專利名稱：小鼠抗人cd20單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以原核表達(dá)的⑶20蛋白免疫小鼠獲得的分泌⑶20單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2F4，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
⑶20是一種分子量為33_37kD的非糖基化的跨膜磷酸蛋白，位于除漿細(xì)胞(分泌免疫球蛋白的B細(xì)胞)外的發(fā)育分化各階段的B細(xì)胞的表面，是B淋巴細(xì)胞表面分化抗原。它主要參與調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的增殖與分化，與B淋巴細(xì)胞Ca2+的跨膜傳導(dǎo)密切相關(guān)，在免疫系統(tǒng)中起重要作用。人⑶20基因定位于第11號(hào)染色體，⑶20分子由297個(gè)氨基酸組成，有4個(gè)跨膜區(qū)，氨基端和羧基端都位于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)；在第三跨膜區(qū)和第四跨膜區(qū)之間，有一個(gè)由43個(gè)氨基酸殘基組成的環(huán)區(qū)，構(gòu)成其主要的抗原表位。⑶20抗原分子比較暴露，易于接近。⑶20與抗CD20抗體結(jié)合后內(nèi)化現(xiàn)象不明顯，因此細(xì)胞表面CD20分子數(shù)量并不因?yàn)榕c抗體結(jié)合而大量減少并且CD20也不會(huì)發(fā)生明顯細(xì)胞表面脫落的現(xiàn)象。CD20起始表達(dá)于前B細(xì)胞階段，到B細(xì)胞終端分化成漿細(xì)胞時(shí)結(jié)束，一直被認(rèn)為是B細(xì)胞表面特有的標(biāo)識(shí)。CD20主要分布于B細(xì)胞、前B細(xì)胞后期和漿細(xì)胞前的B細(xì)胞等細(xì)胞表面，大于95%的B細(xì)胞淋巴瘤⑶20陽性，B細(xì)胞型慢性淋巴細(xì)胞性白血病弱陽性，B淋巴母細(xì)胞淋巴瘤陰性，少數(shù)外周T細(xì)胞淋巴瘤可能⑶20+ ;而造血干細(xì)胞、原始B淋巴細(xì)胞、正常血細(xì)胞以及其他正常組織都不表達(dá)⑶20分子，在人體血清中亦無游離⑶20的存在。⑶20在B淋巴細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)為靶向治療B淋巴細(xì)胞瘤提供了一個(gè)理想的靶點(diǎn)?？笴D20治療可清除惡性B細(xì)胞和部分正常B細(xì)胞，但由于干細(xì)胞和B細(xì)胞前體不表達(dá)⑶20，因而不會(huì)造成長期B細(xì)胞損耗。將CD20作為治療B細(xì)胞淋巴瘤的靶點(diǎn)，特別是對(duì)治療惰性、復(fù)發(fā)難治性B細(xì)胞淋巴瘤有較肯定的療效。由于⑶20為B淋巴細(xì)胞表面特有的標(biāo)志物，現(xiàn)常用⑶20單克隆抗體標(biāo)記B淋巴細(xì)胞及B細(xì)胞淋巴瘤。生產(chǎn)抗CD20的單克隆抗體對(duì)于淋巴瘤的診斷與治療方面具有重要意義。目前，國內(nèi)外已經(jīng)獲得了多種⑶20的單克隆抗體，但一直以來都需要表達(dá)量更多，親和性更好，稀釋度更高，具有更多優(yōu)良特性的單克隆抗體。獲得活性高的CD20的單克隆抗體對(duì)于臨床診斷和科學(xué)研究具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高親和性的、可用于科研或臨床免疫組化檢測CD20表達(dá)的小鼠抗人CD20單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目 的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:(I)根據(jù)⑶20的基因序列(ΝΜ_021950.3)的編碼框，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，TrizolReagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴(kuò)增⑶20基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體PET28a-⑶20，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)并親和純化蛋白作為抗原。(2)采用經(jīng)典的細(xì)胞融合技術(shù)制備⑶20單克隆抗體。親和層析純化抗體蛋白，SDS-PAGE測定抗體純度，直接ELISA法測定純化抗體的滴度。(3)通過免疫組織化學(xué)分析⑶20單克隆抗體染色人慢性扁桃體炎石蠟切片。(4)根據(jù)抗體基因的恒定區(qū)序列合成特異性引物，PCR擴(kuò)增單克隆抗體CD20重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，回收目的片段，克隆到PGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl細(xì)胞后篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒后測序確定了單克隆抗體CD20的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。本發(fā)明提供的以原核表達(dá)的⑶20蛋白為抗原、免疫小鼠獲得的分泌⑶20單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，名稱為2F4，該細(xì)胞株2F4已于2012年11月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6856。本發(fā)明還提供了所述雜交瘤細(xì)胞株2F4，CGMCC N0.6856產(chǎn)生的單克隆抗體。該抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:9，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:10o本發(fā)明還提供了一種DNA分子SEQ ID NO:7和DNA分子SEQ ID NO:8，DNA分子SEQ ID NO:7編碼重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO:9 ;DNA分子SEQ ID NO:8編碼輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO: 10。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
