專利名稱：自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及自主復(fù)制型表達(dá)載體PEV及其制備方法與應(yīng)用，特別是一種適冷宿主菌菌株SM20429的自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV及其制備方法與應(yīng)用，屬于海洋生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在生物技術(shù)與生物工程領(lǐng)域中，通過(guò)將外源基因克隆于表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)入到ー個(gè)合適的宿主細(xì)胞中，來(lái)達(dá)到表達(dá)和制備重組蛋白的目的。將這種表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用到エ業(yè)生產(chǎn)中，可以用于大量制備重組蛋白，達(dá)到エ業(yè)化水平。地球上的低溫生境非常廣泛，包括深度超過(guò)1000米的海洋、極地和許多季節(jié)性的寒冷環(huán)境等等。這些低溫生境中存在大量的微生物，其中大部分為適冷微生物。由于長(zhǎng)期生 活在低溫環(huán)境下，適冷微生物所產(chǎn)生的酶類等蛋白質(zhì)往往具有適冷特性，即在低溫下的高催化效率和高溫下的低穩(wěn)定性。有研究表明，低溫環(huán)境有利于適冷蛋白的重組表達(dá)，可以更有效地得到有活性的適冷蛋白。雖然大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最成熟和常用的表達(dá)系統(tǒng)，但大腸桿菌為中溫菌，最適生長(zhǎng)溫度為37°C。在這樣高的溫度下，適冷酶既不穩(wěn)定，也難以進(jìn)行活性表達(dá)，往往以包涵體的形式存在。而降低大腸桿菌的培養(yǎng)溫度，會(huì)降低大腸桿菌的生長(zhǎng)速率和表達(dá)效率。因此，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)并不是適冷蛋白重組表達(dá)的最佳選擇。由于適冷細(xì)菌能在低溫下快速生長(zhǎng)，所以建立適冷細(xì)菌為宿主的表達(dá)系統(tǒng)可以對(duì)適冷蛋白進(jìn)行有效的活性重組表達(dá)。近些年，國(guó)外雖已有開(kāi)發(fā)出適冷細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的報(bào)道，但仍然沒(méi)有商品化的低溫表達(dá)系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供ー種利用適冷假交替單胞菌進(jìn)行異源蛋白低溫表達(dá)的方法。名詞解釋纖維素酶酶活単位(U)定義為35°C下毎分鐘釋放I U g葡萄糖所需酶量。接合轉(zhuǎn)移頻率定義為接合轉(zhuǎn)移后每個(gè)受體菌所產(chǎn)生的接合轉(zhuǎn)移子數(shù)目。本發(fā)明的技術(shù)方案如下適冷宿主菌菌株SM20429的自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。上述適冷宿主菌菌株SM20429的自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV的構(gòu)建方法，步驟如下I)以質(zhì)粒pKNGlOl為模板,利用EasyTaq DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)回收，制得質(zhì)粒pKNGlOl的DNA片段，PCR擴(kuò)增引物序列如下OriTl :5’ -GCCAGCTCGTCGGTGTAGCT-3’， SEQ ID NO. 3RK2 :5’ -CAACAACGTTGCCCGGATCG-3’，SEQ ID NO. 42)將步驟I)制得的質(zhì)粒pKNGlOl的DNA片段和載體pGEM-T Easy的混合液4yl、5 U I連接緩沖液、I U I連接酶混合后，16°C連接過(guò)夜，得質(zhì)粒；3)以質(zhì)粒pWD為模板，利用Pfu DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物序列如下ZF :5’ -AACTGCAGCAAGACACTGTGAAGG-3’， SEQ ID NO. 5CMR :5，-GGACTAGTGAAGCACACGGTCACACTG-3，，SEQ ID NO. 6經(jīng)純化回收后，用限制性內(nèi)切酶SpeI和PstI雙酶切處理，回收酶切DNA片段，然后插入到同樣經(jīng)限制性內(nèi)切酶SpeI和PstI雙酶切處理后的步驟2)制得的質(zhì)粒中，制得p0riT-4CM 質(zhì)粒； 4)人工合成含有木聚糖酶啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和His-tag及終止密碼子的DNA片段，在片段的兩端引入SphI和NotI識(shí)別位點(diǎn)；用限制性內(nèi)切酶SphI和NotI雙酶切處理，經(jīng)純化回收后，插入到同樣經(jīng)限制性內(nèi)切酶SphI和NotI雙酶切處理的步驟3)制得的p0riT-4CM質(zhì)粒中，制得自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV。所述步驟4)中含有木聚糖酶啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和His-tag的DNA片段制備步驟如下選取Pseudoalteromonas sp. BSi20429的木聚糖酶基因起始密碼子前200bp的DNA序列其后緊跟4個(gè)限制性內(nèi)切酶序列，His標(biāo)簽(CACCACCACCACCACCAC)和終止密碼子(TAA)，人工合成這段DNA片段并在片段兩端引入SphI和NotI識(shí)別位點(diǎn)。