一種磁分離式細胞三維共培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及再生醫(yī)學領(lǐng)域，是一種磁分離式細胞三維共培養(yǎng)方法。本發(fā)明將誘導細胞以及磁介質(zhì)微粒共同包埋在海藻酸鈉微膠囊中，該微膠囊再與包埋有干細胞的海藻酸鈣微膠珠在同一體系中進行非接觸式三維共培養(yǎng)，利用微膠囊內(nèi)誘導細胞分泌的可溶性因子對干細胞的定向分化進行調(diào)控，在共培養(yǎng)結(jié)束后，采用磁場對微膠囊與微膠珠進行分離，并且利用檸檬酸鈉溶液可溶解微膠珠，進一步收獲純凈的分化細胞。本發(fā)明操作簡單，成本低，微膠囊和微膠珠可為細胞提供近似體內(nèi)的三維生長環(huán)境，微膠囊膜可使誘導細胞分泌的誘導因子透過微膠囊作用于干細胞，并同時實現(xiàn)不同類型細胞的免疫隔離，磁介質(zhì)微粒和磁分離裝置則有利于誘導細胞和分化后細胞的分離和收獲。
【專利說明】一種磁分罔式細胞三維共培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及再生醫(yī)學領(lǐng)域，是一種磁分離式細胞三維共培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人體內(nèi)各種組織、器官均由多種細胞構(gòu)成，不同類型細胞之間存在復雜的相互作用，這種相互作用維持了組織、器官，乃至整個人體的正常生理功能。細胞共培養(yǎng)技術(shù)利用特殊手段，將不同類型的細胞在體外進行共培養(yǎng)，便于觀察不同類型細胞之間的相互作用，尤其能夠根據(jù)具體需要，構(gòu)建近似于體內(nèi)特異組織的分化微環(huán)境，即利用誘導細胞實現(xiàn)對干細胞定向分化的調(diào)控，在再生醫(yī)學領(lǐng)域具有重要的研究與應(yīng)用前景。
[0003]非接觸式細胞共培養(yǎng)體系由于克服了直接接觸共培養(yǎng)體系存在的多種細胞相互污染的問題，因此具有臨床應(yīng)用潛力，目前使用較多的非接觸式細胞共培養(yǎng)體系為transwell，它使用聚碳酸酯等多孔薄膜將兩種以二維方式生長的細胞分隔開進行共培養(yǎng)，多孔膜允許細胞分泌的因子自由通過，而細胞不能發(fā)生混合。然而，以transwell為代表的二維細胞共培養(yǎng)體系存在著明顯的缺陷:1)細胞以二維方式生長，使得細胞丟失了其在體內(nèi)時的正常生理功能；2)不能有選擇地調(diào)控能夠透過多孔膜的因子類型；3)傳質(zhì)效率低，存在嚴重物質(zhì)濃度梯度；4)基于24孔板或6孔板，不適合動態(tài)共培養(yǎng)，不能實現(xiàn)規(guī)模化放大；5 )價格昂貴，實驗成本增加。
[0004]由于現(xiàn)有細胞二維共培養(yǎng)體系存在上述主要缺陷，嚴重限制了細胞共培養(yǎng)技術(shù)的進一步發(fā)展，因此急需研發(fā)便捷實用的體外細胞三維共培養(yǎng)新方法，以滿足細胞三維方式生長、多孔膜截留分子量可控、傳質(zhì)效率高、可動態(tài)規(guī)模化共培養(yǎng)以及可實現(xiàn)不同類型細胞之間徹底分離等具體要求，進一步提高干細胞體外定向分化效率，促進細胞共培養(yǎng)技術(shù)在再生醫(yī)學領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用?！?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種磁分離式細胞三維共培養(yǎng)方法，其能實現(xiàn)誘導細胞和干細胞在三維條件下共培養(yǎng)，利用誘導細胞分泌的可溶性因子對干細胞的定向分化進行調(diào)控，同時也實現(xiàn)了不同類型細胞之間的分離，可獲得純凈的分化后細胞。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]將誘導細胞以及磁介質(zhì)微粒共同包埋在海藻酸鈉微膠囊中，該微膠囊再與包埋有干細胞的海藻酸鈣微膠珠在同一體系中進行非接觸式三維共培養(yǎng)，利用微膠囊內(nèi)誘導細胞分泌的可溶性因子對干細胞的定向分化進行調(diào)控，在共培養(yǎng)結(jié)束后，采用磁場對微膠囊與微膠珠進行分離，并且利用檸檬酸鈉溶液可溶解微膠珠，進一步收獲純凈的分化細胞。