本發(fā)明應(yīng)用重組人的⑶20蛋白為免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，采用經(jīng)典的細(xì)胞融合技術(shù)，通過ELISA篩選，獲得一株能穩(wěn)定分泌抗⑶20的雜交瘤細(xì)胞株，命名為2F4，亞型鑒定為IgGl，將雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后收集上清，采用Protein A親和層析法對(duì)CD20單抗進(jìn)行純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化后抗體純度在95%以上；ELISA滴度測定結(jié)果顯示，單抗的滴度均在1: 10000以上。人慢性扁桃體炎石蠟切片經(jīng)抗⑶20抗體免疫組化染色，可于光鏡下觀察到可于光鏡下觀察到胞膜出現(xiàn)明顯黃色至棕黃色細(xì)小顆粒，背景清晰，無非特異性著色。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上來看，本發(fā)明制備了高效價(jià)，高特異性的CD20單克隆抗體，用該抗體檢測證實(shí)，其對(duì)細(xì)胞中的CD20蛋白具有高識(shí)別能力，可用于科研或臨床免疫組化檢測⑶20表達(dá)。


圖1 SDS-PAGE分析純化后的⑶20單克隆抗體。圖2 ELISA法測定⑶20單克隆抗體滴度。圖3是免疫組織化學(xué)檢測分析CD20單克隆抗體染色人慢性扁桃體炎石蠟切片。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常施方法。實(shí)施例1:雜交瘤細(xì)胞株2F4及其產(chǎn)生的單克隆抗體的獲得1、抗原制備
(I)獲得目的基因在該實(shí)施例中，根據(jù)⑶20的基因序列(NM_021950.3)的編碼框，設(shè)計(jì)I對(duì)特異引物:引物1:5' -GGATCCATGACAACACCCAGAAA TTCAG-3' (SEQIDN0:1)引物2:5' -CTCGAGTTAAGGA GAGCTGTCAT-3' ; (SEQ ID NO:2)Trizol Reagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴(kuò)增⑶20基·因。(2)構(gòu)建重組表達(dá)載體將步驟(I)獲得的PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入表達(dá)載體PET28a，構(gòu)建重組質(zhì)粒PET28a-CD20。(3)獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種將步驟(2)獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，用含有硫酸卡那霉素的固體培養(yǎng)基篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。測序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進(jìn)入下步操作。以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。(4)誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白純化將步驟(2)提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)，用含有硫酸卡那霉素的固體培養(yǎng)基篩選，挑選單克隆至IOml含有硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，370C，220rpm培養(yǎng)10h，取5ml液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至250ml的大瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD值為0.8，加入0.2mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)，16°C誘導(dǎo)過夜，收集菌液超聲，取上清用N1-NTA瓊脂糖親和層析法純化⑶20蛋白。2、單抗的制備和純化(I)、免疫動(dòng)物—般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行三次免疫注射。首次免疫。純化的重組蛋白⑶20 (用適量生理鹽水稀釋)+完全弗氏佐劑，100 μ g/只，頸背部皮下多點(diǎn)注射；二次免疫(間隔兩周)。純化的重組蛋白⑶20 (用適量生理鹽水稀釋)+不完全弗氏佐劑，IOOyg/只，頸背部皮下多點(diǎn)注射；三次免疫(間隔兩周)。純化的重組蛋白⑶20 (用適量生理鹽水稀釋)，不完全弗氏佐劑，IOOyg/只，頸背部皮下多點(diǎn)注射；三次免疫后7 10天采血，用建立的ELISA法檢測效價(jià)，選擇效價(jià)最高者用于細(xì)胞融合。加強(qiáng)免疫(融合前3天)，用純化的重組蛋白50yg腹腔注射。3天后，取脾臟融合。(2)、細(xì)胞融合采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液。將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合(I: 5 I: 10)，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。采用HAT選擇性培養(yǎng)基，進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)和篩選。
