專(zhuān)利名稱(chēng)：OsCBL1蛋白在培育耐低鉀逆境脅迫植物中的應(yīng)用的制作方法
OsCBLI蛋白在培育耐低鉀逆境脅迫植物中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及OsCBLl蛋白在培育耐低鉀逆境脅迫植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鉀是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，是植物體內(nèi)含量最豐富的一價(jià)陽(yáng)離子，約占植物干重的2%-10%。鉀在植物體內(nèi)具有分布廣、含量高、移動(dòng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，主要集中在生命活動(dòng)最旺盛的部位，通常優(yōu)先分布于芽、幼葉、上部莖和根尖等生長(zhǎng)活動(dòng)旺盛的器官與組織中，當(dāng)K+供應(yīng)充足時(shí)，則更多的在下部莖、葉和根等組織中積累。
鉀參與生命活動(dòng)的方式與氮、磷不同。鉀不參與任何有機(jī)物質(zhì)的形成，但鉀的許多生理作用卻是其它元素所不可替代的。鉀在植物體中的作用可以分成以下幾類(lèi)調(diào)節(jié)酶的活性，促進(jìn)氮的吸收和蛋白質(zhì)合成，調(diào)節(jié)韌皮部溶質(zhì)運(yùn)輸，影響光合作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓和滲透勢(shì),維持細(xì)胞電荷平衡等。
土壤中的鉀是植物鉀素最主要的來(lái)源。自然條件下植物吸收的鉀元素除少部分來(lái)自灌溉水外，其余全靠土壤供給，即使在栽培作物施用鉀肥的情況下，作物吸收的鉀也有 40-80%來(lái)自土壤。因此，土壤中鉀的狀況對(duì)植物的鉀營(yíng)養(yǎng)和鉀肥施用效果有著極其重要的意義。土壤全鉀含量一般占土壤總重的O. 1%-3%，由于植物只能從土壤中吸收以離子形式存在的鉀元素，因此其中只有大約2%的鉀對(duì)植物直接有效，其余的鉀都以不能被植物直接吸收利用的形式被固定在土壤礦物中。
對(duì)一般農(nóng)作物而言，土壤溶液K+含量在40ppm (約lmmol/L)以上時(shí)能夠基本滿足作物生長(zhǎng)的需要，實(shí)際土壤溶液中的K+含量在l-200ppm (約0.025-5mmol/L)之間的范圍內(nèi)，但植物根際的鉀濃度因?yàn)橥寥篮慕邘Ш筒豢山粨Q鉀等原因的存在，通常低于O. 3mmol/ L。當(dāng)植株每千克干重中的鉀元素含量低于IOg時(shí)，植株就會(huì)出現(xiàn)缺鉀性狀。如果在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中鉀供應(yīng)不足，植株莖桿 會(huì)變得柔弱、易倒伏，抗旱、抗寒性降低，葉片失水，蛋白質(zhì)、 葉綠素等物質(zhì)被分解破壞，葉色變黃而且葉組織會(huì)逐漸衰老，最終明顯影響產(chǎn)量。
目前我國(guó)農(nóng)作物生產(chǎn)發(fā)展所面臨的嚴(yán)峻狀況是土壤缺鉀且鉀肥資源極其匱乏，因此從經(jīng)濟(jì)上和長(zhǎng)遠(yuǎn)的戰(zhàn)略上考慮，深入了解和認(rèn)識(shí)植物對(duì)低鉀脅迫的反應(yīng)機(jī)制，提高農(nóng)作物的耐低鉀能力，對(duì)于提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供OsCBLl蛋白在培育耐低鉀逆境脅迫植物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種培育耐低鉀逆境脅迫的植物的方法，包括如下步驟將OsCBLl 蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参?，得到?duì)低鉀逆境脅迫耐受能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株；
所述OsCBLl蛋白獲自水稻(Oryza sativa),是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
所述OsCBLl蛋白的編碼基因?yàn)槿缦翴)或2)或3)或4)的DNA分子
I)序列表中序列2自5’末端第I至639位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植株耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子；
4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子。
上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用 2XSSC、0. 1%SDS 和 I XSSC,O. 1%SDS 各洗膜一次。
所述OsCBLl蛋白的編碼基因可通過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。
