專利名稱：一種低磷脅迫反應調(diào)控因子ZmPHR1、編碼該蛋白的基因及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程技術領域，涉及一種低磷脅迫反應調(diào)控因子ZmPHRl、編碼該蛋白的基因及應用。
背景技術：
土壤中磷素的缺乏是一個世界性的問題，在30-40%的可耕地中磷的濃度僅有I
10PM，這么低的磷含量不能滿足植物生長和發(fā)育的需要。通常人們通過施用磷肥來保證植物正常的生長和獲得較高的作物產(chǎn)量，然而，即使有充足的磷肥供應，大部分磷肥也會與堿性土壤中的鈣離子或酸性土壤中的鋁離子和鐵離子形成不可溶的化合物，或者與微生物作 用形成有機物質(zhì)，僅有20%左右的磷素被植物吸收利用；此外，土壤中的部分無機磷通過雨水沖洗或徑流進入地下水中，導致土體富營養(yǎng)化，而且這種情況越來越成為一個全球化的環(huán)境問題。加之，長年過多的施用無機磷肥對不可再生的磷礦資源也是一種消耗和浪費，最終導致提高了作物的產(chǎn)量成本。為了解決作物磷利用率低的問題，有必要對缺磷條件下的磷利用調(diào)控機制進行認識和了解，從而采用分子育種方法改善作物的這一性狀。在缺磷條件下，植物已經(jīng)形成了一系列的適應機制。已有報道，在擬南芥中有29%的轉(zhuǎn)錄因子與磷饑餓反應有關。轉(zhuǎn)錄因子諸如WRKY75、ZAT6、MYB62、BHLH32、AtPHRl和PHR1-LIKE1是不同植物中調(diào)控磷素動態(tài)平衡的主要調(diào)控子。其中，屬于MYB-CC家族一員的AtPHRl是擬南芥中第一個在轉(zhuǎn)錄水平上被證明對磷饑餓起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子它以二聚體的形式與一系列磷饑餓響應基因啟動子區(qū)域的一段不完全回文序列(P1BS，GNATATNC)結(jié)合，從而調(diào)控相應基因的表達(Rubio et al. 2001; Franco-ZorriIIaet al. 2007;Nilsson et al. 2007)。將AtPHRl進行轉(zhuǎn)基因研究，結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)化后的野生型株系和突變體株系中無機磷的含量均得到了顯著提高(Bari et al. 2006; Nilsson et al.2007)，說明AtPHRl在提高磷的利用方面起到作用。近年來，從水稻中分離出的0sPHR2與AtPHRl有些類似，過量表達0sPHR2的株系中，幾個磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達均得到了上調(diào)，認為與莖中磷含量的提高呈正相關，從而推測0sPHR2在提高水稻磷利用效率方面也起到調(diào)節(jié)作用(Zhou et al. 2008)。玉米是世界上最重要的栽培作物和經(jīng)濟作物，大部分都生長于酸性和堿性土壤，由于磷肥很容易被土壤顆粒所吸附，導致形成不可溶性的磷化合物，影響到玉米正常生長及獲得較高產(chǎn)量。有研究表明，玉米不同的種質(zhì)材料對磷的利用效率存在基因型差異，通過溫室和田間試驗的磷利用效率篩選研究，只有極少部分自交系被認為屬磷高效利用基因型。而磷的高效利用屬于數(shù)量性狀，受多基因控制，轉(zhuǎn)錄因子的導入，將能調(diào)控下游一系列磷利用相關功能基因的表達，對提高作物磷利用效率是一種切實可行的方法(Century etal. 2008)。然而，到目前為止，在玉米中，尚未有與PHRl相似的轉(zhuǎn)錄因子的報道。本發(fā)明通過對玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPHRl的分離、序列分析和異源功能驗證等研究證明，在擬南芥中過量表達ZmPHRl，調(diào)控了一系列磷誘導基因和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達，從而使植株對磷脅迫的敏感性得到了緩解，改善和提高了低磷條件下植株的長勢和莖葉中磷的含量，從而為育種工作者通過遺傳工程手段提高磷利用效率提供了物質(zhì)基礎。

發(fā)明內(nèi)容
為了采用分子育種方法改善作物磷利用率低的問題，本發(fā)明提供了一種低磷脅迫反應調(diào)控因子ZmPHRl、編碼該蛋白的基因及應用。本發(fā)明是采用如下技術手段實現(xiàn)的