經(jīng)檢測(cè)，自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV大小為7355bp (如SEQ ID NO.1所示)，包含有大腸桿菌復(fù)制元件復(fù)制起始位點(diǎn)來(lái)源于質(zhì)粒pGEM-T Easy的復(fù)制起始位點(diǎn),接合轉(zhuǎn)移起始序列，來(lái)源于質(zhì)粒pKNGlOl ;選擇標(biāo)記為抗氨卞青霉素基因,來(lái)源于質(zhì)粒pGEM-T Easy和抗氯霉素基因，來(lái)源于PWD ;假交替單胞菌復(fù)制元件復(fù)制起始位點(diǎn)來(lái)源于質(zhì)粒PSM429的復(fù)制起始位點(diǎn)，pSM429 (GenBank登錄號(hào)EU627679)提取于菌株P(guān)seudoalteromonassp.BSi20429，啟動(dòng)子為木聚糖酶啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)為BglI1、Stu1、Ava1、XhoI。純化標(biāo)簽為His標(biāo)簽,如附圖1所示。上述適冷宿主菌菌株SM20429的自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV在表達(dá)適冷纖維素酶中的應(yīng)用。適冷宿主菌菌株(Pseudoalteromonas sp. )SM20429,購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏編號(hào)為CCTCC M 2010239。有益效果本發(fā)明所述的適冷宿主菌菌株SM20429的自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV可用于各種適冷酶和蛋白的異源活性表達(dá)。適冷宿主菌菌株SM20429屬于假交替單胞菌屬，該屬細(xì)菌是一類好氧、異養(yǎng)型革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛分布于海洋環(huán)境中。由于海洋環(huán)境中大部分為低溫環(huán)境，因此目前分離到的假交替單胞菌多數(shù)具有適冷特征。適冷宿主菌菌株SM20429為BSi20429的質(zhì)粒消除菌株，仍具有典型適冷特征，在15°C低溫條件下可以快速率生長(zhǎng)；自主復(fù)制型表達(dá)載體PEV含有較強(qiáng)的啟動(dòng)子，能夠大量表達(dá)外源蛋白。因此，適冷宿主菌菌株SM20429和自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV具有被發(fā)展成為大量表達(dá)外源蛋白的適冷表達(dá)系統(tǒng)的潛在價(jià)值，從而達(dá)到在低溫條件下快速制備適冷蛋白的目的。


圖1、構(gòu)建的自主復(fù)制型載體pEV的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2、適冷纖維素酶基因在SM20429中的異源表達(dá)后細(xì)胞提取液檢測(cè)酶活照片；其中1、空白對(duì)照；2、帶有質(zhì)粒pEV-cen的SM20429菌株；3、不帶有質(zhì)粒pEV-cen的SM20429菌株；圖3、適冷纖維素酶基因在SM20429中的異源表達(dá)后培養(yǎng)物上清檢測(cè)酶活照片；其中1、空白對(duì)照；2、帶有質(zhì)粒pEV-cen的SM20429菌株；3、不帶有質(zhì)粒pEV-cen的SM20429菌株；圖4、利用His-tag純化的適冷纖維素酶的電泳圖； 其中泳道I 3為純化的胞內(nèi)表達(dá)的纖維素酶；泳道4、5為純化的分泌到胞外纖
維素酶。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)ー步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。生物材料來(lái)源質(zhì)粒pGEM-T Easy購(gòu)自Promega公司，質(zhì)粒pKNGlOl和質(zhì)粒pWD均為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，純化試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自MBI公司，連接緩沖液、連接酶均購(gòu)自Promega公司。人工合成的DNA片段有上海捷瑞生物工程有限公司合成。適冷宿主菌菌株(Pseudoalteromonas sp. )SM20429,購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏編號(hào)為CCTCC M 2010239。培養(yǎng)基海水LB液體培養(yǎng)基，組分如下胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，人工海水1000毫升，pH7. 0-8. 0 ；LB液體培養(yǎng)基，組分如下胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，蒸餾水1000毫升，pH7. 0-8. 0 ；Binding buffer,組分如下50Mm Tris-Cl PH 8. 0,200mM NaCl, 5mM 咪唑，1% 甘油，三蒸水定容至 IOOOml ；Washing buffer,組分如下終濃度20Mm的咪唑溶于Binding buffer ；Elution buffer,組分如下終濃度200 u M 咪唑溶于 Binding buffer ；實(shí)施例1 :自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV的構(gòu)建1.說(shuō)明大小7355bp大腸桿菌復(fù)制元件復(fù)制起始位點(diǎn)來(lái)源于質(zhì)粒pGEM-T Easy的復(fù)制起點(diǎn)。選擇標(biāo)記抗氨卞青霉素基因，來(lái)源于質(zhì)粒pGEM-T Easy ；結(jié)合轉(zhuǎn)移起始序列來(lái)源于質(zhì)粒pKNGlOl ；