可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA 片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
所述表達(dá)載體具體可為在1301-Ubiq質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)(如BamH I和Kpn I酶切位點(diǎn)之間)插入所述OsCBLl蛋白的編碼基因得到的重組質(zhì)粒甲。
攜帶有所述OsCBLl蛋白的編碼基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍法、花粉管通道法等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。所述基因可通過(guò)所述重組質(zhì)粒甲導(dǎo)入所述目的植物中。
所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
所述單子葉植物可為水稻，如水稻品種“日本晴”。
所述雙子葉植物可為擬南芥，如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥或其突變株。所述突變株具體可為cbl I cb 19雙突變體。
所述“對(duì)低鉀逆境脅迫耐受能力增強(qiáng)”體現(xiàn)為植株對(duì)K+的吸收能力增強(qiáng)和/或植株(植株的地下部分和/或地上部分)中的K+含量增加。
本發(fā)明還保護(hù)所述OsCBLl蛋白或所述OsCBLl蛋白的編碼基因在培育耐低鉀逆境脅迫植物中的應(yīng)用。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物可為水稻，如水稻品種“日本晴”。 所述雙子葉植物可為擬南芥，如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥或其突變株。所述突變株具體可為cbllcbl9雙突變體。以上任一所述“低鉀”可為鉀離子濃度為ImM以下，如lOOiiM以下、10iiM以下、 5uM以下或Oil M0本發(fā)明還保護(hù)所述OsCBLl蛋白、所述OsCBLl蛋白的編碼基因或以上任一所述方 法在植物育種中的應(yīng)用。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物可為水稻， 如水稻品種“日本晴”。所述雙子葉植物可為擬南芥，如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥或其突變株。 所述突變株具體可為cbllcbl9雙突變體。本發(fā)明公開(kāi)了水稻OsCBLl蛋白及其編碼基因的工程應(yīng)用，特別公開(kāi)了該基因在 提高植物對(duì)土壤中有效鉀利用效率方面的應(yīng)用。OsCBLl蛋白在水稻中負(fù)責(zé)調(diào)控從土壤中吸 收K+。OsCBLl基因的敲除突變體導(dǎo)致水稻對(duì)K+的吸收顯著減少，并出現(xiàn)明顯的缺鉀褐斑。 OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植物對(duì)K+的吸收能力大大增加。本發(fā)明可用于提高植物耐低鉀能力，為 培育適用于鉀貧瘠土壤的水稻新品種提供了保障。


圖1為oscbll突變體植株中T-DNA的插入位置。圖2為實(shí)施例3中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為實(shí)施例3中各個(gè)株系中OsCBLl基因的相對(duì)表達(dá)量。圖4為實(shí)施例3中水稻品種“Dongjin”、oscbll突變體植株的全植株照片。圖5為實(shí)施例3中水稻品種“日本晴”和OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植株的全植株照片。圖6為實(shí)施例3中鉀離子含量的測(cè)定結(jié)果。圖7為實(shí)施例4中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖8為實(shí)施例4中各個(gè)株系的擬南芥培養(yǎng)7天后的照片。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。oscbll突變體，在水稻品種“Dongjin”的OsCBLl基因中插入T-DNA得到的，獲 自 Rice GE (http://signal, salk. edu/cgi-bin/RiceGE JOB=TEXT&TYPE=GENE&QUERY = 0sl0g41510，編號(hào)為PFG_4A-00665. R ；oscbll突變體植株的T-DNA的插入位置見(jiàn)圖1，其 中實(shí)心盒為外顯子，線條為內(nèi)含子，ATG為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。同樣從RiceGE可以獲得水稻品種 “Dongjin”(野生型植株)。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)TAIR 網(wǎng)站(http://www. arabidopsis. org/)。水稻品種“日本晴”提及水稻品種“日本晴”的參考文獻(xiàn):Wenqiang Yang, Zhaosheng Kong，Edith Omo-Ikerodah,Wenying Xu，Qun Li,Yongbiao Xue. (2008)Calcineurin B-like interacting protein kinase 0sCIPK23functions in pollination and drought stress responses in rice (Oryza sativa L.). J. Genet. Genomics35，531-543.。
