專利名稱：一種磁珠法提取糧食深加工產品基因組dna的試劑盒及方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及一種利用磁珠法提取糧食深加工產品基因組DNA的試劑盒及其提取方法。
背景技術：
核酸的分子生物學技術是進行病原微生物檢測，轉基因檢測，物種鑒定，物種起源、多樣性評估及其親緣關系、系統(tǒng)進化等常用研究手段之一。純化的DNA是用來進行PCR檢測最基本材料，盡管在不同樣品(原材料、食品成分、加工產品)中，DNA是一個相對穩(wěn)定的分子，但是對于深加工產品來說，DNA提取技術仍然是基于DNA擴增的檢測技術的瓶頸，能否提取出高質量的DNA分子是判斷隨后采用的分析技術是否合理的關鍵，提取方法的靈敏度、特異性也將直接關系到后續(xù)試驗的成敗。對于一般的分析來說，好的制備技術應 該是簡便、安全、廉價，并且能保證DNA質量和數量。用于檢測分析的DNA應具備一定的濃度、純度、完整性。材料和提取技術都可能對這些參數受到影響，反過來，這些參數也可能影響分析技術是否合理。傳統(tǒng)的核酸分離方法主要有CTAB法、SDS法、PVP法和和硅膠吸附，提取的步驟主要包含細胞裂解、有機溶劑萃取、沉淀，高速離心等過程，裂解步驟中，蛋白質和多糖結合CTAB和/或PVP從溶解DNA的液相中分離出來，硅膠吸附也可用來協(xié)助DNA的提取和純化，裂解后，用酚和/或氯仿去除液相中的有活性的核酸酶和PCR抑制因子，如親脂類分子、多糖、蛋白質。DNA結合鹽酸胍一氫氧化物離液劑中的硅膠顆粒而沉淀，沉淀用異丙醇洗滌。最后，沉淀用低濃度鹽溶液溶解。相關試劑盒包括Wizard試劑盒(Promega Corp. , Madison,WI)、Dneasy (Qiagen, Crawley, UK)等。這些純化方法的步驟繁雜、費時長、回收率低,且提取過程中使用酚、氯仿、異丙醇等有毒有害物質，影響人體健康。磁株分離純化技術是一種簡單有效的核酸提純方法，主要在磁珠上連接能特異性吸附核酸的功能基團，在樣本的裂解溶液中特異性地吸附目標核酸，隨后通過磁分離技術將核酸從裂解溶液中提取出來。磁珠法能夠很好地克服傳統(tǒng)核酸方法的缺點，具簡便、快捷、高效等特點，符合核酸自動化提取要求，因此，該方法已廣泛應用于細菌、動物血液、唾液等組織的DNA的提取中，也相應出現了各種各樣的試劑盒。但是，與動物細胞相比，植物細胞除了有細胞壁外，還含有大量的多糖、脂質、色素和酚類物質，利用現有的磁珠法提取DNA試劑盒對植物組織的基因組DNA進行提取，所得產物的回收率和純度都比較低，尤其是對于深加工后的植物產品，由于其經過高溫處理后，基因組DNA的斷裂降解程度高，利用現有的磁珠法提取DNA試劑盒對其基因組DNA進行提取，產物回收率和純度都極低，不能滿足進一步實驗的需求。

發(fā)明內容
針對現有技術所存在的不足，本發(fā)明的一個目的是提供一種磁珠法提取糧食深加工產品基因組DNA的試劑盒。本發(fā)明的另一個目的是提供一種磁珠法提取糧食深加工產品基因組DNA的方法。本發(fā)明所采用的技術方案是
一種磁珠法提取糧食深加工產品基因組DNA的試劑盒，包括A液、B液、磁珠懸液、75%乙醇溶液和TE緩沖液，其中，
A 液含有 2 4wt%CTAB, I 1. 5mol/L 氯化鈉，18 22mmol/L EDTA，80 120 mmol/L Tris-HCL, 10 30 mg/mL 蛋白酶 K, I 3wt%i3 -疏基乙醇，pH =7. 5 8. 5 ; B 液含有 O. 4 O. 6 wt % CTAB, O. 03 O. 05 mol/L 氯化鈉，pH =7. 5 8. 5 ;