假交替單胞菌復(fù)制元件復(fù)制起始位點(diǎn)來(lái)源于質(zhì)粒pSM429的復(fù)制起始位點(diǎn)，pSM429 (GenBank登錄號(hào)EU627679)提取于菌株 Pseudoalteromonas sp. BSi20429。選擇標(biāo)記抗氯霉素基因，克隆于質(zhì)粒pWD。啟動(dòng)子木聚糖酶啟動(dòng)子，來(lái)源于菌株P(guān)seudoalteromonas sp.BSi20429。多克隆位點(diǎn)Bglll、Stu1、Aval、Xhol。如圖1 所示。2.構(gòu)建方法 (i ) PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pKNGlOl上大小為0. 7kb的DNA片段。以質(zhì)粒pKNGlOl 為模板，利用引物(OriTl :5’ -GCCAGCTCGTCGGTGTAGCT-3’，RK2 5’ -CAACAACGTTGCCCGGATCG-3，)，EasyTaq DNA Polymerase PCR 擴(kuò)增質(zhì)粒 pKNGlOl 的 DNA片段；PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)后，用純化試劑盒(購(gòu)自O(shè)MEGA公司)按說(shuō)明書純化回收。(ii) DNA片段和質(zhì)粒pGEM-T Easy的連接、轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證將步驟(i)制得的DNA片段和載體pGEM-T Easy(購(gòu)自Promega公司)混合液4 ii1、5 U I連接緩沖液(購(gòu)自Promega公司)、I U I連接酶(購(gòu)自Promega公司)混合成反應(yīng)體系，16°C連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a菌株的感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布在氨芐青霉素LB平板。通過(guò)提取質(zhì)粒和瓊脂糖電泳來(lái)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化子中含有構(gòu)建的質(zhì)粒。(iii)PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pWD上大小為3. 3kb的DNA片段以質(zhì)粒pWD 為模板，利用引物(ZF :5’ -AACTGCAGCAAGACACTGTGAAGG-3’，CMR :5’ -GGACTAGTGAAGCACACGGTCACACTG-3’)，Pfu DNA Polymerase PCR 擴(kuò)增質(zhì)粒 pWD 的 DNA 片段。其中引物的5’端分別加上SpeI和PstI識(shí)別位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)后，用限制性內(nèi)切酶SpeI和PstI雙酶切處理，37°C酶切30min后，用純化試劑盒(購(gòu)自O(shè)MEGA公司)按說(shuō)明書純化回收。(iv)以上兩片段的連接、轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證將步驟(i i )的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SpeI和PstI雙酶切處理，370C酶切30min后，用純化試劑盒(購(gòu)自O(shè)MEGA公司)按說(shuō)明書純化回收。酶切的質(zhì)粒與步驟(iii)得到的片段的混合液1>5 u I連接緩沖液(購(gòu)自Promega公司)、I U I連接酶(購(gòu)自Promega公司)混合成10 的反應(yīng)體系，16°C連接過(guò)夜，制得p0riT-4CM質(zhì)粒，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 a菌株的感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布在氨芐青霉素和氯霉素LB平板。通過(guò)提取質(zhì)粒和瓊脂糖電泳來(lái)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化子中含有構(gòu)建的p0riT-4CM質(zhì)粒。(V)木聚糖酶啟動(dòng)子,多克隆位點(diǎn)和His-tag的插入選取Pseudoalteromonas sp. BSi20429的木聚糖酶基因起始密碼子前200bp的DNA序列其后緊跟4個(gè)限制性內(nèi)切酶序列，His標(biāo)簽(CACCACCACCACCACCAC)和終止密碼子(TAA)并在片段兩端引入SphI和NotI識(shí)別位點(diǎn)，人工合成這段DNA片段(上海捷瑞)；用限制性內(nèi)切酶SphI和NotI雙酶切處理，37°C酶切30min后，用純化試劑盒(購(gòu)自O(shè)MEGA公司)按說(shuō)明書純化回收；插入到經(jīng)同樣酶切處理的通過(guò)步驟(iv)構(gòu)建的質(zhì)粒p0riT-4CM中，構(gòu)建成自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV。將自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV轉(zhuǎn)化E. coli DH5a菌株的感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布在氨芐青霉素和氯霉素LB平板。通過(guò)提取質(zhì)粒和瓊脂糖電泳來(lái)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化子中含有構(gòu)建的自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV。經(jīng)測(cè)序，上述自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