cbllcbl9雙突變體提及“cbllcbl9雙突變體”的參考文獻(xiàn)Xu J，Li HD, Chen LQ, Wang Y,Liu LL, Wu WH. (2006)A protein kinase, interacting with two calcineurin B-1ike proteins, regulates K+transporter AKTlinArabidopsis. Cell, 125:1347-1360 ； 該雙突變體植株是由cbl I突變體植株(出發(fā)植株為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥)和cbl9突變體植株(出發(fā)植株為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥)雜交得到的純和株系。
1301-Ubiq 質(zhì)粒提及 “ 1301-Ubiq 質(zhì)?！钡膮⒖嘉墨I(xiàn)Baisheng Yu, Zhongwei Linl,Haixia Li, Xiaoj iao Li, Jiayang Li,Yonghong Wang, Xia Zhang, Zuofeng Zhu,Wenxue Zhai,Xiangkun Wang, Daoxin Xie and Chuanqing Sun. (2007)TAC1, a maj or quantitative trait locus controlling tiller angle in rice. The Plant Journal52, 891-898 ; 1301-Ubiq 質(zhì)粒是將 ubiquitin 啟動(dòng)子插入 PCAMBIA1301 的 Pst I 酶切位點(diǎn)得到的質(zhì)粒。
農(nóng)桿菌菌株EHA105 :提及“農(nóng)桿菌菌株EHA105”的參考文獻(xiàn)Jeroen S. C. van Roekel, Brigitte Damm, Leo S. Melchers, and Andr6Hoekema. (1993)Factors influencing transformation frequency of tomato(Lycopersicon esculentum). Plant Cell Reports, 12:644-647。
農(nóng)桿菌菌株GV3101 :提及“農(nóng)桿菌菌株GV3101”的參考文獻(xiàn)R. Berres，L. Otten, B. Tinland, E. Malgarin1-Clog, B. Walter. (1992)Transformation of vitis tissue by different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6b gene. Plant Cell Reportsll, 192-195.。
實(shí)施例1、OsCBLl蛋白及其編碼基因的獲得在TIGR 網(wǎng)站(http://rice. plantbiology. msu. edu)上輸入 L0C_10g41510,得到一段編碼水稻鈣感受基因的DNA序列。根據(jù)植物分子生物學(xué)國(guó)際植物基因命名法委員會(huì)， Commission for Plant Gene Nomenclature of the International Society for Plant Molecular Biology)的要求，將該DNA序列命名為OsCBLl基因，編碼OsCBLl蛋白。OsCBLl 蛋白如序列表的序列I所不(由213個(gè)氣基酸殘基組成)?；蚪MDNA中，OsCBLl基因具有 8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子。OsCBLl基因的開(kāi)放閱讀框如序列表的序列2所示(642bp)。
實(shí)施例2、過(guò)表達(dá)植株的獲得
一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建
1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
2、以步驟2合成的雙鏈DNA分子為模板，用OsCBLl-F和OsCBLl-R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
OsCBLl-F :5，-A AGGATCCATGGGGTGCTTCCAGTCG-3，
OsCBLl-R :5’ -AAGGTACCTGTGACGAGATCATCAA-3，
