專利名稱：一種PolyHb-rPA復合體及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域,具體涉及一種PolyHb-rPA復合體及其制備方法和應用,通過戊二醛交聯(lián)牛血紅蛋白與瑞替普酶生成PolyHb-rPA復合體，以制備一種具有治療意義的溶栓藥物的方法。
背景技術(shù)：
瑞替普酶(Reteplase, r-ΡΑ)是治療急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)的首選藥物，r-PA是人類組織型纖溶酶原激活物(t_PA)的一部份，與其他溶栓藥物相比，r-PA具有療效顯著，起效迅速，使用方便(可靜脈推注)，不良反應小等優(yōu)點。但目前t-PA價格較高，而且由于其體內(nèi)半衰期較短(11-19分鐘，重組t-PA約為5分鐘)，為維持有效濃度首次靜脈推注后，必須要間隔30分鐘再次注射，給藥方式不當會造成存在出血的危險性，從而限制了 r-PA在臨床上的廣泛使用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對上述缺陷而提供一種PolyHb-rPA復合體及其制備方法和應用，將瑞替普酶(r-PA)與高純度的牛血紅蛋白(Hb)用戊二醛交聯(lián)起來，形成PolyHb-rPA 復合體。從而有效提高了靜脈推注后r-PA體內(nèi)的穩(wěn)定性和半衰期。
本發(fā)明的一種PolyHb-rPA復合體及其制備方法和應用技術(shù)方案為一種 PolyHb-rPA復合體,該復合體是通過戍二醒交聯(lián)血紅蛋白與瑞替普酶生成。
所述的血紅蛋白為牛血紅蛋白。
所述的PolyHb-rPA復合體的制備方法，包括如下操作步驟(1)無基質(zhì)血紅蛋白的制備新鮮牛血紅細胞離心分離去除血漿和中層白細胞，于磷酸鉀緩沖液中裂解，溶血液中脂類基質(zhì)通過甲苯萃取兩次去除，離子交換層析，超濾得到純化的無基質(zhì)血紅蛋白溶液；(2)血紅蛋白與瑞替普酶交聯(lián)的多聚PolyHb-r-PA復合體的制備向純化的血紅蛋白溶液中加入r-PA，血紅蛋白與瑞替普酶的比例(mg/IU)為5(Γ500:1的比例；交聯(lián)前將賴氨酸血紅蛋白以摩爾比10 1加入1. 3 M賴氨酸振蕩I小時，然后將戊二醛血紅蛋白以摩爾比17 :1加入0. 5 M戊二醛，交聯(lián)10-24小時，以HPLC監(jiān)測分子交聯(lián)程度，當達到所需交聯(lián)程度后，向溶液中加入2 M賴氨酸溶液終止交聯(lián)反應；Lactate Ringer溶液過夜透析后， 通過Sephadex G_25色譜柱脫除過量的修飾劑和其他的小分子物質(zhì)；操作過程在4°C，通氮氣保護環(huán)境下進行。
步驟(2)中向純化的血紅蛋白溶液中加入瑞替普酶，血紅蛋白與瑞替普酶的比例 (mg/IU)為 50:1、100:1、200:1、300:1、400:1 或 500:1。
步驟(2)中向純化的血紅蛋白溶液中加入瑞替普酶，血紅蛋白與瑞替普酶的比例 (mg/IU)為 100:1。
一種上述的PolyHb-rPA復合體作為一種溶栓藥物的應用。
本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明將瑞替普酶(r-PA)與高純度的牛血紅蛋白(Hb)用戊二醛交聯(lián)起來，形成PolyHb-rPA復合體。從而有效提高了靜脈推注后r-ΡΑ體內(nèi)的穩(wěn)定性和半衰期交聯(lián)后分子量增大的血紅蛋白可在血紅蛋白濃度較高時仍保持低滲透壓，而且保持了較好的運輸氧的功能，牛血紅蛋白免疫原性低，而且比人血紅蛋白更穩(wěn)定，并且不需要2，3- 二磷酸甘油酸(2，3-DPG)來調(diào)節(jié)載氧能力，聚合后其P5tl值接近天然血紅蛋白。交聯(lián)復合物PolyHb-rPA比血液中的紅細胞體積小上百倍，PolyHb-rPA中的血紅蛋白可通過血栓形成初期變得狹窄的毛細血管，給栓塞后的缺血組織供氧。r-PA與血紅蛋白交聯(lián)后半衰期延長，增加了降低用藥劑量的可能性，從而降低了出血的風險。


圖1所示為用雙功能試劑戊二醛交聯(lián)r-PA與血紅蛋白(Hb)后對r_PA的酶活性的影響；圖2所示為大鼠靜脈推注與血紅蛋白(Hb)交聯(lián)的r-PA以及未與血紅蛋白(Hb)交聯(lián)的r-PA的體內(nèi)半衰期比較。