實(shí)施例2 :適冷假交替單胞菌高效接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的建立采用接合轉(zhuǎn)移的方法，以適冷宿主菌菌株SM20429為宿主菌，以自主復(fù)制型表達(dá)載體PEV為載體，以大腸桿菌E T12576為供體菌建立適冷假交替單胞菌高效接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，步驟如下I)將自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV轉(zhuǎn)化E. coli ET12567菌株的感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布在氨芐青霉素、氯霉素和卡那霉素LB平板。通過(guò)提取質(zhì)粒和瓊脂糖電泳來(lái)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化子中含有構(gòu)建的質(zhì)粒；2)取菌種保藏編號(hào)為CCTCC M 2010239的適冷宿主菌菌株，接種到海水LB液體培養(yǎng)基中，20°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得初級(jí)菌液；將含有自主復(fù)制型表達(dá)載體的E. coli ET12567菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得到初級(jí)菌液；3)按體積百分比1%的接種量將步驟2)制得的兩種初級(jí)菌液分別接種到海水LB 液體培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基中，20°C和37°C培養(yǎng)到OD6qq為0. 6 1. 0，8000rpm離心lmin，棄去上清，得菌體；4)用Iml海水LB液體培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基分別洗滌步驟3)制得的菌體8000rpm離心Imin收集菌體,棄上清，并重復(fù)2 3次,分別將菌體懸浮于Iml海水LB液體培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基中，得菌液；5)將步驟4)得到的兩種菌液以供體宿主=100 1的體積比混合，取200 U I涂布到含氯霉素和氨芐青霉素的篩選平板，20°C靜置培養(yǎng)。通過(guò)提取質(zhì)粒和瓊脂糖電泳來(lái)檢驗(yàn)接合轉(zhuǎn)移子中含有構(gòu)建的質(zhì)粒，構(gòu)建制得了適冷假交替單胞菌高效的接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。用此方法轉(zhuǎn)化的接合轉(zhuǎn)移效率達(dá)到1. 8X 10_3。實(shí)施例3 :利用構(gòu)建的適冷表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化適冷纖維素酶(I)以來(lái)源于假交替單胞菌屬適冷菌株的適冷纖維素酶基因cen為模板，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，利用引物(引物序列F: 5 ’ -GGAAGATCTATGGATAACAGTTTAATTAATCAC-3，，R:5，-CCGCTCGAGGCCACCCCAACCTTGAATG-3，)，Pfu DNA Polymerase PCR 擴(kuò)增 cen片段，其中在引物兩端分別設(shè)計(jì)了 BglII和XhoI識(shí)別位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)后，用限制性內(nèi)切酶BglII和XhoI雙酶切處理，37°C酶切30min后，用純化試劑盒(購(gòu)自O(shè)MEGA公司)按說(shuō)明書純化回收。(2)將經(jīng)過(guò)酶切純化的纖維素酶基因cen片段克隆到經(jīng)相同酶切處理的自主復(fù)制型表達(dá)載體PEV中，構(gòu)建纖維素酶基因cen的質(zhì)粒pEV-cen。(3)利用接合轉(zhuǎn)移的方法將質(zhì)粒pEV-cen轉(zhuǎn)入適冷宿主菌株SM20429。通過(guò)提取質(zhì)粒和瓊脂糖電泳來(lái)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化子中含有構(gòu)建的質(zhì)粒，制得帶有質(zhì)粒pEV-cen的SM20429菌株。(4)將帶有質(zhì)粒pEV-cen的SM20429菌株在10°C下擴(kuò)大培養(yǎng)，檢測(cè)菌株細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的纖維素酶活性。纖維素酶活性檢測(cè)方法a)菌體超聲破碎取5ml菌液離心收集菌體，用磷酸緩沖液(PBS)洗滌菌體兩次，最后加入5ml PBS使菌體重懸，用超聲波破碎細(xì)菌，4°C離心lmin，取上清測(cè)胞內(nèi)酶活。