用ELISA方法檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清:以純化的⑶20蛋白(10 μ g/ml)包被酶標(biāo)板，每孔100μ 1，4°C包板過夜。甩掉包被液，加入200 μ I 5%的脫脂奶粉，37°C封閉Ih后，洗滌3次，加雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)檢測上清100 μ I (陰性對(duì)照為PBS100 μ I)，37°C孵育I小時(shí)。洗滌3遍后，加酶標(biāo)記二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37°C孵育I小時(shí)，去掉酶標(biāo)二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50 μ 1，室溫靜置5分鐘，加終止液50 μ I。用酶標(biāo)儀檢測450nm波長處的OD值。OD值明顯高于陰性對(duì)照2倍以上者定為陽性。最后篩選得到一株分泌性能最佳的抗⑶20雜交瘤細(xì)胞株，命名為2F4，亞型鑒定為IgGl。將選出的陽性雜交瘤細(xì)胞株2F4克隆化培養(yǎng)(有限稀釋法)，獲得能產(chǎn)生高效價(jià)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆。將雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存保種。所述的陽性雜交瘤細(xì)胞為抗人CD20雜交瘤細(xì)胞系2F4，該細(xì)胞系已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.6856。(3)單克隆抗 體的大量制備與純化將步驟⑵獲得的細(xì)胞株2F4接種至Balb/c小鼠腹腔，制備腹水，然后從腹水中提取抗體。單克隆抗體⑶20的純化:采用Protein A親和層析法。首先制備protein A親和柱，用PBS平衡柱子后，取抗⑶20的腹水過柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液(PH)洗脫，收集峰值區(qū)的洗脫液，經(jīng)透析濃縮后備用。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化后抗體純度在95%以上(參見圖1)。(4)直接ELISA法測定純化抗體的滴度以純化的⑶20蛋白(10 μ g/ml)包被酶標(biāo)板，每孔100 μ 1，4°C包板過夜。甩掉包被液，加入200μ1 5%的脫脂奶粉，37°C封閉Ih后，洗滌3次，將純化的抗體按1: 200，I: 400，I: 800，I: 1600，I: 3200，I: 6400，I: 12800 進(jìn)行稀釋，以每孔 100 μ I 加入酶標(biāo)板中(陰性對(duì)照為PBSlOOy I)，37°C孵育I小時(shí)。洗滌3遍后，加酶標(biāo)記二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37 °C孵育I小時(shí)，去掉酶標(biāo)二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50μ 1，室溫靜置5分鐘，加終止液50 μ I。用酶標(biāo)儀檢測450nm波長處的OD值。ELISA滴度測定結(jié)果顯示，單抗的滴度均在1: 10000以上(參見圖2)。實(shí)施例2:單克隆抗體免疫組化應(yīng)用用CD20單抗，按常規(guī)法作病理切片，對(duì)人慢性扁桃體炎石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色。具體方法為:(I)脫蠟切片依次置于二甲苯1、I1、III脫蠟每次5分鐘，移至無水乙醇1、II中各浸泡4分鐘，移至95%酒精中浸泡4分鐘，移至85%酒精中浸泡4分鐘，再移至70%酒精中浸泡4分鐘，流水沖洗2分鐘。(2)抗原修復(fù)將已沖洗干凈組織切片放入高壓鍋內(nèi)，加入約3000ml左右的檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(pH6.0)，高火加熱煮沸后調(diào)至低火保持沸騰噴氣3分鐘，關(guān)掉電磁爐開關(guān)，兩分鐘后將高壓鍋移至冷水中冷卻，待高壓鍋內(nèi)抗原修復(fù)液完全冷卻后，打開高壓鍋將組織切片用流水沖洗干凈移至蒸餾水中浸泡2分鐘。
(3)阻斷3 % H2O2中浸泡10分鐘，流水沖洗蒸餾水沖洗。取出切片，擦干組織周圍的水，用免疫組化筆在組織塊周圍畫一圓圈注意圈接頭要接好，防止抗體跑出圈外造成假陰性。PBS緩沖液沖洗。(4)滴加一抗甩去待測組織切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗為實(shí)施例1步驟(3)制備并純化的CD20單克隆抗體，稀釋度為1: 600。放置在孵育盒內(nèi)4°C冰箱中過夜孵育約12小時(shí)。(5)滴加二抗將孵育盒從冰箱取出，恢復(fù)至室溫后取出切片，用PBS洗3次，每次5分鐘。滴加通用型二抗-HRP聚合物。將切片放入孵育濕盒中，蓋上蓋子，連孵育盒一起放入37°C恒溫箱中孵育30分鐘。(6)顯色 、襯染、封片取出切片，擦掉組織周圍的多余的PBS，加入DAB顯色液中顯色3_5分鐘，在顯微鏡下控制染色的強(qiáng)度。待強(qiáng)度適中后將切片置自來水中終止顯色，再用流水沖洗5-10分鐘，蘇木素染液復(fù)染I分鐘，0.5%鹽酸酒精分化3秒鐘，流水沖洗5-10分鐘，脫水、透明、封片、鏡檢。結(jié)果判定:按照國外學(xué)者對(duì)組織中CD20的判定標(biāo)準(zhǔn)，CD20蛋白陽性反應(yīng)為黃到棕黃色細(xì)小顆粒，定位于細(xì)胞膜。