[0008]所述干細胞包括胚胎干細胞、iPS細胞、或間充質(zhì)干細胞，誘導細胞包括體細胞或細胞系；
[0009]干細胞和誘導細胞可以是同源同種細胞、同源異種細胞、異源異種細胞；
[0010]調(diào)控干細胞向神經(jīng)細胞分化的誘導細胞包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、髓鞘細胞、或神經(jīng)組織來源的腫瘤細胞系；
[0011]調(diào)控干細胞向心肌細胞分化的誘導細胞包括；原代心肌細胞或心肌細胞系；
[0012]調(diào)控干細胞向肝細胞分化的誘導細胞包括原代肝實質(zhì)細胞、原代內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮細胞系、肝星狀細胞、成纖維細胞、3T3細胞系、或肝組織來源的腫瘤細胞系；
[0013]調(diào)控干細胞向胰島細胞分化的誘導細胞包括原代胰島或胰島細胞；
[0014]調(diào)控干細胞向成骨細胞分化的誘導細胞包括原代成骨細胞或骨組織來源的腫瘤細胞系；
[0015]調(diào)控干細胞向軟骨細胞分化的誘導細胞包括原代軟骨細胞或軟骨細胞系；
[0016]調(diào)控干細胞向脂肪細胞分化的誘導細胞為原代脂肪細胞。
[0017]所述定向分化包括干細胞向神經(jīng)、心肌、肝、胰島、成骨、軟骨、或脂肪組織的細胞定向分化。
[0018]所述的磁介質(zhì)微粒，其粒徑在IOnnTlOO μ m,磁介質(zhì)微粒包括鐵磁性物質(zhì)和順磁性物質(zhì)；
[0019]鐵磁性物質(zhì)為鐵、鎳、鈷、或包含鐵、鎳、鈷元素中一種或二種以上的合金；
[0020]順磁性物質(zhì)為鐵氧化合物或錳。
[0021]海藻酸鈉微膠囊 中磁介質(zhì)微粒含量為0.01-5mg/ml膠囊。
[0022]所述海藻酸鈉微膠囊為海藻酸鈉/聚賴氨酸微膠囊或海藻酸鈉/殼聚糖微膠囊，直徑范圍為200-2000微米；
[0023]所述海藻酸鈣微膠珠由海藻酸鈉和鈣離子反應(yīng)形成，直徑范圍200-2000微米；
[0024]海藻酸鈉的分子量為lOO-lOOOkDa，G/Μ比范圍為0.2_3，且海藻酸鈉為未修飾海藻酸鈉、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修飾海藻酸鈉、異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(IKVAV)修飾海藻酸鈉、酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸(YIGSR)修飾海藻酸鈉中一種或二種以上的海藻酸鈉；
[0025]海藻酸鈉微膠囊以及海藻酸鈣微膠珠含有膠原、硫酸軟骨素、或透明質(zhì)酸，其中海藻酸鈉所占的質(zhì)量比例為40%-100% ；
[0026]所述非接觸式三維共培養(yǎng)的培養(yǎng)容器為靜態(tài)培養(yǎng)或生物反應(yīng)器；
[0027]靜態(tài)培養(yǎng)指在培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、或培養(yǎng)袋中培養(yǎng)；
[0028]生物反應(yīng)器包括旋轉(zhuǎn)式反應(yīng)器、灌注式反應(yīng)器、攪拌式反應(yīng)器、或氣升式反應(yīng)器。
[0029]所述采用磁場對微膠囊與微膠珠進行分離設(shè)備為磁分離裝置，磁分離裝置的磁場可使得含有磁介質(zhì)微粒和誘導細胞的微膠囊發(fā)生偏轉(zhuǎn)，磁分離裝置包括磁場裝置、管道以及收集裝置；收集裝置包括兩個收集器皿；
[0030]共培養(yǎng)結(jié)束后，微膠囊與微膠珠的混合懸液被加入到磁分離裝置的物料進口管路，進口管路下方連接一存儲容器，存儲容器下方連接有一物料出口管路，物料出口管路的另一端與一個收集器皿相連；
[0031]于物料出口管路上設(shè)有一分支管路，于物料出口管路與分支管路的連接處設(shè)有一磁場裝置，由磁場裝置提供一從連接處至分支管路方向的磁場；分支管路與另一個收集器皿相連；
[0032]磁場裝置為永磁體、電磁線圈或電磁鐵。