3、用限制性內(nèi)切酶BamH I和Kpn I雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
4、用限制性內(nèi)切酶BamH I和Kpn I雙酶切1301-Ubiq質(zhì)粒，回收載體骨架(約 11800bp)。
5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒甲。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,對(duì)重組質(zhì)粒甲進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在1301-Ubiq質(zhì)粒的BamH I和Kpn I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2自5’末端第I至639位核苷酸所示的DNA分子。
二、OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植株的構(gòu)建
1、將重組質(zhì)粒甲轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105，得到重組農(nóng)桿菌甲。
2、將步驟1得到的重組農(nóng)桿菌甲重懸于共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基(將2. 83g KNO3> O. 463g(NH4)2SO4' 0.185g MgSO4 · 7Η20、0· 166g CaCl2 · 2Η20、0· 4g ΚΗ2Ρ04、0· Ig 肌醇、 lmgNico-acid、Img Pyrido(B6)>IOmg Thiamin(BI)>7. 5g K1、30g H3B03、100g MnS04、20g ZnSO4 · 7H20、0. 25g CuSO4 · 5H20、0. 25g CoCl2,2. 5g Na2MoO4 · 2H20、27. 8mg FeSO4 · 7H20、 37. 3mg Na2-EDTA、2mg2，4-D、2g肌醇、0. 5g水解酪蛋白、100mM乙酰丁香酮和30g蔗糖溶于水并用水定容至1L)，得到0D600=0. 3-0. 5的重組農(nóng)桿菌菌懸液。
3、將水稻品種“日本晴”的成熟胚愈傷組織與步驟2得到的重組農(nóng)桿菌菌懸液共培養(yǎng)20min，然后倒掉菌液，用無(wú)菌濾紙洗去愈傷組織表面的菌液，隨即轉(zhuǎn)移到鋪有一層無(wú)菌濾紙的共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基(在每升共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中加入2g植物凝膠)上，26°C暗培養(yǎng) 2-3 天。
4、抗性愈傷組織的篩選
將共培養(yǎng)后的愈傷組織經(jīng)無(wú)菌轉(zhuǎn)移至抗性篩選培養(yǎng)基平板(共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基 +50mg/mL潮霉素)，26°C暗培養(yǎng)半個(gè)月，然后轉(zhuǎn)移至新的抗性篩選培養(yǎng)基平板上繼代培養(yǎng)一次。
5、將步驟4得到的抗性愈傷組織無(wú)菌轉(zhuǎn)移至到預(yù)分化培養(yǎng)基(基本分化培養(yǎng)基+lmg/LNAA+5mg/LABA)，26°C暗培養(yǎng)2個(gè)月；然后轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基(基本分化培養(yǎng)基 +0. 5mg/L KT+0. 25mg/L NAA+500mg/mL羧芐青霉素+50mg/mL潮霉素)，在光周期為15小時(shí)光照/9小時(shí)黑暗的條件中培養(yǎng)(半月左右有綠點(diǎn)出現(xiàn)，一個(gè)月后進(jìn)一步分化出小苗)。
基本分化培養(yǎng)基將2. 83g KN03、0. 463g (NH4) 2S04、0. 185g MgSO4 · 7H20、 0. 166gCaCl2 · 2H20、0. 4g KH2P04、0.1g 肌醇、Img Nico-acid、Img Pyrido (B6) > IOmgThiamin(Bl)、7. 5g K1、30g H3BO3UOOg MnS04、20g ZnSO4 · 7H20、0. 25gCuS04 · 5H20、 0. 25g CoCl2、2. 5g Na2MoO4 · 2H20、27. 8mg FeSO4 · 7H20、37. 3mgNa2_EDTA、0. 5g Glutamine、 0.1g肌醇、0. 3g水解酪蛋白、0. 5g Proline和30g鹿糖溶于水并用水定容至1L。
