專利名稱：一種深海細(xì)菌多糖的低成本制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種深海細(xì)菌多糖的低成本制備方法，特別是一種用乳酪加工副產(chǎn)品乳清液和豆柏制備深海細(xì)菌多糖的方法，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細(xì)菌胞外多糖包括莢膜多糖和粘液多醣，具有安全無(wú)毒、理化性質(zhì)獨(dú)特、用途廣泛、易與菌體分離及可通過(guò)深層發(fā)酵實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)良性質(zhì)而倍受關(guān)注。與植物多糖相比，它們種類繁多，生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)、地域和病蟲害條件的限制。細(xì)菌多糖的這些生產(chǎn)環(huán)節(jié)上的優(yōu)勢(shì)和產(chǎn)品優(yōu)越的物化特性為其帶來(lái)了巨大的市場(chǎng)價(jià)值，具有較強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力和廣闊的發(fā)展前景。目前，世界上微生物多糖產(chǎn)量的年增長(zhǎng)率在10%以上，一些新型多糖產(chǎn)量的年增長(zhǎng)率在30%以上，其中細(xì)菌胞外多糖占有很大的份額。已經(jīng)投產(chǎn)的細(xì)菌胞外多 糖主要有黃原膠(xanthan gum)、結(jié)冷膠(gellan gum)和熱凝多糖(curdlan)等,這類多糖作為膠凝劑、增稠劑、潤(rùn)滑劑、絮凝劑、懸浮劑、成膜劑、保鮮劑和乳化劑等廣泛應(yīng)用于食品、制藥、石油和化工等多個(gè)領(lǐng)域。地球上80%的生物存在于海洋，因此海洋生物資源總量巨大。目前的研究表明，海洋微生物因其獨(dú)特的生活環(huán)境，分泌的胞外多糖具有特殊結(jié)構(gòu)，預(yù)示著可能具有潛在用途。對(duì)于海洋微生物分泌的胞外多糖國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有一些研究，但總體開發(fā)利用程度仍然很低。細(xì)菌Zunongwangia profunda SM-A87是從南沖繩海槽1245m深的海底沉積物中分離得到。我們的研究表明，該菌株能夠以乳糖為碳源分泌大量的胞外多糖。對(duì)SM-A87分泌的胞外多糖的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的研究表明，該多糖具有新穎的結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的性質(zhì)，該多糖能夠在高鹽和高溫下保持穩(wěn)定，具有很好的流變學(xué)性質(zhì)，在化妝品、污水處理和石油開采等方面都具有很好的應(yīng)用潛力。但是利用乳糖和蛋白胨進(jìn)行該多糖發(fā)酵成本較高，這嚴(yán)重影響了該多糖的開發(fā)應(yīng)用。因此，發(fā)明Zunongwangia profunda SM-A87胞外多糖的低成本發(fā)酵技術(shù)將為該多糖的應(yīng)用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種深海細(xì)菌多糖的低成本制備方法。本發(fā)明技術(shù)方案如下一種深海細(xì)菌多糖的低成本制備方法，步驟如下(I)將深海細(xì)菌(Zunongwangia profunda) SM-A87菌株接種于液體種子培養(yǎng)基，在15 20°C條件下振蕩培養(yǎng)2 3天，獲得種子培養(yǎng)液；所述液體種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量份蛋白胨O. 8 1. O份，酵母粉O. 5 O. 75份，人工海水100份，pH為7. 5 8. O ;(2)按3 5%的體積百分比將步驟(I)制得的種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在15 20°C、溶解氧飽和度高于30%的條件下，培養(yǎng)20 30h，然后調(diào)整發(fā)酵溫度為8 12°C，繼續(xù)培養(yǎng)8 10天，在繼續(xù)培養(yǎng)期間補(bǔ)加乳清濃縮液，制得發(fā)酵液；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，乳清為體積份，單位以毫升計(jì)，其余均為重量份，單位以克計(jì)乳清60. 9份，豆柏1. O份，NaCl 2. 9份，人工海水100份，pH為8. O。(3)向步驟(2)制得發(fā)酵液中加入1. 