一種玉米低磷脅迫反應調(diào)控因子ZmPHRl，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或者幾個氨基酸 所形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼上述調(diào)控因子ZmPHRl的基因，所述基因的序列含有SEQ IDNO :1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了含有上述基因的植物表達載體。所述的植物表達載體，包括
(1)植物表達載體為pJIT163-ZmPHRl:: GFP，及其在構建過程中生成的各種中間載體，是將所述基因插入PJIT163 GFP的Sal I和BamH I酶切位點之間得到的；
(2)植物表達載體為pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP，及其在構建過程中生成的各種中間載體，是將限制性內(nèi)切酶KpnI和Xho I雙酶切重組質(zhì)粒甲得到的小片段和限制性內(nèi)切酶KpnI和SalI雙酶切pCAMBIA1300得到的大片段連接得到的。本發(fā)明還提供了一種農(nóng)桿菌菌株，是將含有植物表達載體pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP的重組質(zhì)粒通過凍融法導入農(nóng)桿菌菌株GV3101獲得的。本發(fā)明還提供了過量表達的轉(zhuǎn)基因純合株系，是通過將含有植物表達載體pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP的農(nóng)桿菌菌液點滴法導入擬南芥中獲得的。本發(fā)明擴增所述基因的全長或其任意片段的引物對，所述引物序列如下
引物對I
正向引物5' - AAGCAAGGTAATGAAATG -3'；
反向引物5' - TGAATAGTGCAACCGATA -3'。引物對2
正向引物5' -CACCCTTTATTTCTCAGTCATCCAA -3'
反向引物5' -TCATTTTGTGTAGCACTCTCATCAG -3'
本發(fā)明還進一步提供了上述基因在植物育種中的應用。在低磷條件下，轉(zhuǎn)ZmPHRl基因株系的含磷量極顯著高于野生型植株，ZmPHRl過表達后增加了轉(zhuǎn)基因植株對磷的吸收，從而可改善植株的磷營養(yǎng)狀況，使得植株的株高，生物量與野生型植株相比均得到明顯增加，根冠比與野生型植株相比均得到明顯減小，如圖5所示。由于過表達ZmPHRl可增加植物的吸磷能力，因而在同樣的土壤肥力的條件下，特別是低磷條件下，ZmPHRl轉(zhuǎn)基因植株可以少施肥，減少土壤環(huán)境污染，節(jié)約資源。本發(fā)明的基因及其編碼蛋白在作物中，特別是玉米、小麥和水稻等糧食和經(jīng)濟作物的品種改良中將發(fā)揮重要的作用，應用前景廣闊。


圖1 pJIT163-ZmPHRl GFP 的結(jié)構示意 圖 2 pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP 的結(jié)構示意 圖3轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系；
圖4轉(zhuǎn)基因株系PCR檢測結(jié)果；
圖5轉(zhuǎn)基因株系RT-PCR檢測結(jié)果；
圖6轉(zhuǎn)基因擬南芥植株GFP熒光顯示結(jié)果；
圖7轉(zhuǎn)基因擬南芥植株根系中GFP熒光顯示結(jié)果； 圖8過量表達株系的獲得；
圖9 ZmPHRl過量表達株系和野生型株系在高磷(ImM Pi)和低磷(IOyM Pi)條件下的生長情況；
圖10 ZmPHRl過量表達株系和野生型株系，在高磷(ImM Pi)和低磷(0. OlmM Pi)條件下植株根系和地上部的磷含量；
圖11 ZmPHRl過量表達株系和野生型株系，在高磷(ImM Pi)和低磷(0. OlmM Pi)條件下憐響應基因的表達；
圖12 ZmPHRl過量表達株系和野生型株系，在高磷(ImM Pi)和低磷(0. OlmM Pi)條件下磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達。