6、當(dāng)步驟5的小苗長(zhǎng)至約2cm時(shí)，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(將O. 825g NH4NO3^ O. 95gKN03、0. 085g ΚΗ2Ρ04、0· 185g MgSO4 · 7Η20、0· 166g CaCl2,0.1g 肌醇、Img Nico-acid, Img Pyrido (B6) UOmg Thiamin (BI)、7· 5g K1、30g H3BO3UOOg MnS04、20gZnS04 ·7Η20、0.25g CuSO4 · 5H20、0. 25g CoCl2,2. 5g Na2MoO4 · 2H20、27. 8mgFeS04 · 7H20、37. 3mg Na2-EDTA 和 30g 蔗糖溶于水并用水定容至1L)，培養(yǎng)兩周左右生根。
7、將步驟6中根系發(fā)達(dá)的小苗移入土中，先在溫室條件緩苗一周左右，然后移至戶外正常培養(yǎng)，即為T(mén)tl代植株。
8、將Ttl代植株自交并收獲種子(T1代種子)，將T1代種子培育為T(mén)1代植株。
9、將T1代植株進(jìn)行潮霉素抗性篩選(潮霉素濃度為50mg/mL)，對(duì)于某一 Ttl代植株， 如果其T1代植株在潮霉素抗性篩選中顯示3:1的分離比，該Ttl代植株為單拷貝OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植株。
10、將單拷貝OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植株的T1代植株自交并收獲種子(T2代種子)，將 T2代種子培育為T(mén)2代植株。
11、將T2代植株進(jìn)行潮霉素抗性篩選(潮霉素濃度為50mg/mL)，對(duì)于某一 T1代植株，如果其T2代植株均為潮霉素抗性植株，該T1代植株為純合的OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植株， 該植株及其自交后代為一個(gè)OsCBLl基因過(guò)表達(dá)株系。
12、將OsCBLl基因過(guò)表達(dá)株系的T2代植株自交并收獲種子(T3代種子)，將T3代種子培育為T(mén)3代植株。
13、將OsCBLl基因過(guò)表達(dá)株系的T3代植株自交并收獲種子(T4代種子)，將T4代種子培育為T(mén)4代植株。
三、轉(zhuǎn)空載體植株甲的構(gòu)建
用1301-Ubiq質(zhì)粒代替重組質(zhì)粒甲進(jìn)行步驟二，得到轉(zhuǎn)空載體植株甲。
實(shí)施例3、OsCBLl蛋白的功能驗(yàn)證
分別將水稻品種“Dongin”(用DJ表示)、oscbll突變體、水稻品種“日本晴”(用 Np表示)、實(shí)施例2得到的OsCBLl過(guò)表達(dá)植株的T4代植株和實(shí)施例2得到的轉(zhuǎn)空載體植株甲的T4代植株進(jìn)行如下鑒定
一、分子鑒定
1、PCR 鑒定
提取植株幼苗的總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以cDNA為模板,用Primerl和Primer2 組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(靶序列約為650bp)，以鑒定OsCBLl基因的表達(dá)量。采用 OsACTIN基因?yàn)榭醇一?，用Primer3和Primer4組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定(靶序列約為 600bp)。
Primerl :5’ -AATCTAGAATGGGGTGCTTCCAGTCGA-3’ ；
Primer2 5，-AAGGTACCTCATGTGACGAGATCATCAA-3，。
Primerf :5’ -TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3’ ；
Primer4 5，-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3，。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的O. 8%瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖2。
2、Real-time PCR 鑒定
提取植株幼苗的總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，采用Primer5和 Primer6組成的引物對(duì)進(jìn)行Real-time PCR,以鑒定OsCBLl基因的表達(dá)量。采用OsACTIN基因?yàn)榭醇一颍肞rimer7和Primer8組成的引物對(duì)進(jìn)行Real-time PCR鑒定。Real-time PCR 中使用 SYBR Green Master mix 和 ABI7500sequence detection system (Applied Biosystems)。數(shù)據(jù)的處理采用Comparative CT方法。以O(shè)sACTIN基因作為內(nèi)對(duì)照對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。
Primer5 :5， -CGATGGGCTCATCAATAAGG-3，；
Primer6 :5’ -CCCCCTTTTCTTCACATCAA-3’。
Primer7 :5’ -TGGTCGTACCACAGGTATTGTGTT-3’ ；