[0033]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:[0034]1.操作簡單，成本低。本發(fā)明利用海藻酸鈉微膠囊和海藻酸鈣微膠珠作為細胞三維培養(yǎng)載體，利用磁介質(zhì)微粒以及磁分離裝置來去除含有誘導細胞的微膠囊，制備簡單，避免使用昂貴材料和工藝；
[0035]2.能夠很好地模擬體內(nèi)特異組織三維分化微環(huán)境，提高干細胞分化效率。一方面，微膠囊和微膠珠可為細胞提供近似體內(nèi)的三維生長微環(huán)境，實現(xiàn)細胞高活性、高功能生長；另一方面，誘導細胞和干細胞的共培養(yǎng)方式進一步模擬了體內(nèi)組織成熟細胞和干細胞之間的相互作用，從而本發(fā)明實現(xiàn)干細胞在近似體內(nèi)組織環(huán)境中的定向分化，除了分化效果的提高，還避免了有毒性化學誘導劑以及昂貴生長因子組合的使用；
[0036]3.能夠?qū)崿F(xiàn)誘導細胞和分化細胞的分離和收獲，保證應(yīng)用的安全性。微膠囊膜能夠?qū)⒄T導細胞和干細胞進行免疫隔離，避免了兩者的直接接觸和免疫反應(yīng)，且共培養(yǎng)結(jié)束后，磁分離裝置的磁場使得含有磁性介質(zhì)微粒的微膠囊發(fā)生偏轉(zhuǎn)，集中收集到收集器中，從而實現(xiàn)微膠囊與微膠珠的徹底分離，此外使用檸檬酸鈉鹽溶液可溶解海藻酸鈣微膠珠，通過離心可在生理條件下收獲分化細胞；
[0037]4.可實現(xiàn)動態(tài)規(guī)?；毎S共培養(yǎng)。由于微膠囊和微膠珠體積小，密度低，表面積大，容易懸浮，因此尤其適合在生物反應(yīng)器中進行動態(tài)三維共培養(yǎng)，加強調(diào)控因子的質(zhì)量傳遞，進一步提高共培養(yǎng)效果；
[0038]5.應(yīng)用范圍廣。由于微膠囊的免疫隔離特性，本發(fā)明方法可使用異體、異種的誘導細胞進行共培養(yǎng)；可促進干細胞向神經(jīng)、心肌、肝、胰島、成骨、軟骨、或脂肪組織細胞分化，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1為磁分離式細胞三維共培養(yǎng)體系示意圖:培養(yǎng)容器1，海藻酸鈉微膠囊2，誘導細胞3，磁介質(zhì)微粒4，海藻酸鈣微膠珠5，干細胞6 ；
[0040]圖2為磁分離裝置示意圖:物料進口管路7，存儲容器8，物料出口管路9，收集器皿10，分支管路11，磁場裝置12，收集器皿13 ；
[0041]圖3為細胞三維共培養(yǎng)促進干細胞向神經(jīng)前體細胞定向分化照片:圖3A為含有人神經(jīng)母細胞瘤細胞、Fe3O4磁性顆粒的微膠囊與包埋干細胞的微膠珠共培養(yǎng)時照片；圖3B為共培養(yǎng)結(jié)束后經(jīng)磁分離裝置收集的含有神經(jīng)前體細胞的微膠珠；
[0042]圖4為三維動態(tài)共培養(yǎng)、三維靜態(tài)共培養(yǎng)以及二維靜態(tài)共培養(yǎng)體系中分化細胞的Nestin基因表達情況；
[0043]圖5為三維動態(tài)共培養(yǎng)、三維靜態(tài)共培養(yǎng)以及二維靜態(tài)共培養(yǎng)體系中Nestin陽性細胞百分比；
[0044]圖6為三維共培養(yǎng)、二維共培養(yǎng)體系中肝細胞的白蛋白基因表達；
[0045]圖7為三維共培養(yǎng)、二維共培養(yǎng)體系中肝細胞的白蛋白分泌能力對比。
【具體實施方式】
[0046]所述采用磁場對微膠囊與微膠珠進行分離設(shè)備為磁分離裝置，磁分離裝置的磁場可使得含有磁介質(zhì)微粒和誘導細胞的微膠囊發(fā)生偏轉(zhuǎn)，磁分離裝置包括磁場裝置、管道以及收集裝置；收集裝置包括兩個收集器皿；[0047]共培養(yǎng)結(jié)束后，微膠囊與微膠珠的混合懸液被加入到磁分離裝置的物料進口管路，進口管路下方連接一存儲容器，存儲容器下方連接有一物料出口管路，物料出口管路的另一端與一個收集器皿相連；
[0048]于物料出口管路上設(shè)有一分支管路，于物料出口管路與分支管路的連接處設(shè)有一磁場裝置，由磁場裝置提供一從連接處至分支管路方向的磁場；分支管路與另一個收集器皿相連；
[0049]磁場裝置為永磁體、電磁線圈或電磁鐵。
[0050]實施例1:磁分離式細胞三維共培養(yǎng)體系誘導干細胞定向分化為神經(jīng)前體細胞