人慢性扁桃體炎組織(參見圖3)經(jīng)抗CD20抗體免疫組化染色，可于光鏡下觀察到胞膜出現(xiàn)明顯黃色至棕黃色顆粒，背景清晰，無非特異性著色，說明此⑶20小鼠單克隆抗體可以特異性的應(yīng)用于免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例3:單克隆抗體可變區(qū)測序根據(jù)抗體基因的恒定區(qū)序列合成以下引物:zh09 5' -GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3' (SEQ IDNO:3)zhrll 5' -GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3' (SEQIDNO:4)zl05 5' -GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3' (SEQ IDNO:5)zlr05 5' -GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3' (SEQIDNO:6)Trizol Reagent試劑分別提取5 X IO6雜交瘤細(xì)胞2F4的總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用zh08和zhrll為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增單克隆抗體CD20重鏈可變區(qū)，用zlOl和zlr05為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增單克隆抗體CD20輕鏈可變區(qū)，PCR反應(yīng)均采用熱啟動(dòng)，反應(yīng)條件:94°C 5分鐘；94°C 45秒，60°C 45秒，72°C I分10秒，30個(gè)循環(huán)；72°C 7分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳分離后回收純化目的片段(輕鏈長度391bp，重鏈長度420bp)?？寺〉絇GEM-T(Promega)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl細(xì)胞后在IPTGIX-gal平板上進(jìn)行篩選，取白色菌斑接種于含有氨韋青霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增。篩選陽性克隆，用QIAGEN的質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒并進(jìn)行測序，確定了單克隆抗體CD20的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。單克隆抗體⑶20可變區(qū)的DNA序列和氨基酸序列:單克隆抗體CD20 重鏈可變區(qū) DNA 序列(5' —3'，420bp)(SEQ ID NO:7)；單克隆抗體CD20的輕鏈可變區(qū)DNA序列(5' —3'，395bp) (SEQ ID NO:8)；單克隆抗體CD20重鏈可變區(qū)的推斷氨基酸序列(140氨基酸)(SEQ ID NO:9)；
單克隆抗體CD20輕鏈可變區(qū)的推斷氨基酸序列(131氨基酸)(SEQ 10 ID NO:10)?！?br> 權(quán)利要求
1.一種以原核表達(dá)的CD20蛋白免疫小鼠獲得的分泌CD20單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2F4，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.6856。
2.一種由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株2F4產(chǎn)生的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:9，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:10o
4.一種DNA分子SEQ ID NO:7，它編碼權(quán)利要求3中所述的重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQID NO:9。
5.一種DNA分子SEQ ID NO:8，它編碼權(quán)利要求3中所述的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:10o
全文摘要
一種小鼠抗人CD20單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。所述的分泌CD20單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株克隆號(hào)為2F4，保藏編號(hào)為CGMCC No.6856。本發(fā)明還提供了所述雜交瘤細(xì)胞株2F4產(chǎn)生的單克隆抗體。該抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO9，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO10。本發(fā)明還提供了一種DNA分子SEQ ID NO7，它編碼重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO9；一種DNA分子SEQ ID NO8，它編碼輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO10。該抗體可用于科研或臨床免疫組化檢測CD20表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N5/20GK103173412SQ20121052818
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2012年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月7日
發(fā)明者張林剛, 郗日沫, 尹芝南 申請(qǐng)人:天津三箭生物技術(shù)有限公司