Primer8 :5， -AAGGTCGAGACGAAGGATAGCAT-3，。
以水稻品種“Dongjin”中OsCBLl基因的表達(dá)量作為1，其它各個(gè)株系中OsCBLl基因的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖3。
步驟一的鑒定結(jié)果表明0sCBLl基因在水稻品種“Dongjin”中正常表達(dá)，而在 oscbll突變體植株中表達(dá)量顯著降低，與水稻品種“Dongjin”相比，oscbll突變體植株中OsCBLl基因的表達(dá)量降低了 75. 50% ；0sCBLl基因在水稻品種“日本晴”中正常表達(dá)，而在 OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植株中表達(dá)量顯著升高，與水稻品種“日本晴”相比，OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植株中OsCBLl基因的表達(dá)量升高了 6827. 10%。
二、OsCBLl蛋白的功能驗(yàn)證
1、分組處理
正常水培液的配制方法114.25mg NH4NO3^50. 38mg NaH2PO4 · 2Η20、89· 25mgK2S04、 110. 75mg CaCl2、405mg MgSO4 ·7Η20、1· 88mg MnCl2 ·4Η20、92· 5 μ g(NH4)6Mo7024 ·4Η20、1· 17mg Η3Β03、437μ g ZnSO4 · 7Η20、388μ g CuSO4 · 5Η20、34· 75mgFeS04 · 7Η20、46· 53mg Na2EDTA,用去離子水定容至1L，用NaOH調(diào)節(jié)pH為5. 70-5. 80。
正常水培液中的K+濃度約為ImM。
缺鉀水培液的配制方法不加入K2SO4，其它均同正常水培液。
缺鉀水培液中的K+濃度為OmM。
對(duì)照組將消毒后浸種并催芽的水稻種子放置于用去離子水浸濕的濾紙上，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，然后將幼苗移至正常水培液中培養(yǎng)7天后拍照并檢測(cè)鉀離子含量。
實(shí)驗(yàn)組將消毒后浸種并催芽的水稻種子放置于用去離子水浸濕的濾紙上，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，然后將幼苗移至缺鉀水培液中培養(yǎng)7天后拍照并檢測(cè)鉀離子含量。
2、表型觀察
水稻品種“Dongjin”、oscbll突變體植株的全植株照片見(jiàn)圖4A,等位葉照片見(jiàn)圖 4B。在正常水培液中培養(yǎng)7天后，水稻品種“Dongjin”和oscbll突變體植株的全植株表型和葉片表型均一致，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。在缺鉀水培液中培養(yǎng)7天后，oscbll突變體植株表現(xiàn)出葉片失綠并出現(xiàn)褐色的的缺鉀斑，而水稻品種“Dongjin”的葉片仍保能保持綠色。
水稻品種“日本晴”和OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植株的全植株照片見(jiàn)圖5A，等位葉照片見(jiàn)圖5B。在正常水培液中培養(yǎng)7天后，水稻品種“日本晴”和OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植株的全植株表型和葉片表型均一致，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。在缺鉀水培液中培養(yǎng)7天后，水稻品種“日本晴”的葉片出現(xiàn)少量褐斑，而OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植株的葉片未出現(xiàn)褐斑。在正常水培液中和在缺鉀水培液中，轉(zhuǎn)空載體植株甲的表型均與水稻品種“日本晴” 一致。
以上結(jié)果表明，OsCBLl基因參與了低鉀通路，是低鉀耐受基因。
3、鉀離子含量的測(cè)定
(I)將植株用雙蒸水清洗干凈，將地下部分(根部)和地上部分(冠部)分開(kāi)，放置于 80°C烘箱中烘干四天，至其重量恒定。
(2)將烘干的地下部分和地上部分分別在分析天平上稱(chēng)量并記錄干重，然后分別放入坩堝內(nèi)。
(3)將坩堝放 入馬弗爐中，300°C烘烤I小時(shí)，然后將溫度調(diào)至575°C再烘烤7小時(shí)， 關(guān)閉馬弗爐，待其冷卻至200°C以下后取出坩堝。
(4)每個(gè)坩堝中加IOmLO.1M HCl水溶液，以溶解剩余物。
(5)將步驟(4)得到的溶液用0.1M HCl水溶液稀釋后作為待測(cè)溶液。
(6)用Z5000型原子吸收分光光度計(jì)面積法測(cè)定稀釋溶液的鉀濃度。采用KCl制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(7)換算每g干重的植物材料中含有多少mg鉀離子。
進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中每個(gè)株系取3株植株，結(jié)果取平均值。