具體實施例方式為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實例來詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本發(fā)明并不局限于此。
在下述實施例中所給出的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。其中所用試劑均有市售。
實施例1 :PolyHb-rPA復合體的制備一、無基質(zhì)血紅蛋白(Hb)的制備無基質(zhì)血紅蛋白是通過低滲溶牛血紅細胞，并通過甲苯抽提、高速離心凈化、離子交換層析來制得。最終溶液含有O. 1-0. 15 g/mL血紅蛋白。為了減少高鐵血紅蛋白的形成，操作過程在4°C，通氮氣環(huán)境下進行，血紅蛋白溶液的pH值為7. 4。
(I)、牛血紅細胞的分離取新鮮牛血分裝入數(shù)個無菌處理過的離心管中，4000|離心10分鐘。取出后，吸出上層血漿和中層白細胞，下層紅細胞以O. 9%生理鹽水混勻，4000呀·離心10分鐘。棄上清液， 下層紅細胞再以生理鹽水洗滌，重復三次，獲得紅細胞。
(2)、紅細胞的裂解和離心去基質(zhì)將所獲洗滌紅細胞與12. 5 mM、pH 7. 4的磷酸鉀緩沖液以體積比1:2充分混勻，靜置 30分鐘裂解紅細胞，得到紅細胞溶血液。溶血液中脂類基質(zhì)通過加入1/2體積冰冷的甲苯萃取兩次去除。再將溶血液倒入高速離心容器中，15000|離心2小時去除細胞碎片，取上清血紅蛋白溶液作進一步處理。
(3)、血紅蛋白的純化上清血紅蛋白溶液以50 mM、pH 7. 4的磷酸鉀緩沖液平衡后進行離子交換層析，洗脫收集后進行超濾處理，濾出限30KDa，最后得到純化的無基質(zhì)血紅蛋白溶液。
二、血紅蛋白與瑞替普酶(r-PA)交聯(lián)的多聚PolyHb-r-PA復合體的制備瑞替普酶(r-PA)為德國寶靈曼公司產(chǎn)品，商品名Retevase，使用時先用注射用水溶解稀釋，稀釋時用專用溶媒。溶媒組成1 mmol/LPB (p H 6. 5),鹿糖50 mg/mL, Tween-80O.005%。
以Hb/r-PA為100:1的比例向純化的血紅蛋白溶液中加入r_PA。交聯(lián)前以摩爾比 (賴氨酸血紅蛋白)10 :1加入1. 3 M賴氨酸振蕩I小時，然后以摩爾比17 :1 (戊二醛血紅蛋白)加入O. 5 M戊二醒，交聯(lián)10-24小時，以HPLC監(jiān)測分子交聯(lián)程度，當達到所需交聯(lián)程度后，向溶液中加入2 M賴氨酸溶液終止交聯(lián)反應。Lactate Ringer溶液過夜透析后，通過Sephadex G_25色譜柱脫除過量的修飾劑和其他的小分子物質(zhì)。操作過程在4°C,通氮氣保護環(huán)境下進行。
實施例2 :瑞替普酶(r-PA)的活性檢測及大鼠體內(nèi)半衰期測定一、瑞替普酶(r-PA)的活性檢測稱取125 mg瓊脂糖，加入23 mL生理鹽水溶液，煮沸溶解，60°C水浴平衡；加凝血酶 5 mL (100 u/mL),纖溶酶原100 μ L (O. 5 mg/mL),邊加邊搖勻；加I mL人纖維蛋白原(5 mg/mL),不停地搖勻；混濁后立即倒平皿(直徑8 cm)，水平放置充分凝固后4°C放置至少30 min待用。對照品用生理鹽水稀釋不同稀釋度。同時用溶媒作空白對照。在形成的纖維蛋白平皿內(nèi)打孔(直徑2 mm)，每孔點樣10 mL，每個待檢樣品和標準品各點2個孔，37°C濕盒水平放置24 h?？v橫2次量取溶圈直徑，以各稀釋度活性的對數(shù)為橫坐標Cr)，以溶圈直徑的平均數(shù)(4次量取的數(shù)值)的對數(shù)為縱坐標00，按生物統(tǒng)計學方法分析結(jié)果，求得= a + b z中的a和b及線性回歸系數(shù)r值，根據(jù)待檢樣品的溶圈直徑求得待檢樣品的活性。
二、瑞替普酶(r-PA)靜脈推注大鼠體內(nèi)半衰期測定將體重為220-250g的健康雄性Wistar大鼠(山東大學實驗動物中心)用戊巴比妥鈉 (藥物濃度為50mg/mL)按O. 2mL/kg體重腹腔注射麻醉后，股靜脈分離后插入聚乙烯套管， 靜脈推注后間隔取血樣，IOOO^離心IOmin得血漿，檢測r-ΡΑ濃度。