5 3倍體積的無(wú)水乙醇醇沉，分離取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌、烘干，制得粗多糖；(4)將步驟(3)制得的粗多糖溶于水中，配成重量體積百分比為O. 5 1%的溶液，單位g/L ;加入堿性蛋白酶使溶液中堿性蛋白酶的濃度為5 10U/mL的堿性蛋白酶，在45 50°C、180 200rpm的條件下,酶解5 6h ;再加入1. 5 3倍體積的無(wú)水乙醇醇沉，分離取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌、烘干，制得深海細(xì)菌胞外多糖。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的,所述步驟(I)中的深海細(xì)菌(Zunongwangia profunda)SM_A87菌株是在溫度為15 20°C條件下，于固體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)2 3天后制得的。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，上述固體培養(yǎng)基組分如下，均為重量份蛋白胨O. 8 1. O份，酵母粉O. 5 O. 75份、瓊脂1. O 1. 5份，人工海水100份，pH 為 7. 5 8. O ;根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中補(bǔ)加的乳清濃縮液，由配制發(fā)酵培養(yǎng)基的乳清通過(guò)濃縮5倍后獲得，每次補(bǔ)加的乳清濃縮液的量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10%。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中補(bǔ)加乳清濃縮液的次數(shù)為兩次，補(bǔ)加乳清濃縮液的時(shí)間為繼續(xù)培養(yǎng)的第4天和第6天。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)和步驟(4)中的醇沉，溫度為3 6°C，時(shí)間為20 40min。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)和步驟(4)中的烘干，溫度為55 60°C，時(shí)間為24 30h。上述深海細(xì)菌(Zunongwangia profunda) SM-A87購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，菌種保藏號(hào)CCTCC NO :AB206139T。有益效果1、本發(fā)明用乳酪加工副產(chǎn)品乳清液代替乳糖，用豆柏代替蛋白胨，進(jìn)行細(xì)菌菌株SM-A87胞外多糖發(fā)酵，發(fā)酵成本降低70%以上。2、本發(fā)明采用分批補(bǔ)料發(fā)酵，使菌株SM-A87胞外多糖的產(chǎn)量達(dá)到17. 2g/L，與乳糖發(fā)酵罐補(bǔ)料相比胞外多糖的產(chǎn)量提高了 50. 9%。3、乳清液是乳酪加工副產(chǎn)品，一些乳制品加工廠直接作為廢水排放，會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，本發(fā)明用乳清液進(jìn)行細(xì)菌SM-A87胞外多糖發(fā)酵，可以大量利用乳清液，不僅降低發(fā)酵成本，而且具有很好的環(huán)境效益和社會(huì)效益。


圖1、乳清濃度與深海細(xì)菌胞外多糖產(chǎn)量和發(fā)酵液粘度的關(guān)系圖；圖2、豆柏濃度與深海細(xì)菌胞外多糖產(chǎn)量和發(fā)酵液粘度的關(guān)系圖；圖3、NaCl濃度與深海細(xì)菌胞外多糖產(chǎn)量和發(fā)酵液粘度的關(guān)系圖；圖4、發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵液粘度、深海細(xì)菌胞外多糖產(chǎn)量和菌體濃度關(guān)系的曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例中所述深海細(xì)菌(Zunongwangia profunda)SM_A87購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，菌種保藏號(hào)CCTCC N0:AB206139To