[0051]制備精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)、異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(IKVAV)、酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸(HGSR)多肽修飾的海藻酸鈉。將海藻酸鈉(分子量430kDa，古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比1.5)溶解于含有0.5M NaCl的
0.1M 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液中(pH值6.5)，得到1%(W/V)海藻酸鈉溶液。再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)和單一種類的多肽，室溫攪拌反應(yīng)24小時。EDC和海藻酸鈉摩爾比為1:20，EDC和sulfo-NHS摩爾比為2:1，多肽和海藻酸鈉質(zhì)量比為1:1000。然后進行透析并冷凍干燥，從而得到不同種類多肽修飾的海藻酸鈉。之后，將上述三種多肽修飾的海藻酸鈉粉末分別溶解于生理鹽水中，溶液濃度均為1.5%(W/V)，并配置體積比為1:1:1的三種多肽修飾海藻酸鈉的混合溶液，混合溶液終濃度仍為1.5%(ff/V)。
[0052]將人神經(jīng) 母細胞瘤細胞、Fe3O4磁性顆粒與1.5% (W/V)的RGD單獨修飾海藻酸鈉溶液混合，調(diào)整細胞密度為2 X IO6ceIls.ml/1，磁性顆粒質(zhì)量濃度為2mg.ml/1，將該懸液經(jīng)過注射器泵滴入IOOmmol.L^1CaCl2溶液中鈣化20min，得到海藻酸鈣微膠珠。將海藻酸鈣微膠珠與0.05%(ff/V)的聚賴氨酸反應(yīng)成膜lOmin，形成非液化的海藻酸鈉/聚賴氨酸微膠囊，再與0.15%(ff/V)海藻酸鈉溶液反應(yīng)5min，最后用55mmol噸―1檸檬酸鈉液化5min，就得到了包埋有人神經(jīng)母細胞瘤細胞以及磁性介質(zhì)微粒的海藻酸鈉/聚賴氨酸/海藻酸鈉微膠囊。將此微膠囊使用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌3次，之后按1:10的體積比(微膠囊:培養(yǎng)液)加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天。
[0053]將第6代人臍帶間充質(zhì)干細胞與上述1.5%(ff/V)含有RGD、IKVAV以及YIGSR三種多肽修飾海藻酸鈉混合溶液進行混合，調(diào)整細胞密度為4X IO6Cells 將該細胞懸液經(jīng)過注射器泵滴入IOOmmol -L^1CaCl2溶液中鈣化20min，得到含有干細胞的海藻酸鈣微膠珠，使用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌3次，再加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天。
[0054]將含有干細胞的微膠珠以及包埋基質(zhì)細胞和磁性顆粒的微膠囊混合接種在培養(yǎng)瓶或攪拌式生物反應(yīng)器中，分別進行三維靜態(tài)以及動態(tài)共培養(yǎng)。反應(yīng)器內(nèi)工作體積為50ml，干細胞起始接種密度為2X IO5ceIls -mr1培養(yǎng)液，兩種細胞初始接種數(shù)量之比為1:1，攪拌速度50rpm,培養(yǎng)瓶初始細胞接種密度與反應(yīng)器相同,培養(yǎng)體積15ml,兩種體系均置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的DMEM/F12，每三天換液，共培養(yǎng)6天。另外，將相同接種密度的干細胞以及基質(zhì)細胞接種到Transwell體系中，作為細胞二維共培養(yǎng)對照組。
