2提取的DNA為模板的PCR結果；泳道10-13為本發(fā)明提取的 DNA為模板的PCR結果；泳道14-17為對照3提取的DNA為模板的PCR結果，其中5、9、13、 17為受體轉基因陰性株。
具體實施方式
實施例I (本發(fā)明所述方法)
樣品的采集棉花葉為從大田棉花植株頂部取幼嫩葉片裝入2mL離心管投入液氮罐中帶回實驗室儲存于-80°C冰箱，或從任何室內(nèi)栽培的棉花新鮮采集的材料；取 O. 05-0. 15g本實驗室大田種植并由卡那霉素檢測陽性的轉ScALDH基因(1450bp)、EsDREB 基因(750bp)、TcLEA基因(310bp)棉花株系和對照株系幼嫩葉片放入2mL離心管(生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn))，立即投入液氮罐中帶回實驗室儲存于溫度-80°C冰箱；
轉基因棉花基因組DNA的提取
取健康儲存的棉花葉片放入2mL離心管內(nèi)，加入600 μ L的提取液為NaCl 500mmol/L、三羥甲基氨基甲烷50mmol/L，pH=8. O、十二烷基硫酸鈉2%和聚乙烯聚吡咯烷酮 6%、β -巰基乙醇1%和終濃度為20 μ g/mL的RNase A的混合物，并加入兩粒鋼珠(細胞破碎儀自帶)，粒徑為4-6mm ；
將裝有樣品的離心管放入細胞破碎儀內(nèi)，于30HZ的頻率破碎5min處理，將處理后的離心管放入溫度65°C水浴鍋中水浴IOmin ；
取出離心管，在室溫下加入700 μ L體積比氯仿異戊醇=24:1的抽提液抽提一次，7000rpm 離心 6min ；
吸上清于新的離心管中，加等體積的異丙醇混勻，室溫放置lOmin，12000rpm離心 6min，棄上清，得到DNA粗提沉淀，在吸上清時盡量輕柔，不要觸動蛋白層，避免吸到雜質；
將所得DNA粗提沉淀用ImL體積濃度為75%的乙醇洗滌，12000rpm離心3min，棄上清液得沉淀，倒置離心管于通風處，晾干，附著于管壁底部的沉淀為DNA，再加60 μ L滅菌雙蒸水，溫度-20°C保存即可；
提取DNA的PCR檢測
將實施例I所述方法提取的DNA為模板，以陽性質粒為陽性對照，進行PCR擴增反應。所用引物分別為
ScALDH (DL-f : 5 ’ CCATGACGGGGGAAGTGAAGGAGTATC3，和 DL_r : 5’ CTAGGGACTCCCACGTTGCGCATG3’ )，EsDREB(DL_f:5’ TTC TTCCTC AAATGCCTTCTGG3’ 和
DL-r:5，ATGCAAAACTTACATCAAGACAATG3，)TcLEA(DL-f:5，CAGAGAGAGAAAGAGAGAGCG G T3’ 和 DL-r:5’ CTTGTTCGCATTGCTGGTAGTCA3’ )。擴增體系及反應體系如下
權利要求
1.一種適用于PCR的棉花基因組DNA快速、批量制備方法，其特征在于按下列步驟進行 a、取健康的棉花葉片O.05-0. 15g放入2mL離心管內(nèi)，加入600 μ L的提取液為NaCl、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、聚乙烯聚吡咯烷酮、β -巰基乙醇和RNase A的混合物，并加入兩粒鋼珠； b、將步驟a裝有樣品的離心管放入細胞破碎儀內(nèi)，于30HZ的頻率破碎5min處理，將處理后的離心管放入溫度65°C水浴鍋中水浴IOmin ； C、取出離心管，在室溫下加入700 μ L氯仿異戊醇的抽提液抽提一次，7000rpm離心6min， d、吸上清于新的離心管中，加等體積的異丙醇混勻，室溫放置lOmin，12000rpm離心6min,棄上清,得到DNA粗提沉淀； e、將所得DNA粗提沉淀用ImL體積濃度為75%的乙醇洗滌，12000rpm離心3min，棄上清液，得到DNA沉淀，再加60 μ L滅菌雙蒸水，溫度_20°C保存即可。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于步驟a中所述的提取液為NaCl500mmol/L、三羥甲基氨基甲烷50mmol/L，pH=8. O、十二烷基硫酸鈉2%、聚乙烯聚吡咯烷酮6%、β -巰基乙醇1%和終濃度為20 μ g/mL的RNase A的混合物。
3.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于步驟a中鋼珠的粒徑為4-6mm。
4.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于步驟a中的棉花葉為從大田棉花植株頂部取幼嫩葉片裝入2mL離心管投入液氮罐中帶回實驗室儲存于-80°C冰箱，或從任何室內(nèi)栽培的棉花植株上取幼嫩葉片裝入2mL離心管投入液氮中并存于_80°C冰箱。
5.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于步驟c中抽提液體積比氯仿異戊醇=24:I0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適用于PCR的棉花基因組DNA快速、批量制備方法，涉及作物育種領域轉基因作物的分子檢測。該方法是由取棉花植株頂部的幼嫩葉片裝入離心管中，加入提取液和鋼珠，對樣品進行破碎處理，然后水浴，加抽提液抽提，用異丙醇沉淀DNA，再用乙醇洗滌，沉淀溶于水即為提取的DNA。本發(fā)明解決了棉花基因組DNA提取步驟復雜、耗時耗力的問題，提供了一種能夠快速、批量的提取滿足PCR檢測需求的DNA的方法，能夠應用于轉基因棉花育種和安全性申報等環(huán)節(jié)中的分子生物學檢測。
文檔編號C12N15/10GK102925430SQ20121051482
公開日2013年2月13日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權日2012年12月5日
發(fā)明者張道遠, 李小雙, 李海燕 申請人:中國科學院新疆生態(tài)與地理研究所