堿性蛋白酶購(gòu)自丹麥諾維信公司；配制人工海水的海鹽購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；乳清購(gòu)自山東省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所山東興牛乳業(yè)公司；培養(yǎng)基其他配制原料均為本領(lǐng)域常用原料，可市場(chǎng)購(gòu)得。實(shí)施例1:一種深海細(xì)菌多糖的制備方法，步驟如下(I)將深海細(xì)菌(Zunongwangia profunda) SM-A87菌株接種于液體種子培養(yǎng)基，在20°C條件下振蕩培養(yǎng)3天，獲得種子培養(yǎng)液；所述液體種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量份蛋白胨O. 8份，酵母粉O. 75份，人工海水100份，pH為8.0 ;(2)按5%的體積百分比將步驟(I)制得的種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在20°C、溶解氧飽和度高于30%的條件下，培養(yǎng)20h，然后調(diào)整發(fā)酵溫度為12°C，繼續(xù)培養(yǎng)8天，在繼續(xù)培養(yǎng)期間補(bǔ)加乳清濃縮液，制得發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，乳清為體積份，單位以毫升計(jì)，其余均為重量份，單位以克計(jì)乳清60. 9份，豆柏1. O份，NaCl 2. 9份，人工海水100份，pH為8. O。(3)向步驟(2)制得發(fā)酵液中加入3倍體積的無(wú)水乙醇醇沉，分離取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌、烘干，制得粗多糖；(4)將步驟(3)制得的粗多糖溶于水中，配成重量體積百分比為1%的溶液，單位g/L ;加入堿性蛋白酶使溶液中堿性蛋白酶的濃度為5U/mL的堿性蛋白酶，在50°C、180rpm的條件下，酶解5h ;再加入3倍體積的無(wú)水乙醇醇沉，分離取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌、烘干，制得深海細(xì)菌胞外多糖。所述步驟(I)中的深海細(xì)菌(Zunongwangia profunda) SM-A87菌株是在溫度為20°C條件下，于固體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)2天后制得的。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，上述固體培養(yǎng)基組分如下，均為重量份蛋白胨0. 8份，酵母粉0. 75份、瓊脂1. O份，人工海水100份，pH為8. O ;所述步驟(2)中補(bǔ)加的乳清濃縮液，由配制發(fā)酵培養(yǎng)基的乳清通過(guò)濃縮5倍后獲得，每次補(bǔ)加的乳清濃縮液的量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10%。所述步驟(2)中補(bǔ)加乳清濃縮液的次數(shù)為兩次，補(bǔ)加乳清濃縮液的時(shí)間為繼續(xù)培養(yǎng)的第4天和第6天。所述步驟(3)和步驟(4)中的醇沉，溫度為3°C，時(shí)間為40min。所述步驟(3)和步驟(4)中的烘干，溫度為60°C，時(shí)間為24h。經(jīng)檢測(cè)，深海細(xì)菌胞外多糖產(chǎn)率為76. 1%。實(shí)施例2
一種深海細(xì)菌多糖的制備方法，步驟如下(I)將深海細(xì)菌(Zunongwangia profunda) SM-A87菌株接種于液體種子培養(yǎng)基，在15°C條件下振蕩培養(yǎng)3天，獲得種子培養(yǎng)液；所述液體種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量份蛋白胨1. O份，酵母粉O. 5份，人工海水100份，pH為7. 5 ;(2)按3%的體積百分比將步驟(I)制得的種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在15°C、溶解氧飽和度高于30%的條件下，培養(yǎng)30h，然后調(diào)整發(fā)酵溫度為8°C，繼續(xù)培養(yǎng)10天，在繼續(xù)培養(yǎng)期間補(bǔ)加乳清濃縮液，制得發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，乳清為體積份，單位以毫升計(jì)，其余均為重量份，單位以克計(jì) 乳清60. 9份，豆柏1. O份，NaCl 2. 9份，人工海水100份，pH為8. O。(3)向步驟(2)制得發(fā)酵液中加入1. 5倍體積的無(wú)水乙醇醇沉，分離取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌、烘干，制得粗多糖；(4)將步驟(3)制得的粗多糖溶于水中，配成重量體積百分比為O. 5%的溶液，單位g/L ;加入堿性蛋白酶使溶液中堿性蛋白酶的濃度為10U/mL的堿性蛋白酶，在45°C、200rpm的條件下，酶解6h ;再加入1. 