b)培養(yǎng)物上清液的收集取Iml菌液4°C離心分離菌體與上清。取上清測(cè)胞外酶活。c)取0.1ml細(xì)胞提取液或培養(yǎng)物上清，加入15ml比色管中，加入預(yù)熱的Iml 1%的CMC-Na溶液，35 °C水浴反應(yīng)30min，立即加入1. 5ml 3，5-ニ硝基水楊酸(DNS)終止反應(yīng)，再置沸水中煮沸5min，流水冷卻，加蒸餾水至15ml搖勻。同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照測(cè)定，于15ml比色管中加入0.1ml酶液，1. 5mlDNS試劑，后加入Iml預(yù)熱的1%的CMC-Na溶液，搖勻。置沸水中煮沸5min,流水冷卻,加蒸懼水至15ml,搖勻。于550nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值測(cè)還原糖的含量。如圖2和圖3所示。由圖2可以看出帶有質(zhì)粒pEV-cen的SM20429菌株胞內(nèi)檢測(cè)到纖維素酶酶活，說(shuō)明適冷纖維素酶基因在SM20429中進(jìn)行了異源表達(dá)；由圖3可以看出帶有質(zhì)粒pEV-cen的SM20429菌株胞外檢測(cè)到纖維素酶酶活，說(shuō)明適冷纖維素酶基因在SM20429中進(jìn)行了異源表達(dá)，并分泌至胞外。
實(shí)施例4 :利用His-tag純化纖維素酶將帶有質(zhì)粒pEV-cen的SM20429菌株在10°C下擴(kuò)大培養(yǎng)，純化胞內(nèi)和胞外的纖維素酶。利用His-tag純化纖維素酶的方法a)胞內(nèi)蛋白收集取IOOml菌液4°C離心收集菌體,用20ml Binding buffer使菌體重懸，用超聲波破碎細(xì)菌，4°C離心lOmin，收集上清。b)胞外蛋白收集取IOOml菌液4°C離心分離菌體與上清，取上清后，將IOOml上清液加入透析袋中，用PEG 2000濃縮菌液。濃縮后用Binding buffer過(guò)夜透析菌液。4°C離心IOmin,收集上清。c)將步驟a)與b)得到的胞內(nèi)和胞外的蛋白液分別加到鎳柱上，待液體流盡后，加入8-10倍柱體積的Binding buffer。待Binding buffer流盡,加入8_10倍柱體積的Washing buffer,流盡后，加入 IOml Elution buffer 并用1. 5ml 離心管收集。d)將步驟c)收集到的蛋白測(cè)纖維素酶活，并通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)純化的纖維素酶。如圖4所示。
SEQUENCE LISTING
<110〉山東大學(xué)
く 120〉自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV及其制備方法與應(yīng)用<160〉 6
<170 PatentIn version 3. 5
く210> I<211> 7355<212> DNAく 213〉人工合成
<400> I
gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgcgca tgcggcgaaa aatgcgctaa ttaacagaag60
CCgttttatt gttatttttt tcatgtgtat ccttgctaat tttgttgcta gtaaagtgtg120
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caaaaagact atatggtgtt aagtttacat tgcacactaa aaaacacaca acaggagatc240
taggcctccc gggctcgagc accaccacca ccaccactaa tgagatccgg ctgctaacaa^OO
agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct360
tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttggcggcc gcgcggccgc gggaattcga420
tgccagctcg tcggtgtagc tctttggcat cgtctctcgc ctgtcccctc agttcagtaa480
tttcctgcat ttgcctgttt ccagtcggta gatattccac aaaacagcag ggaagcagcg540
cttttccgct gcataaccct gcttcggggt cattatagcg attttttcgg tatatccatc600
ctttttcgca cgatatacag gattttgcca aagggttcgt gtagactttc cttggtgtat680
ccaacggcgt cagccgggca ggataggtga agtaggccca cccgcgagcg ggtgttcctt^20
cttcactgtc ccttattcgc acctggcggt gctcaacggg aatcctgctc tgcgaggctg,80
gccggctacc gccggcgtaa cagatgaggg caagcggatg gctgatgaaa ccaagccaac840
caggaagggc agcccaccta tcaaggtgta ctgccttcca gacgaacgaa gagegattga900
ggaaaaggcg gcggcggccg gcatgagcct gtcggcctac ctgctggccg tcggccaggg960
ctacaaaatc acgggcgtcg tggactatga gcacgtccgc gagctggccc gcatcaatgg1020
cgacctgggc cgcctgggcg gcctgctgaa actctggctc accgacgacc cgcgcacggc1080
gcggttcggt gatgccacga tccgggcaac gttgttgatc actagtgaag cacacggtcaIliO