具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，材料，如無特殊說明，均為常規(guī)方法和自常規(guī)生化試劑商店購買得到的，其中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。Tl代表示TO代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T2代表示Tl代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T3代表示T2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株。玉米材料478 :為山西農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心育種室保存。pJIT163-GFP載體中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所贈得。質(zhì)粒PCAMBIA1300 :從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所贈得。農(nóng)桿菌GV3101 :從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所贈得。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所贈得。實施I ZmPHRl蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)及克隆
根據(jù)擬南芥的AtPHRl (At4g28610)的氨基酸序列，搜查TIGR (The Institute ofGenomic Research Database-TDB)玉米數(shù)據(jù)庫(http://maize. jcv1. org),根據(jù)同源性、預測氨基酸序列的長度和結(jié)構域，獲得可能編碼PHRl基因的合并序列TC346249，共計13個玉米EST。以TC346249為模板，設計PCR引物序列如下
正向引物5' - AAGCAAGGTAATGAAATG -3'；
反向引物5' - TGAATAGTGCAACCGATA -3'。用Invitrogen公司的Trizol試劑提取玉米自交系478的總RNA,DNaseI (RNase-free)處理后,取4iig用Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，用其作為模板進行PCR擴增，
PCR反應體系超純水39.5 ii LUOXPCR buffer 5 y L，模板2 y L，濃度為IOy M的正、反向引物各 I U L, EX-TaqDNA 酶(5u/ u L)0. 5u L, dNTPs (IOmM) I u L。PCR 反應條件94°C 4min ；94°C 30sec, 53/60°C 30sec,72°C lmin30sec, 35 個循環(huán)-,1 TC IOmin ;4°C保溫。得到PCR擴增產(chǎn)物，參照北京鼎國生物技術有限責任公司產(chǎn)品DNA片段快速純化/回收試劑盒純化PCR擴增產(chǎn)物，與pMD18-T載體在16°C下過夜連接，獲得重組質(zhì)粒pMD18-ZmPHRl，使用熱擊法將重組質(zhì)粒pMD18- ZmPHRl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，轉(zhuǎn)化物在含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上生長，挑選陽性克隆。從陽性克隆中提取質(zhì)粒，進行測序。測序后獲得I個完整的0RF，即序列表中SEQ ID NO 2氨基酸序列，推測由449個氨基酸殘基組成的多肽，該蛋白命名為ZmPHRl，含有典型的MYB和Coiled-coil結(jié)構域。 將ZmPHRl蛋白的編碼基因命名為ZmPHRl基因，其開放閱讀框核酸序列如SEQ ID N0:1所示，為1350bp (含有終止密碼子)。實施2植物表達載體的構建1. pJIT163-ZmPHRl :: GFP表達載體的構建 具體步驟如下
(I)在重組質(zhì)粒pMD18- ZmPHRl的基因兩端引入SalI和BclI位點(BclI為BamH I的同尾酶)
PCR引物
正向引物5’ - GC gtcgac ATGAGGAAGITTAATC-3’
反向引物5’ - GCG tgatca ACTATCTTGCAGTTT-3，
PCR反應體系超純水39.5 ii L、10 XPCR buffer 5 y L，模板2 y L，濃度為IOy M的正、反向引物各 I U L, EX-TaqDNA 酶(5u/ u L)0. 5u L, dNTPs (IOmM) I u L。PCR 反應條件94°C 4min ；94°C 30sec,60°C 30sec,72°C lmin30sec, 35 個循環(huán)-,1 TC IOmin ;4°C保溫。(2)將重組質(zhì)粒pMD18- ZmPHRl用限制性內(nèi)切酶Sail和BclI進行雙酶切，回收帶有酶切位點的基因片段。(3)用限制性內(nèi)切酶Sal I和BamH I雙酶切重組質(zhì)粒pJIT163_GFP，回收載體骨架。(4)將步驟(2)回收的片段和步驟(3)回收的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒PJIT163- ZmPHRl GFP ;序列表的SEQ ID NO 1自5’末端第I至1347位核苷酸所示的ZmPHRl基因插入pJIT163-GFP的雙35S啟動子和GFP基因之間的SalI和BamH I酶切位點之間，見圖1。2. pCAMBIA1300_ZmPHRl : : GFP 表達載體的構建 具體步驟如下