三、結(jié)果與分析結(jié)果如說明書附1、圖2所示，與血紅蛋白(Hb)交聯(lián)的r-PA的活性降低至初始活性的30%-55% ;而其在大鼠體內(nèi)的半衰期則從9. 6分鐘延長至15. 9分鐘。表明PolyHb-rPA 復合體相對于r-PA的溶栓作用更為持久，也降低了 r-PA導致出血的可能性。
實施例3 PolyHb-rPA復合體對體內(nèi)誘發(fā)形成血栓的快速溶栓作用一、 PolyHb-rPA膠原蛋白-腎上腺素誘發(fā)小鼠體內(nèi)血栓形成的的保護 清潔級昆明種小鼠，雄性，體重18 20g(山東大學實驗動物中心)，將膠原蛋白用生理鹽水充分浸泡、勻衆(zhòng)，濃度為1. O mg/mL,然后加入腎上腺素40 μ g/mL混勻，即為誘導劑； 將受試藥用誘導劑配成不同濃度等體積的溶液，小鼠尾靜脈注射，給藥體積O.1 mL/10g(體重)。注射給藥后立即觀察5 min之內(nèi)小鼠死亡數(shù)和15 min內(nèi)小鼠偏癱的恢復數(shù)。計算藥物對小鼠腦血栓的保護率，確切概率法統(tǒng)計分析。結(jié)果如下表。表I PolyHb-rPA對小鼠體內(nèi)血檢形成的保4戶
權(quán)利要求
1.一種PolyHb-rPA復合體,其特征在于,該復合體是通過戍二醒交聯(lián)血紅蛋白與瑞替普酶生成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種PolyHb-rPA復合體，其特征在于，所述的血紅蛋白為牛血紅蛋白。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述的PolyHb-rPA復合體的制備方法，其特征在于，包括如下操作步驟 (1)無基質(zhì)血紅蛋白的制備新鮮牛血紅細胞離心分離去除血漿和中層白細胞，于磷酸鉀緩沖液中裂解，溶血液中脂類基質(zhì)通過甲苯萃取兩次去除，離子交換層析，超濾得到純化的無基質(zhì)血紅蛋白溶液； (2)血紅蛋白與瑞替普酶交聯(lián)的多聚PolyHb-r-PA復合體的制備向純化的血紅蛋白溶液中加入瑞替普酶，血紅蛋白與瑞替普酶的比例(mg/IU)為5(Γ500:1 ;交聯(lián)前將賴氨酸血紅蛋白以摩爾比10 1加入1. 3 M賴氨酸振蕩I小時，然后將戊二醛血紅蛋白以摩爾比17 :1加入O. 5 M戊二醛，交聯(lián)10-24小時，以HPLC監(jiān)測分子交聯(lián)程度，當達到所需交聯(lián)程度后，向溶液中加入2 M賴氨酸溶液終止交聯(lián)反應；Lactate Ringer溶液過夜透析后,通過Sephadex G_25色譜柱脫除過量的修飾劑和其他的小分子物質(zhì)；操作過程在4°C，通氮氣保護環(huán)境下進行。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的PolyHb-rPA復合體的制備方法，其特征在于，步驟(2)中向純化的血紅蛋白溶液中加入瑞替普酶，血紅蛋白與瑞替普酶的比例(mg/IU)為50:1、100:1、200:1、300:1、400:1 或 500:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的PolyHb-rPA復合體的制備方法，其特征在于，步驟(2)中向純化的血紅蛋白溶液中加入瑞替普酶，血紅蛋白與瑞替普酶的比例(mg/IU)為100:1。
6.一種如權(quán)利要求1或2所述的PolyHb-rPA復合體作為一種溶栓藥物的應用。
全文摘要
一種PolyHb-rPA復合體及其制備方法和應用，將瑞替普酶(r-PA)與高純度的牛血紅蛋白(Hb)用戊二醛交聯(lián)起來，形成PolyHb-rPA復合體。從而有效提高了靜脈推注后r-PA體內(nèi)的穩(wěn)定性和半衰期。交聯(lián)復合物PolyHb-rPA比血液中的紅細胞體積小上百倍，PolyHb-rPA中的血紅蛋白可通過血栓形成初期變得狹窄的毛細血管，給栓塞后的缺血組織供氧。r-PA與血紅蛋白交聯(lián)后半衰期延長，活性下降，作用更加穩(wěn)定持久，從而降低了出血的風險。
文檔編號C12N9/96GK103045576SQ20121052704
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者谷勁松, 王革 申請人:谷勁松, 王革