5倍體積的無(wú)水乙醇醇沉，分離取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌、烘干，制得深海細(xì)菌胞外多糖。所述步驟(I)中的深海細(xì)菌(Zunongwangia profunda) SM-A87菌株是在溫度為15°C條件下，于固體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)3天后制得的。上述固體培養(yǎng)基組分如下，均為重量份蛋白胨1. O份，酵母粉0. 5份、瓊脂1. O份，人工海水100份，pH為7. 5 ;根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中補(bǔ)加的乳清濃縮液，由配制發(fā)酵培養(yǎng)基的乳清通過(guò)濃縮5倍后獲得，每次補(bǔ)加的乳清濃縮液的量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10%。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中補(bǔ)加乳清濃縮液的次數(shù)為兩次，補(bǔ)加乳清濃縮液的時(shí)間為繼續(xù)培養(yǎng)的第4天和第6天。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)和步驟(4)中的醇沉，溫度為6°C，時(shí)間為20min。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)和步驟(4)中的烘干，溫度為55°C，時(shí)間為30h。經(jīng)檢測(cè)，深海細(xì)菌胞外多糖產(chǎn)率為76. 1%。試驗(yàn)例I乳清和乳糖發(fā)酵深海細(xì)菌SM-A87對(duì)生產(chǎn)胞外多糖的影響實(shí)驗(yàn)，步驟如下(l)500mL三角瓶分別加入52. 2mL，56. OmL, 60. 9mL和65. 2mL乳清，用去離子水稀釋至IOOmL,加入O. 762g的蛋白胨，0. 75g酵母粉，3g海鹽，ρΗ8· 0，115°C滅菌30min,以乳糖
蛋白胨培養(yǎng)基作為對(duì)照。上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)基組分如下，均為重量份蛋白胨0.887份，酵母粉0.5份，乳糖3. 221份，人工海水100份，pH為8. O ;(2)將深海細(xì)菌(Zunongwangia profunda)SM_A87菌株劃線接種于固體培養(yǎng)基,在20°C條件下活化培養(yǎng)3天，然后接種于IOOmL液體種子培養(yǎng)基中，在20°C、200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)2天，然后按5% (v/v)的接種量接種于步驟(I)制得的培養(yǎng)基中，10°C培養(yǎng)8天。上述固體培養(yǎng)基組分如下，均為重量份
蛋白胨I份，酵母粉O. 5份、1. 5份瓊脂，人工海水100份，pH為7. 5 8. O ;根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的液體種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量份蛋白胨I份，酵母粉O. 5份，人工海水100份，pH為7. 5 8. O ;結(jié)果如圖1所示，在乳清含量為60. 9%時(shí)，深海細(xì)菌SM-A87菌株胞外多糖產(chǎn)量最高，胞外多糖的最終產(chǎn)量達(dá)到7. 5±0. lg/L，粘度達(dá)到6359±161mPa · s，與對(duì)照組很接近，這說(shuō)明可以用乳清代替乳糖用于深海細(xì)菌SM-A87胞外多糖的發(fā)酵。目前，乳糖市場(chǎng)價(jià)在6000元/噸以上，而乳清作為奶酪制作的廢料大多直接排放，不僅十分浪費(fèi)而且由于 其中含有大量的糖分等高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，極易造成環(huán)境的富營(yíng)養(yǎng)污染，用乳清代替乳糖可以大大節(jié)省深海細(xì)菌胞外多糖的生產(chǎn)成本，利于其大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。試驗(yàn)例2 豆柏、蛋白胨和酵母粉發(fā)酵深海細(xì)菌SM-A87對(duì)生產(chǎn)胞外多糖的影響實(shí)驗(yàn)，步驟如下(I) 500mL三角瓶中加入60. 9mL乳清，用去離子水稀釋至IOOmL,分別加入O. 5、