(I)用限制性內(nèi)切酶KpnI和Xho I雙酶切重組質(zhì)粒甲(PJIT163- ZmPHRl :: GFP)，回收約3.6kb左右的片段(含有35S啟動子、ZmPHRl基因、GFP基因和終止子)。(2)用限制性內(nèi)切酶KpnI和Sal I雙酶切質(zhì)粒pCMBIA1300，回收載體骨架。(3)將步驟(I)回收的片段和步驟(2)回收的載體骨架連接(Xho I與Sal I是同尾酶)，得到重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP，其結(jié)構示意圖見圖2。實施3轉(zhuǎn)基因株系的獲得1、重組農(nóng)桿菌菌株的獲得
將重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP利用凍融法導入農(nóng)桿菌菌株GV3101，獲得含ZmPHRl基因的重組農(nóng)桿菌。2、轉(zhuǎn)基因植株的獲得
(1)用重組農(nóng)桿菌菌液通過點滴法轉(zhuǎn)化哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。得到TO代種子；
(2)用潮霉素(50mg/L)篩選2代；
(3)將陽性T2代植株在含抗生素(50mg/L潮霉素)的MS平板上發(fā)芽，2-3周后觀察抗性反應情況，沒有陽性與陰性分離的株系為轉(zhuǎn)ZmPHRl純合株系，即T3代(見圖3)。
3、轉(zhuǎn)基因純合株系的鑒定
T3代植株經(jīng)PCR和RT-PCR檢測，獲得8個在DNA水平和RNA水平上表達ZmPHRl的陽性株系(圖4，圖5)。利用活體成像系統(tǒng)，在轉(zhuǎn)基因純合株系中觀察到GFP熒光(圖6)，利用共聚焦熒光顯微鏡在轉(zhuǎn)基因純合系的根尖分生組織細胞核中觀察GFP熒光(圖7)。
實施4過量表達轉(zhuǎn)基因株系的獲得1、高磷處理
分別將生長狀況相同的一個T3代株系幼苗30株和野生型幼苗置于23°C光照培養(yǎng)箱中進行高磷培養(yǎng)液培養(yǎng)(3天換一次營養(yǎng)液)。營養(yǎng)液為2 mM Ca(NO3)2, 0.65 mM MgSO4,25 uM Fe-EDTA, 5 uM MnSO4, 50 u M KCl, 2 u M ZnSO4, 0. 5 u M CuSO4, 0.005 u M(NH4)6Mo24 和 25 mM H3B04。ImM KH2P04。2、ZmPHRl基因表達量在轉(zhuǎn)基因株系中的檢測
提取高磷處理的擬南芥地上部的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA ; WcDNA為模板進行Real-timePCR擴增。擴增ZmPHRl基因的引物如下
正向引物5’ -CACCCTTTAITTCTCAGTCATCCAA-3’
反向引物5’ -TCATTTTGTGTAGCACTCTCATCAG-3，
以進行相同處理后過量表達植株中ZmPHRl基因的表達量為1，則可以看出過量表達株系與野生型株系的相對表達量比較，見圖8。在高磷處理條件下ZmPHRl基因的表達量高于野生型植株。Tl株系的ZmPHRl的表達量較野生型株系高13. 06倍，從而獲得了過量表達ZmPHRl的轉(zhuǎn)基因純合株系(圖8)。實施5 ZmPHRl基因功能驗證1、不同磷處理水平
基礎培養(yǎng)液組成如下2 mM Ca (NO3) 2) 0. 65 mM MgSO4, 25 u M Fe-EDTA, 5 uMMnSO4, 50 uM KCl, 2 uM ZnSO4, 0. 5 u M CuSO4, 0.005 u M (NH4)6Mo24 和 25 mMH3B04。高磷培養(yǎng)液中，KH2P04濃度為ImM。低磷培養(yǎng)液組成如下為了使營養(yǎng)液中的K離子濃度保持一致，再補充0. 99 mM KCl，其它同完全培養(yǎng)液；低磷培養(yǎng)液中，KH2P04濃度為0.Olmmol/L。