cactgcttcc ggtagtcaat aaaccggtaa accagcaata gacataagcg gctatttaac1200
gaccctgccc tgaaccgacg accgggtcga atttgctttc gaatttctgc cattcatccg1260
cttattatca cttattcagg cgtagcaacc aggcgtttaa gggcaccaat aactgcctta1320
aaaaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct1380
gccgacatgg aagccatcac aaacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac1440
cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat1500
attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa1^60
catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc1620
ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga1680

aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac1740
cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag1800
aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc1860
cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc1920
aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt1980
ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag2040
tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt2100
tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt atcaacaggg acaccaggat ttatttattc2160
tgcgaagtga tcttccgtca caggtattta ttcggcgcaa agtgcgtcgg gtgatgctgc2220
caacttactg atttagtgta tgatggtgtt tttgaggtgc tecagtggct tctgtttcta2280
tcagctgtcc ctcctgttca gctactgacg gggtggtgcg tggatccctg cct.ttaagat2340
ttgctttaat atttttagtt ctgacatgtt tttttccttt ttttatatat tttaaaatta2400
actcaaaaaa gattaatgtc aatagtaaaa aataatcaaa tattattata taaataatca2460
tttttgatta ttaatttagt cattcttgat taagtacata atcatttttg atttaatatc2520
gaaaaaagat aaaaaaaaag ccttttttaa ggctttttta aaaaattaat gatgattatt2580
cacgtgtttg aataagacac tgaaggtaat ttttattttt aaactcgttt ataatttctt2640
cttttttata ttcatattta ggtgtttgat aagctttaaa aatgagtttt tccattacgt2700
cagaactaaa gctatcattt cctttaaaaa atcgcctatg agtttccatt gttttttgta2760
atggatagcc tgcttgtctt aatttcatta ttgcctcgga ggctttttca atattaaggc2820
agtattttaa agatgattca ctgttttttg cttgaaggct aaaagtaagt aagagagtga2880
tagttaaaaa tatatatt.tt ttcatgttaa atccttttgt tgtatatttc agatgtagca2940
taaaaaaaaa tatataaaat ggagataatg aaaaagttac tttttttttc aggctgagcc3000
ataaaaatgc tatggatttt ttaacactaa aagggcttta tttttgacac cctaacgggg3060
gataacctga taccaccata ctgcaccttt ttttattaac aatttttaga ctaaaaaact3120
ttaaattgtg gataactaaa aaacctactt ttctattttt gaccaataaa cttttactgt3180
tcttaatgat ttacttgata gattagcaac ggctttttgt gttggcttga tacattggct3240
cactaattca ttaaaagcgt cttgtagggc gttttgtgtc gttttacgtt gtaattgatt3300
ggtgtatgta gcacctataa cttgtttgtc agattatgac cttttagatc8360
cagctccata actccgcgat ttttgccatc accaacaaaa ttacaccaag tccaggtcgc3420
tatagatttt attgagtgct gacattcttt aaaatccatt ggttcggcta gcataccgtt3480