磁珠懸液由磁珠和O. 01 O. 03wt%的NaN3水溶液按1:1. 5 2. 5的體積比組成。優(yōu)選的，所述A 液含有 3 wt %CTAB,1. 4mol/L 氯化鈉，20mmol/L EDTA，100 mmol/LTris-HCL, 20 mg/mL 蛋白酶 K, 2 wt %β-疏基乙醇，pH =8.0。優(yōu)選的，所述B 液含有 O. 5 Wt %CTAB，O. 04mol/L 氯化鈉，pH =8. O。優(yōu)選的，所述磁珠的直徑為3 7 μ m。一種糧食深加工產品基因組DNA的提取方法，包括如下步驟
1)將預處理后的糧食深加工產品加入到A液中，60 70°C溫浴40 80min；
2)取上清液，加入B液和磁珠懸液，混合均勻；
3)將磁珠轉移到75%的乙醇溶液中清洗；
4)清洗后的磁珠用TE緩沖液進行洗脫，得到純化的DNA。樣品與A液的質量體積比為Ig :4 6ml。上清液與B液的體積比為1:1 3。上清液與磁珠懸液的體積比為10 20 :1。所述糧食深加工產品包括米制品、飼料、食用油等。本發(fā)明的有益效果在于
I)利用本發(fā)明試劑盒提取的基因組DNA回收率高、純度高、片段完整、無PCR抑制物質，使用本試劑提取Ig深加工產品米粉、飼料以及1000 mL花生油，分別純化得到了約640μ g、520 μ g、和12 μ g的高純度基因組DNA，純度Α260/280 =1. 75-2. 06之間。2)本發(fā)明的DNA提取方法僅需4個步驟，分別是裂解、沉淀、清洗、洗脫，全自動操作，可以由儀器完成從裂解、純化、收集產物的全過程，實驗過程中完全無需人工干預和檢測，且提取所使用的試劑高效安全，最大程度避免對人體的傷害。


圖1是不同方法提取米粉、飼料基因組DNA的實時熒光PCR檢測結果圖(1:本發(fā)明試劑盒提取米粉DNA，2:本發(fā)明試劑盒提取飼料DNA，3:商品試劑盒I提取米粉DNA，4 :商品試劑盒I提取飼料DNA，5 :商品試劑盒2提取米粉DNA，6 :商品試劑盒2提取飼料DNA，7 :商品試劑盒3提取米粉DNA，8 :商品試劑盒3提取飼料DNA)；
圖2是花生油提取的基因組DNA熒光PCR擴增結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
實施例1
磁珠法提取糧食深加工產品基因組DNA的試劑盒，包括A液、B液、磁珠懸液、75%乙醇溶液和TE緩沖液，其中，
A 液的組成為3wt%CTAB，1. 4mol/L 氯化鈉，20mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCL, 20mg/mL蛋白酶K，2wt%i3-巰基乙醇，pH =8.0，溶劑為水；
B液的組成為0. 5wt%CTAB,O. 04mol/L氯化鈉，pH =8. 0，溶劑為水；
TE緩沖液的組成為10mM Tris-HCl，ImM EDTA，pH=8. 0，溶劑為水；
磁珠緩沖液的組成為磁珠(直徑是3 7 μ m) (OMEGA公司)與O. 02wt% NaN3水溶液按1:2的體積比混合。
利用上述試劑盒提取米粉或飼料基因組DNA，包括如下步驟1.取Ig粉碎過的米粉或飼料，加入到5ml A液中，65°C孵化60min。2.常溫lOOOOrpm，離心lOmin，直至沉淀完全，吸取上清液備用。3.轉移300 μ I上清液,加入到KingFisher mL 5聯(lián)管第一、二孔,第一孔中加入600 μ I B液和20 μ I磁珠懸液；第二孔中加入600 μ I B液；第三和第四孔加900 μ I的75%乙醇溶液；第五孔加400 μ L TE緩沖液。4.將5聯(lián)管放入全自動核酸提取儀Thermo Scientific KingFisher mL,轉入磁套，運行程序，程序步驟如下