[0055]共培養(yǎng)6天之后,使用培養(yǎng)液將培養(yǎng)瓶與反應(yīng)器內(nèi)含有微囊與膠珠的混合液沖洗出來，分別收集在50ml離心管中，將此混合液加入到磁分離裝置中，依靠磁場將含有磁性顆粒的微膠囊與微膠珠收集到下方不同的收集器皿中，從而實現(xiàn)兩種載體的徹底分離。之后，使用培養(yǎng)液將含有分化細胞的微膠珠洗滌3次，加入微膠珠體積10倍的55mmol.L-1檸檬酸鈉溶液處理lOmin，以溶解微膠珠，之后離心收獲分化細胞；利用胰酶收集Transwell體系中的干細胞。然后，利用real-time PCR分析細胞二維共培養(yǎng)、三維靜態(tài)以及動態(tài)共培養(yǎng)體系所獲得分化細胞的神經(jīng)前體細胞標志Nestin基因表達以及Nestin陽性細胞的百分比。實驗結(jié)果見圖3-5，結(jié)果顯示，三維靜態(tài)共培養(yǎng)體系優(yōu)于二維靜態(tài)共培養(yǎng)體系，其Nestin陽性細胞百分比約為40% ;三維動態(tài)共培養(yǎng)獲得的分化細胞與三維靜態(tài)共培養(yǎng)相t匕，其Nestin的基因表達與陽性細胞百分比進一步升高，Nestin陽性細胞百分比約為50%，這說明細胞三維共培養(yǎng)體系與傳統(tǒng)二維共培養(yǎng)體系相比顯著促進了干細胞向神經(jīng)前體細胞分化，動態(tài)培養(yǎng)條件的使用則強化了這一分化過程。
[0056]實施例2:磁分離式細胞三維共培養(yǎng)體系誘導干細胞定向分化為肝細胞
[0057]RGD修飾海藻酸鈉的制備方法同上述實施例1。
[0058]將人內(nèi)皮細胞、Fe3O4磁性顆粒包埋于使用RGD修飾海藻酸鈉所制備的微膠囊中，具體制備與培養(yǎng)方法同實施例1，培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的DMEM。
[0059]將第5代人臍帶間充質(zhì)干細胞包埋于RGD修飾的微膠珠中，制備與培養(yǎng)方法同實施例I，培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的DMEM。
[0060]將含有干細胞的微膠珠以及包埋內(nèi)皮細胞和磁性顆粒的微膠囊混合接種在培養(yǎng)瓶中，進行三維靜態(tài)共培養(yǎng)，干細胞起始接種密度為2X IO5ceIls -mr1培養(yǎng)液，兩種細胞初始接種數(shù)量之比為1:1，培養(yǎng)體積15ml，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的DMEM，每三天換液，共培養(yǎng)7天。另外，將普通二維生長的干細胞以及相同細胞接種密度的Transwell 二維共培養(yǎng)體系作為兩個對照組。
[0061]共培養(yǎng)7天之后，三維共培養(yǎng)組中內(nèi)皮細胞的去除以及目的細胞的收集方法同實施例I，普通二維生長的干細胞以及二維共培養(yǎng)對照組則利用胰酶消化收集細胞，分析細胞三維共培養(yǎng)、二維共培養(yǎng)以及普通二維培養(yǎng)條件下細胞白蛋白基因表達和外泌水平。實驗結(jié)果見圖6和7，結(jié)果顯示，在肝細胞白蛋白的基因以及分泌功能上，三維共培養(yǎng)體系優(yōu)于二維共培養(yǎng)體系，這說明細胞三維共培養(yǎng)體系促進了干細胞向肝細胞的體外定向分化，提聞了相關(guān)功能表達。
【權(quán)利要求】
1.一種磁分離式細胞三維共培養(yǎng)方法，其特征在于:將誘導細胞以及磁介質(zhì)微粒共同包埋在海藻酸鈉微膠囊中，該微膠囊再與包埋有干細胞的海藻酸鈣微膠珠在同一體系中進行非接觸式三維共培養(yǎng)，利用微膠囊內(nèi)誘導細胞分泌的可溶性因子對干細胞的定向分化進行調(diào)控，在共培養(yǎng)結(jié)束后，采用磁場對微膠囊與微膠珠進行分離，并且利用檸檬酸鈉溶液可溶解微膠珠，進一步收獲純凈的分化細胞。
2.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述干細胞包括胚胎干細胞、iPS細胞、或間充質(zhì)干細胞,誘導細胞包括體細胞或細胞系; 干細胞和誘導細胞可以是同源同種細胞、同源異種細胞、異源異種細胞； 調(diào)控干細胞向神經(jīng)細胞分化的誘導細胞包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、髓鞘細胞、或神經(jīng)組織來源的腫瘤細胞系； 調(diào)控干細胞向心肌細胞分化的誘導細胞包括；原代心肌細胞或心肌細胞系； 調(diào)控干細胞向肝細胞分化的誘導細胞包括原代肝實質(zhì)細胞、原代內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮細胞系、肝星狀細胞、成纖維細胞、3T3細胞系、或肝組織來源的腫瘤細胞系； 調(diào)控干細胞向胰島細胞分化的誘導細胞包括原代胰島或β_胰島細胞； 調(diào)控干細胞向成骨細胞分化的誘導細胞包括原代成骨細胞或骨組織來源的腫瘤細胞系; 調(diào)控干細胞向軟骨細胞分化的誘導細胞包括原代軟骨細胞或軟骨細胞系； 調(diào)控干細胞向脂肪細胞分化的 誘導細胞為原代脂肪細胞。