taaatcattg tagatgcgtt ctatttcagc gtagaagcta ttaaaatcct tatgcttatg3540
tttcaccttg taagactgaa aacggacagt atcgaacaaa tagatattac gttcacctgt3600
tccaacgtta ataatttctt tatcttcaac aattgagatt ttgggcttat ttacgtaaat3660
ttccgcatct ggaatatttt caaataattc atcaaaatca taaggtttgt ttgaaaaaga3720
aaaaacatca taagagttat ttagcgggtt tttagcttga. atgccgttga aattcttatx3780
agttccgagg tggttattca gtgaatgcgt tagcagtctc aaagcctttt gaggtttgat3840
tcttgcgttt ggagtagttc caacaaacga agataaacga taaaataaat gcgctcgatt3900
attattttta ttttttacaa ctaagtttgg atttatattt ttttcttcaa taacattaaa3960
aacatcaata tcgcaatcta aacatatgta attttgaccc gacaaat.gat. tgtattgaat4020
atgtgaaaat ctagaagaat gttgcttact tctaataatt tgatagtaat ctttgtttga4080
aactttgact ttatccatta aattattttt aaagtgttct aattcagtgt ttatttttat4140

權(quán)利要求
1.適冷宿主菌菌株SM20429的自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV，核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.權(quán)利要求1所述適冷宿主菌菌株SM20429的自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下 1)以質(zhì)粒pKNGlOl為模板,利用EasyTaqDNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)回收,制得質(zhì)粒pKNGlOl的DNA片段，PCR擴(kuò)增引物序列如下OriTl :5’ -GCCAGCTCGTCGGTGTAGCT-3’，RK2 :5’ -CAACAACGTTGCCCGGATCG-3’， 2)將步驟I)制得的質(zhì)粒pKNGlOl的DNA片段和載體pGEM_TEasy的混合液4 μ 1、5 μ I連接緩沖液、I μ I連接酶混合后，16°C連接過(guò)夜，得質(zhì)粒； 3)以質(zhì)粒pWD為模板，利用PfuDNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物序列如下ZF :5’ -AACTGCAGCAAGACACTGTGAAGG-3'CMR :5，-GGACTAGTGAAGCACACGGTCACACTG-3，， 經(jīng)純化回收后，用限制性內(nèi)切酶ApeI和PstI雙酶切處理，回收酶切DNA片段，然后插入到同樣經(jīng)限制性內(nèi)切酶SpeI和PstI雙酶切處理后的步驟2)制得的質(zhì)粒中，制得p0riT-4CM 質(zhì)粒； 4)人工合成含有木聚糖酶啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和His-tag及終止密碼子的DNA片段，在片段的兩端引入SphI和NotI識(shí)別位點(diǎn)；用限制性內(nèi)切酶SphI和NtI雙酶切處理，經(jīng)純化回收后，插入到同樣經(jīng)限制性內(nèi)切酶SphI和NotI雙酶切處理的步驟3)制得的p0riT-4CM質(zhì)粒中，制得自主復(fù)制型表達(dá)載體PEV。
3.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟4)中含有木聚糖酶啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和His-tag的DNA片段制備步驟如下 選取Pseudoalteromonas sp. BSi20429的木聚糖酶基因起始密碼子前200bp的DNA序列其后緊跟4個(gè)限制性內(nèi)切酶序列，His標(biāo)簽和終止密碼子，人工合成這段DNA片段并在片段兩端引入SphI和NotI識(shí)別位點(diǎn)。
4.權(quán)利要求1所述適冷宿主菌菌株SM20429的自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV在表達(dá)適冷纖維素酶中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV及其制備方法與應(yīng)用。適冷宿主菌菌株SM20429的自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本發(fā)明還公開(kāi)了上述自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV的制備方法與應(yīng)用。適冷宿主菌菌株SM20429和自主復(fù)制型表達(dá)載體pEV具有被發(fā)展成為大量表達(dá)外源蛋白的適冷表達(dá)系統(tǒng)的潛在價(jià)值，從而達(dá)到在低溫條件下快速制備適冷蛋白的目的。
文檔編號(hào)C12N15/74GK103014052SQ20121051975
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月6日
發(fā)明者張玉忠, 于子超, 趙殿麗, 陳秀蘭, 解彬彬, 張熙穎, 周百成 申請(qǐng)人:山東大學(xué)