分別將生長狀況相同的一個T3代株系幼苗60株和野生型幼苗(WT)60株置于23°C光照培養(yǎng)箱中進行水培(高磷營養(yǎng)液，3天換一次營養(yǎng)液)，培養(yǎng)4-5周后,30株改用低磷培養(yǎng)液培養(yǎng)7天，30株繼續(xù)用高磷培養(yǎng)液培養(yǎng)(3天更換一次)，然后觀察拍照并測定植株干物質(zhì)量、植物地上部(葉和莖)和根的全磷含量和有效磷含量。2、過量表達株系的形態(tài)及生長狀況
相比高磷處理，過量表達株系和野生型株系的長勢在低磷條件下均受到不同程度的抑制(圖9)。過量表達株系的植株冠部大小和干物質(zhì)量均高于野生型(表1)，而且在低磷條件下更明顯。在低磷條件下，過量表達株系的根冠比明顯低于野生型。說明過量表達株系對低磷脅迫的敏感性減小，抵抗力增強，即過量表達植株有低磷條件下長勢好于野生型(圖9)。表I過量表達株系和野生型株系在不同 磷水平條件下的植株干重、根冠比和全磷含量
3、全磷和有效磷含量分析
3.1有效磷測定，利用鑰銻抗比色法進行。(I)試劑配制
I)配制IOOml 2%的冰醋酸水溶液(體積比)(提取劑)。2)配制硫酸-鑰酸銨溶液(溶液A):即0. 5N H2S04中含有0. 4%(ff/V)的鑰酸銨
①溶解0.8g鑰酸銨((NH4) 6M07024 4H20于IOOml蒸餾水中；
②然后徐徐加入5ml的濃H2S04(98%)；
③充分混勻，冷卻后加水至200ml
3)配制10%(W/V)的抗壞血酸溶液(溶液B)
溶解2g抗壞血酸于水中，最后加水至20ml，貯于棕色瓶中，在4°C冰箱保存(最好現(xiàn)配現(xiàn)用)。4) IOOml 0. 5%酒石酸銻鉀溶液 IOOmlA液中加入0. 5%酒石酸銻鉀溶液10ml。5)工作溶液按體積比6:1混合液A和溶液B.注工作溶液需要每天配制，配制好后放置2小時后再使用。(2)操作步驟
I)稱取適量(約0.1g)地上部或根裝入一個2. OmL離心管中，用液氮磨勻，在4°C放置(冰上或者冰箱)至樣品凍融；
2)加入2mL 2% (體積百分含量)冰醋酸水溶液，在42°C水浴中溫浴30min。3) 12000rpm離心2min,上清液用于有效磷含量的測定。4)取Iml工作溶液與I ml樣品上清液混合，于37°C溫育I小時。5)反應液在冰上冷卻或4°C 5 min終止反應。820nm可見光波長下測定吸收值。(3)磷標準曲線的制作
稱取0.44g KH2P04(80°C干燥2h)溶于蒸餾水中，定容至得母液(無機磷濃度為100 u g/mL)
然后用母液配置無機磷濃度分別為0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1和2iig/mL的標準液,蒸懼水為空白對照。
取500 ii L上述標準液(或蒸餾水)，加入500 u L AMES反應液，37°C反應I小時；4°C放置5min終止反應。820nm可見光波長下測定吸收值。并繪制標準曲線。(4)計算
植物有效磷(Pi)含量(mg Pi/g FW) =OD 值 * (V/m) * (V2/V 1)*C OD值一換算后待測液中磷的質(zhì)量濃度(PPM: mg/L)
V一樣品制備溶液的ml數(shù)，即樣品所加提取劑的體積(此為0. 01 L) m 一樣品鮮重(g)(根據(jù)實際稱得的質(zhì)量計算)
VI一吸取反應所用體積(I ml)
V2 —反應液總體積數(shù)(3ml) C 一樣品的稀釋倍數(shù)(如果樣品濃度過高，需稀釋至I ml后再反應)
3.2全磷測定 先將材料在300° C進行H2SO4-H2O2消煮，再利用鑰銻抗比色法進行測定。3. 3研究結(jié)果
無論在高磷還是低磷培養(yǎng)條件下，過量表達株系的全磷含量高于野生型株系，但差異不明顯(表I)。而在低磷條件下，過量表達株系莖葉中的有效磷含量則為野生型的兩倍，差異明顯。在根中的有效磷含量則無顯著差異(圖10)。這個結(jié)果暗示，過量表達株系能夠在低磷條件下提高莖葉中的有效磷含量。4、對下游磷饑餓響應基因和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的調(diào)控
對過量表達株系和野生型株系中的磷饑餓響應基因J tIPSl ,A tPS2、A tPS3和七TPAS/的表達進行定量PCR檢測。結(jié)果表明，低磷條件下，相比野生型株系，ZmPHRl過量表達株系根中AtIPSl、AtPS2、AtPS3和ATPAS/的表達量均得了明顯提高(圖11 a, c, e，g);在莖葉中，四種基因的表達量也得到上調(diào)，但只有和AtRNSl的上調(diào)比較明顯(圖11c，g)。在高磷條件下，ZmPHRl過量表達株系根中和的表達量也得到上調(diào)(圖11 d，f, h )。而無論在那種磷培養(yǎng)條件下d沈AS/在過量表達株系中的表達均高于野生型株系(圖11 g，h)。以上結(jié)果說明ZmPHRl調(diào)控了和ATPAS/