3.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述定向分化包括干細胞向神經(jīng)、心肌、肝、胰島、成骨、軟骨、或脂肪組織的細胞定向分化。
4.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述的磁介質(zhì)微粒，其粒徑在IOnm~100 μ m,磁介質(zhì)微粒包括鐵磁性物質(zhì)和順磁性物質(zhì)； 鐵磁性物質(zhì)為鐵、鎳、鈷、或包含鐵、鎳、鈷元素中一種或二種以上的合金； 順磁性物質(zhì)為鐵氧化合物或錳。
5.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于: 海藻酸鈉微膠囊中磁介質(zhì)微粒含量為0.01-5mg/ml膠囊。
6.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述海藻酸鈉微膠囊為海藻酸鈉/聚賴氨酸微膠囊或海藻酸鈉/殼聚糖微膠囊，直徑范圍為200-2000微米； 所述海藻酸鈣微膠珠由海藻酸鈉和鈣離子反應(yīng)形成，直徑范圍200-2000微米； 海藻酸鈉的分子量為lOO-lOOOkDa，G/Μ比范圍為0.2_3，且海藻酸鈉為未修飾海藻酸鈉、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修飾海藻酸鈉、異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(IKVAV)修飾海藻酸鈉、酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸(HGSR)修飾海藻酸鈉中一種或二種以上的海藻酸鈉； 海藻酸鈉微膠囊以及海藻酸鈣微膠珠含有膠原、硫酸軟骨素、或透明質(zhì)酸，其中海藻酸鈉所占的質(zhì)量比例為40% -100% ；
7.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述非接觸式三維共培養(yǎng)的培養(yǎng)容器為靜態(tài)培養(yǎng)或生物反應(yīng)器； 靜態(tài)培養(yǎng)指在培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、或培養(yǎng)袋中培養(yǎng)； 生物反應(yīng)器包括旋轉(zhuǎn)式反應(yīng)器、灌注式反應(yīng)器、攪拌式反應(yīng)器、或氣升式反應(yīng)器。
8.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述采用磁場對微膠囊與微膠珠進行分離設(shè)備為磁分離裝置，磁分離裝置的磁場可使得含有磁介質(zhì)微粒和誘導細胞的微膠囊發(fā)生偏轉(zhuǎn)，磁分離裝置包括磁場裝置、管道以及收集裝置；收集裝置包括兩個收集器皿； 共培養(yǎng)結(jié)束后，微膠囊與微膠珠的混合懸液被加入到磁分離裝置的物料進口管路(7)，進口管路下方連接一存儲容器(8)，存儲容器下方連接有一物料出口管路(9)，物料出口管路的另一端與一個收集器皿(10)相連； 于物料出口管路上設(shè)有一分支管路(11)，于物料出口管路與分支管路的連接處設(shè)有一磁場裝置(12)，由磁場裝置提供一從連接處至分支管路方向的磁場；分支管路與另一個收集器皿(13)相連； 磁場裝置為永磁體、電·磁線圈或電磁鐵。
【文檔編號】C12N5/079GK103849593SQ201210528245
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月6日
【發(fā)明者】馬小軍, 劉洋, 劉暢, 陳立, 孫廣煒, 張英, 于煒婷 申請人:中國科學院大連化學物理研究所