O.6,0. 7,0. 8g的豆柏，3g海鹽，ρΗ8· 0,115°C滅菌30min,以乳糖蛋白胨培養(yǎng)基作為對(duì)照。上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)基組分同試驗(yàn)例I。(2)深海細(xì)菌SM-A87菌株活化、接種和發(fā)酵方法同實(shí)施例1。結(jié)果如圖2所示，用豆柏代替蛋白胨和酵母粉發(fā)酵深海細(xì)菌SM-A87，胞外多糖的產(chǎn)量和發(fā)酵液粘度高于對(duì)照組，其中胞外多糖產(chǎn)量在豆柏濃度為10g/L時(shí)最高，達(dá)到
11.0±0. 4g/L，發(fā)酵液粘度達(dá)到11589±519mPa · S。以上結(jié)果說(shuō)明了用豆柏代替原來(lái)培養(yǎng)基中的蛋白胨和酵母粉是完全可行的，這不僅顯著降低了深海細(xì)菌SM-A87胞外多糖的生產(chǎn)成本，而且還進(jìn)一步提高了胞外多糖的產(chǎn)量。試驗(yàn)例3 用NaCl代替海鹽發(fā)酵深海細(xì)菌SM-A87對(duì)生產(chǎn)胞外多糖的影響實(shí)驗(yàn)，步驟如下(l) 500mL三角瓶中加入60.9mL乳清和1. Og豆柏，用去離子水稀釋至IOOmL，分別加入2. 8,2. 9,3. 0,3. 1,3. 2g NaCl,ρΗ8· 0,115°C滅菌30min，以乳糖蛋白胨培養(yǎng)基作為對(duì)照。上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)基組分同實(shí)驗(yàn)例I。(2)深海細(xì)菌SM-A87菌株活化、接種和發(fā)酵方法同實(shí)施例1。結(jié)果如圖3所示，在NaCl濃度為2. 9%時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量最高，達(dá)到9. 0±0. lg/L,此時(shí)發(fā)酵液粘度達(dá)到6807±553mPa *s，均高于對(duì)照組。由此說(shuō)明，可用價(jià)格較低的NaCl代替海鹽對(duì)深海細(xì)菌SM-A87進(jìn)行發(fā)酵，從而進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。試驗(yàn)例4 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵深海細(xì)菌SM-A87對(duì)生產(chǎn)胞外多糖的影響實(shí)驗(yàn)，步驟如下(I)將平板活化后的深海細(xì)菌SM-A87菌株接種于IOOmL液體種子培養(yǎng)基中，在20°C、200rpm的條件下震蕩培養(yǎng)2天，然后按5% (v/v)的接種量接種于5L發(fā)酵培養(yǎng)基中，在20°C、溶解氧飽和度80 100%的條件下，培養(yǎng)24h，然后調(diào)整發(fā)酵溫度為10°C，繼續(xù)培養(yǎng)9天，并在培養(yǎng)的第4天和第6天分別補(bǔ)加由乳清液濃縮5倍得到的乳清濃縮液500mL，制得發(fā)酵液，發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵液粘度、深海細(xì)菌胞外多糖產(chǎn)量和菌體濃度關(guān)系如圖4所示；
上述液體種子培養(yǎng)基組分同實(shí)施例1 ;根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，上述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，乳清為體積份，其余均為重量份乳清60. 9份，豆柏1. O份，NaCl 2. 9份，人工海水100份，pH為8. O。(2)向步驟(I)制得發(fā)酵液中加入2倍體積的無(wú)水乙醇，在4°C條件下醇沉30min，IOOOOrpm離心IOmin,取沉淀,無(wú)水乙醇洗漆、6(TC烘干24h,制得粗多糖；(3)將步驟(3)制得的粗多糖溶于水中，配成重量體積百分比為1%的溶液，單位為g/L ;加入堿性蛋白酶使溶液中堿性蛋白酶的濃度為5U/mL的堿性蛋白酶，在50°C、200rpm 的條件下，酶解5h ;再加入2倍體積的無(wú)水乙醇，在4°C條件下醇沉30min，IOOOOrpm離心IOmin,取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌、60 V烘干24h，制得深海細(xì)菌胞外多糖。
權(quán)利要求