四種基因的表達。對過量表達株系和野生型株系中的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因Phtl; 2、Phtl; 4, Phtl; 8和Phtl; 9的表達進行定量PCR檢測。在低磷條件下，過量表達株系根中的Phtl; 2、Phtl; 8的Phtl; 9的表達量得到上調(diào)(圖12 a, e, g)，而在高磷條件下，過量表達株系根中的Phtl; 2和Phtl;9的表達量也得到提高(圖12 b, 11)，在莖葉中沖吐1;2、？1^1;8的？1^1;9的表達量未檢測到(圖12 a, b, e, f, g, h)。在低磷條件下,Phtl; 2，Phtl; 8和Phtl;9在過量表達株系根中的表達高于高磷處理。以上結(jié)果表明，在低磷條件下，調(diào)控了根中Phtl; 2，Phtl; 8和Phtl; 9的表達。ZmPHRl可能對Phtl; 4的表達沒有調(diào)控作用(圖12 C，d)。
權利要求
1.一種低磷脅迫反應調(diào)控因子ZmPHRl，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或者幾個氨基酸所形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.一種編碼權利要求1所述的低磷脅迫因子ZmPHRl的基因。
3.權利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的序列含有SEQID NO :1所示的核苷酸序列。
4.一種擴增權利要求2、或3所述基因的全長或其任意片段的引物對，所述引物序列如下引物對I正向引物5' - AAGCAAGGTAATGAAATG -3'反向引物5' - TGAATAGTGCAACCGATA -3'；引物對2正向引物5' -CACCCTTTATTTCTCAGTCATCCAA -3'反向引物5' -TCATTTTGTGTAGCACTCTCATCAG -3'。
5.含有權利要求2、或3所述基因的植物表達載體。
6.權利要求5所述的植物表達載體，其特征在于，所述載體為PJIT163-ZmPHRl :: GFP，及其在構建過程中生成的各種中間載體，是將所述基因插入pJIT163 GFP 的SalI和BamH I酶切位點之間得到的。
7.權利要求5所述的植物表達載體，其特征在于，所述載體為 pCAMBIA1300-ZmPHRl :: GFP，及其在構建過程中生成的各種中間載體，是將限制性內(nèi)切酶KpnI和XhoI雙酶切重組質(zhì)粒甲得到的小片段和限制性內(nèi)切酶KpnI和SalI雙酶切 PCAMBIA1300得到的大片段連接得到的。
8.一種含有權利要求7所述植物表達載體的農(nóng)桿菌菌株，其特征在于，含有植物表達載體pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP,是將重組質(zhì)粒乙通過凍融法導入農(nóng)桿菌菌株GV3101獲得的。
9.含有權利要求7所述植物表達載體的過量表達的轉(zhuǎn)基因純合株系，其特征在于，是通過將含有植物表達載體pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP的農(nóng)桿菌菌液經(jīng)點滴法導入擬南芥中獲得的。
10.權利要求2、或3所述基因在植物育種中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種低磷脅迫反應調(diào)控因子ZmPHR1、編碼該蛋白的基因及應用，屬于基因工程技術領域，是為了解決采用分子育種方法改善作物磷利用率低的問題。一種玉米低磷脅迫反應調(diào)控因子ZmPHR1，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或者幾個氨基酸所形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼上述調(diào)控因子ZmPHR1的基因，所述基因的序列含有SEQIDNO1所示的核苷酸序列；以及上述基因在植物育種中的應用。本發(fā)明的基因及其編碼蛋白在作物中，特別是玉米、小麥和水稻等糧食和經(jīng)濟作物的品種改良中將發(fā)揮重要的作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12N15/29GK103012574SQ20121051888
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月6日 優(yōu)先權日2012年12月6日
發(fā)明者白建榮, 王秀紅, 劉惠民, 孫毅, 史向遠, 任志強 申請人:山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所