Cl)第一孔渦旋混勻60秒；
(2)吸附磁珠轉移至第二孔，渦旋混勻60秒；
(3)吸附磁珠轉移至第三孔75%乙醇中，渦旋混勻120秒；
(4)吸附磁珠轉移至第四孔75%乙醇中，渦旋混勻120秒；
(5)轉移至磁力架上吸附磁珠，室溫干燥IOmin；
(6)釋放磁珠至第五孔TE緩沖液中，渦旋重懸磁珠。5.吸取第五孔TE緩沖液，即提取的基因組DNA，置于冰箱中備用；
6.運用微量分光光度儀(Nanodrop-1000)測定DNA的濃度和純度，以其它3種常規(guī)商品試劑盒的提取結果作為對照，結果如表I所示。7.將提取的基因組DNA進行實時熒光PCR檢測，米粉檢測水稻內源基因G0S9，飼料檢測大豆凝集素基因LECTIN，引物和探針序列見表2，以其它3種常規(guī)商品試劑盒的提取結果作為對照，實驗結果見圖1。實施例2
采用實施例1的試劑盒提取花生油中的基因組DNA，包括如下步驟1.取200 ml樣品油，于500 mL燒杯中，加等體積的無菌水，20_25°C于磁力攪拌器上攪拌I小時以上；然后于12000r/min，離心15_20min，小心吸取下層水相；在水相中加入200 ml樣品油，重復1-2步驟5次。2.小心將水相轉移到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放于一 80°C冷凍過夜，然后將培養(yǎng)皿轉至真空干燥機中至水分完全蒸發(fā)；加I mL A液至培養(yǎng)皿中，65°C溫浴4小時。3.分別轉移300 μ I上清液，加入到KingFisher mL 5聯(lián)管第一、二孔，第一孔中加入600 μ I B液和20 μ I磁珠懸液；第二孔中加入600 μ I B液；第三和第四孔加900 μ I75%的乙醇溶液；第五孔加50 μ L TE緩沖液。
4.將5聯(lián)管放入全自動核酸提取儀Thermo Scientific KingFisher mL,轉入磁套，運行程序，程序步驟如下
(1)第一孔渦旋混勻60秒；
(2)吸附磁珠轉移至第二孔，渦旋混勻60秒；
(3)吸附磁珠轉移至第三孔75%乙醇中，渦旋混勻120秒；
(4)吸附磁珠轉移至第四孔75%乙醇中，渦旋混勻120秒；
(5)轉移至磁力架上吸附磁珠，室溫干燥IOmin； (6)釋放磁珠至第五孔TE緩沖液中，渦旋重懸磁珠。5.吸取第五孔TE緩沖液，即提取的基因組DNA，置于冰箱中備用。6.運用微量分光光度儀(Nanodrop-1000)測定DNA的濃度和純度，結果如表2所
/Jn ο7.將提取的基因組DNA進行實時熒光PCR檢測花生幾丁質酶基因chi2. 2，所用引物為HS-F和HS-R，探針為HS-P (見表2)。以本發(fā)明方法提取花生基因組DNA作為陽性對照，去離子水作為陰性對照，每組設兩個平行。結果如圖2所示。
..................................................................................................................—......................................................................................................1.....1.............................................................................................