1.一種深海細(xì)菌多糖的低成本制備方法，其特征在于，步驟如下 (1)將深海細(xì)菌SM-A87菌株接種于液體種子培養(yǎng)基，在15 20°C條件下振蕩培養(yǎng)2 3天，獲得種子培養(yǎng)液； 所述液體種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量份 蛋白胨0.8 1.0份，酵母粉0.5 0. 75份，人工海水100份，pH為7. 5 8.0 ; (2)按3 5%的體積百分比將步驟(I)制得的種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在15 20°C、溶解氧飽和度高于30%的條件下，培養(yǎng)20 30h，然后調(diào)整發(fā)酵溫度為8 12°C，繼續(xù)培養(yǎng)8 10天,在繼續(xù)培養(yǎng)期間補(bǔ)加乳清濃縮液,制得發(fā)酵液； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，乳清為體積份，單位以毫升計(jì)，其余均為重量份，單位以克計(jì) 乳清60. 9份，豆柏1. 0份，NaC12. 9份，人工海水100份，pH為8. O。
(3)向步驟(2)制得發(fā)酵液中加入1.5 3倍體積的無(wú)水乙醇醇沉，分離取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌、烘干，制得粗多糖； (4)將步驟(3)制得的粗多糖溶于水中，配成重量體積百分比為0.5 1%的溶液，單位g/L ;加入堿性蛋白酶使溶液中堿性蛋白酶的濃度為5 10U/mL的堿性蛋白酶，在45 50°C、180 200rpm的條件下,酶解5 6h ;再加入1. 5 3倍體積的無(wú)水乙醇醇沉,分離取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌、烘干，制得深海細(xì)菌胞外多糖。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的深海細(xì)菌SM-A87菌株是在溫度為15 20°C條件下，于固體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)2 3天后制得的。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基組分如下，均為重量份 蛋白胨0. 8 1. 0份，酵母粉0. 5 0. 75份、瓊脂1. 0 1. 5份，人工海水100份，pH為 7. 5 8. O。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中補(bǔ)加的乳清濃縮液，由配制發(fā)酵培養(yǎng)基的乳清通過(guò)濃縮5倍后獲得，每次補(bǔ)加的乳清濃縮液的量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10%。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中補(bǔ)加乳清濃縮液的次數(shù)為兩次，補(bǔ)加乳清濃縮液的時(shí)間為繼續(xù)培養(yǎng)的第4天和第6天。
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)和步驟(4)中的醇沉，溫度為3 6°C，時(shí)間為20 40min。
7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)和步驟(4)中的烘干，溫度為55 60°C，時(shí)間為24 30h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種深海細(xì)菌多糖的低成本制備方法，步驟如下(1)將深海細(xì)菌SM-A87菌株接種于液體種子培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)，獲得種子培養(yǎng)液；(2)將種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)，然后調(diào)整發(fā)酵溫度繼續(xù)培養(yǎng)并補(bǔ)加乳清濃縮液，制得發(fā)酵液；(3)向發(fā)酵液中加入無(wú)水乙醇醇沉，分離取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌、烘干，制得粗多糖；(4)將粗多糖溶于水中，加入堿性蛋白酶，酶解，乙醇醇沉，分離取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌、烘干，制得深海細(xì)菌胞外多糖。本發(fā)明用乳酪加工副產(chǎn)品乳清液代替乳糖，用豆粕代替蛋白胨，進(jìn)行細(xì)菌菌株SM-A87胞外多糖發(fā)酵，發(fā)酵成本降低70%以上。
文檔編號(hào)C12P19/04GK102994587SQ201210519759
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月6日
發(fā)明者張玉忠, 劉升波, 陳秀蘭, 秦啟龍, 蘇海楠, 宋曉妍, 周百成 申請(qǐng)人:山東大學(xué)