結(jié)果見(jiàn)圖6。在不同濃度鉀離子濃度的水培液培養(yǎng)下，oscbll突變體植株根部和冠部的鉀離子含量都稍低于水稻品種“Dongjin”。在不同濃度鉀離子濃度的水培液培養(yǎng)
下，OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植株的根部和冠部的鉀離子含量都稍高于水稻品種“日本晴”。在缺鉀水培液中培養(yǎng)7天后，與水稻品種“Dongjin”相比，oscbll突變體植株根部的鉀離子含量降低了 30.62%。在缺鉀水培液中培養(yǎng)7天后，與水稻品種“日本晴”相比，
OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植株根部的鉀離子含量增加了 7. 32%。在不同濃度鉀離子濃度的水培液培養(yǎng)下，轉(zhuǎn)空載體植株甲的根部和冠部的鉀離子含量都與水稻品種“日本晴” 一致。以上結(jié)果表明，oscbll突變體對(duì)低鉀敏感，OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植株對(duì)低鉀耐受，即 OsCBLl基因是低鉀耐受基因。
實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因擬南介的犾得和鑒定
一、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得
1、將實(shí)施例2的步驟一得到的重組質(zhì)粒甲轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101，得到重組農(nóng)桿菌乙。
2、將步驟I得到的重組農(nóng)桿菌乙通過(guò)花浸泡法轉(zhuǎn)化cbl lcbl9雙突變體，收獲T1代種子。
3、將T1代植株自交并收獲種子(T2代種子)，將T2代種子培育為T(mén)2代植株。
4、將T2代植株在含50mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行潮霉素抗性篩選，對(duì)于某一 T1代植株，如果其T2代植株在潮霉素抗性篩選中顯示3:1的分離比，該T1代植株為單拷貝 OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植株。
5、將單拷貝OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植株的T2代植株自交并收獲種子(T3代種子)，將 T3代種子培育為T(mén)3代植株。
6、將T3代 植株在含50mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行潮霉素抗性篩選，對(duì)于某一 T2代植株，如果其T3代植株均為潮霉素抗性植株，該T2代植株為純合的OsCBLl基因過(guò)表達(dá)植株，該植株及其自交后代為一個(gè)OsCBLl基因過(guò)表達(dá)株系。
二、轉(zhuǎn)空載體擬南芥的獲得
用1301-Ubiq質(zhì)粒代替重組質(zhì)粒甲進(jìn)行步驟一，得到轉(zhuǎn)空載體植株乙。
三、分子鑒定
分別對(duì)如下植株進(jìn)行鑒定隨機(jī)選取的4個(gè)轉(zhuǎn)OsCBLl基因擬南芥單拷貝純合株系 (株系1、株系2、株系3和株系4)的T3代種子、轉(zhuǎn)空載體植株乙的T3代種子、cbllcbl9雙突變體(簡(jiǎn)稱(chēng)雙突變株)的種子和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的種子。
1、PCR 鑒定
提取植株幼苗的總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，用Primerl和Primer2 組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(靶序列約為650bp)，以鑒定OsCBLl基因的表達(dá)量。采用AtEF 基因?yàn)榭醇一颍肞rimer9和PrimerlO組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定。
Primer9 :5’ -ATGCCCCAGGACATCGTGATTTCAT-3’ ；
Pr imerIO : 5，-TTGGCGGCACCCTTACGTGGATCA-3，。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖7。
四、耐逆性鑒定
分別對(duì)如下植株進(jìn)行鑒定隨機(jī)選取的4個(gè)轉(zhuǎn)OsCBLl基因擬南芥單拷貝純合株系 (株系1、株系2、株系3和株系4)的T3代種子、轉(zhuǎn)空載體植株乙的T3代種子、cbllcbl9雙突變體(簡(jiǎn)稱(chēng)雙突變株)的種子和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的種子。
將擬南芥種子放置于MS培養(yǎng)基上，22 °C光照培養(yǎng)箱中連續(xù)光照(光強(qiáng) 60μmol ·m2 · s—1) 4天，然后分成兩組，分別移苗至MS培養(yǎng)基和低鉀培養(yǎng)基(用LK表示) 上，繼續(xù)在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后拍照。