產品MW濃墳丨 Λ2 ι( /280 I
t<i 11MI ng/μ.1IΙ.Η2-. 2.06 I
本發(fā)明 NA 12￡> Iig^pl丨I
3,2 ι β'μ !I|
65 ng/μΙ丨|
^------ I
IMil30 ng/|il丨 1,74.... 1,9S |
I丨
米'R,ISng/p〖 丨 1J5、.. 1:%
HilViiiLtMS 2V.4I1,Bng/pt1,72 ..-.-1,93 |
柳 I!I
I
*!]35η^μΙ丨〖.財、.145|
fft iVi y: jfiJ a_!1-^2S ηψμ I LIK- -21)3 I
III
權利要求
1.一種磁珠法提取糧食深加工產品基因組DNA的試劑盒，包括A液、B液、磁珠懸液、75%乙醇溶液和TE緩沖液，其中， A 液含有 2 4wt%CTAB, I 1. 5mol/L 氯化鈉，18 22mmol/L EDTA，80 120 mmol/L Tris-HCL, 10 30 mg/mL 蛋白酶 K, I 3wt%i3 -疏基乙醇，pH =7. 5 8. 5 ;B 液含有 O. 4 O. 6 wt % CTAB, O. 03 O. 05 mol/L 氯化鈉，pH =7. 5 8. 5 ; 磁珠懸液由磁珠和O. 01 O. 03wt%的NaN3水溶液按1:1. 5 2. 5的體積比組成。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述A液含有3wt%CTAB，1.4mol/L氯化鈉，20mmol/L EDTA, 100 mmol/L Tris-HCL, 20mg/mL 蛋白酶 K, 2 wt %β-疏基乙醇，pH=8. O0
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述B液含有O.5%CTAB，O. 04mol/L氯化鈉，pH =8. O。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述磁珠的直徑為3 7μ m。
5.一種糧食深加工產品基因組DNA的提取方法，包括如下步驟 1)將預處理后的糧食深加工產品加入到權利要求1或2所述的A液中，60 70°C溫浴40 80min ； 2)取上清液，加入權利要求1或3所述的B液和權利要求1所述的磁珠懸液，混合均勻； 3)將磁珠轉移到75%的乙醇溶液中清洗； 4)清洗后的磁珠用TE緩沖液進行洗脫，得到純化的DNA。
6.根據權利要求5所述的提取方法，其特征在于，步驟I)中，樣品與A液的質量體積比為 Ig :4 6ml。
7.根據權利要求5所述的提取方法，其特征在于，步驟2)中，上清液與B液的體積比為1:1 3。
8.根據權利要求5所述的提取方法，其特征在于，步驟2)中，上清液與磁珠懸液的體積比為10 20 :1。
9.根據權利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述糧食深加工產品包括米制品、飼料、食用油等。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種磁珠法提取糧食深加工產品基因組DNA的試劑盒及提取方法。本發(fā)明的磁珠法提取糧食深加工產品基因組DNA的試劑盒，包括A液、B液、磁珠懸液、75%乙醇溶液和TE緩沖液，其中，A液含有2～4wt%CTAB，1～1.5mol/L氯化鈉，18～22mmol/LEDTA，80～120mmol/LTris-HCL，10～30mg/mL蛋白酶K，1～3wt%β-巰基乙醇，pH=7.5～8.5；B液含有0.4～0.6wt%CTAB，0.03～0.05mol/L氯化鈉，pH=7.5～8.5；磁珠懸液由磁珠和0.01～0.03wt%的NaN3水溶液按11.5～2.5的體積比組成。利用本發(fā)明試劑盒提取的基因組DNA回收率高、純度高、片段完整、無PCR抑制物質。DNA提取過程可由儀器完成從裂解、純化、收集產物的全過程，提取所使用的試劑高效安全，最大程度避免對人體的傷害。
文檔編號C12N15/10GK103013981SQ20121051953
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權日2012年12月5日
發(fā)明者張衛(wèi)東, 廖力, 王嵐, 梁玉英, 徐淼鋒, 遲遠麗 申請人:張衛(wèi)東