MS 培養(yǎng)基配方將1. 65g NH4NO3U. 9g ΚΝ03、0· 17g ΚΗ2Ρ04、0· 37g MgSO4 · 7H20、 0. 332g CaCl2,22. 3mg MnSO4 · 4H20、8. 6mg ZnSO4 · 7H20、0. 025mg CoCl2 · 6H20、 0. 025mgCuS04 · 5H20、0. 025mg Na2MoO4 · 2H20、0. 83mg K1、6. 2mg H3BO3, 27. 8mg FeSO4 · 7H20 和37. 3mg Na2EDTA溶于水并用水定容至1L。
低鉀培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基的差異在于去除1. 9g KN03、1. 65g NH4N03、0. 332gCaCl2 和 0. 17g KH2PO4，加入 706mg Ca(NO3)2 和 144mg NH4H2PO4。
照片見(jiàn)圖8。在MS培養(yǎng)基中，各個(gè)株系的表型均沒(méi)有顯著差異。在LK培養(yǎng)基中， 各個(gè)轉(zhuǎn)OsCBLl基因植株的生長(zhǎng)狀態(tài)顯著優(yōu)于雙突變株，與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥無(wú)顯著差異，轉(zhuǎn)空載 體植株和雙突變株的表型沒(méi)有顯著差異。
權(quán)利要求
1.一種培育耐低鉀逆境脅迫的植物的方法，包括如下步驟^fOsCBLl蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参铮玫綄?duì)低鉀逆境脅迫耐受能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株； 所述OsCBLl蛋白是如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦翴)或2)或3)或4)的DNA分子 1)序列表中序列2自5’末端第I至639位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植株耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子； 4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述編碼基因通過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。
4.如權(quán)利要求1或3中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述單子葉植物為水稻。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥。
7.OsCBLl蛋白或其編碼基因在培育耐低鉀逆境脅迫植物中的應(yīng)用； 所述OsCBLl蛋白是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦翴)或2)或3)或4)的DNA分子 1)序列表中序列2自5’末端第I至639位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植株耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子； 4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子。
9.如權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
10.權(quán)利要求1至6中任一所述方法在植物育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了OsCBL1蛋白在培育耐低鉀逆境脅迫植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種培育耐低鉀逆境脅迫的植物的方法，包括如下步驟將OsCBL1蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参?，得到?duì)低鉀逆境脅迫耐受能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株；所述OsCBL1蛋白獲自水稻(Oryza sativa)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明可用于提高植物耐低鉀能力，為培育適用于鉀貧瘠土壤的水稻新品種提供了保障。
文檔編號(hào)C12N15/84GK103031331SQ20121052022
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月6日
發(fā)明者王毅, 武維華, 李娟 , 龍雨 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)