專利名稱：一株用于肉制品發(fā)酵劑的具有ace抑制活性的菌株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー株地衣芽孢桿菌。
背景技術：
高血壓是世界性難題，影響15-20%的成年人健康。在控制人體血壓的多種因素
中，腎素-血管緊張素調(diào)節(jié)系統(tǒng)(Renia-angiotensin system,RAS)和激肽釋放酶-激
肽系統(tǒng)(Kallikrein-kininsystem, KKS)是人體內(nèi)兩種重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。其中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)是系統(tǒng)調(diào)節(jié)過程中起關鍵作用的酶，是使血壓升高的主要因素。抑制ACE的活性，就能有效的防治和治療高血壓的發(fā)生?，F(xiàn)在已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)有些食物中含有降血壓肽，但種類有限，而利用微生物法生產(chǎn)的發(fā)酵食品就可以解決具有ACE抑制活性的降血壓肽受到食物來源及食物品種限制的不足。通過人為在食品中添加微生物，開發(fā)具有抗高血壓功能的健康食品。在微生物的作用下，食品中無生物活性的前體物質(zhì)在微生物與酶的作用下被釋放出來，使食品具有ACE抑制活性，產(chǎn)生具有ACE活性抑制肽，即降血壓肽。源于食品的降血壓肽與化學合成的降壓藥相比，有極高的安全性。而且這些肽屬于生物活性肽，只對高血壓患者起降血壓作用，對血壓正常者則無降壓作用，這種降壓作用的選擇性是普通的化學合成降壓藥所不具備的。利用微生物生產(chǎn)降血壓保健產(chǎn)品是國內(nèi)外發(fā)展的ー種趨勢。國內(nèi)外已篩選出了一些降壓微生物——乳酸菌。其中主要以瑞士乳桿菌為主。保加利亞乳桿菌和干酪乳桿菌的某些菌株也被測出了含有 ACE抑制活性。除乳酸菌外，國內(nèi)外沒看見有其它產(chǎn)ACE抑制活性微生物的研究。因此，篩選開發(fā)具有ACE抑制活性的微生物菌株，具有十分重要的研究和利用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一株用于肉制品發(fā)酵劑的具有ACE抑制活性的菌株。本發(fā)明用于肉制品發(fā)酵劑的具有ACE抑制活性的菌株，它為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) F2,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2012年9月18日，保藏編號為 CGMCC No. 6574。本發(fā)明中用于肉制品發(fā)酵劑的具有ACE抑制活性的菌株，它為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) F2，它在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中生長良好，呈梅花型水樣菌落，菌落大小為5. 0 7. 0mm，邊緣不整，在營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上呈蹼狀；它為革蘭氏陽性桿菌，
有芽孢，菌體大小為U 3丨|.1:1_廣ぺリ丨1.11.い><リ:丨yuii 彳)。本發(fā)明中用于肉制品發(fā)酵劑的具有ACE抑制活性的菌株，它為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) F2,具有顯著的蛋白酶活性,對金黃色葡萄球菌抑菌效果明顯，對志賀氏菌、沙門氏菌及大腸桿菌有抑菌效果。
本發(fā)明中用于肉制品發(fā)酵劑的具有ACE抑制活性的菌株，它為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) F2，它的生長溫度為25 40°C，最適生長溫度為37°C;它在濃度為6%的食鹽中正常生長；它能在含亞硝酸鹽100mg/kg的亞硝酸鹽培養(yǎng)基中生長；它在pH值為4. 5 8內(nèi)均能生長，不產(chǎn)酸。本發(fā)明中用于肉制品發(fā)酵劑的具有ACE抑制活性的菌株，它為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) F2,其 ITS 序列與 GenBank 中登錄的地衣芽抱桿菌{BacillusIicheniformis) HM006901.1的基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性為99. 9%,結(jié)合形態(tài)學觀察結(jié)果，確定地衣芽孢桿菌^Bacillus licheniformis) F2屬于芽孢桿菌屬的ー個新種。本發(fā)明中用于肉制品發(fā)酵劑的具有ACE抑制活性的菌株，它為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) F2,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2012年9月18日，保藏編號為 CGMCC No. 6574。本發(fā)明用于肉制品發(fā)酵劑的具有ACE抑制活性的菌株，它為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) F2，其ACE抑制率為83. 13%。它的最適生長溫度為37°C;它能耐受6%的NaCl及100mg/kg的亞硝酸鹽,不產(chǎn)酸。同時，它具有顯著的蛋白酶活性，對金黃色葡萄球菌抑菌效果明顯，對志賀氏菌、沙門氏菌及大腸桿菌有抑菌效果，因此，本發(fā)明中用于肉制品發(fā)酵劑的具有ACE抑制活性的菌株,即地衣芽孢桿菌{Bacillus licheniformis)F2，它作為發(fā)酵劑菌株，在合適的條件下，可以和其他菌株協(xié)同作用生產(chǎn)發(fā)酵食品，或単獨生產(chǎn)具有ACE抑制活性的食品或菌劑。


圖1為具體實施方式
一中純菌株F2 連接到PMD19-T載體中的PCR鑒定結(jié)果圖，其中1-7泳道分別為F2的7個轉(zhuǎn)化菌落PCR產(chǎn)物，M泳道為DNA Marker ；
圖2為具體實施方式
一中純菌株F2與地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)HM006901.1的16S基因序列分析結(jié)果 圖3為具體實施方式
一中純菌株F2在不同pH條件下吸光度值的曲線 圖4為具體實施方式
一中純菌株F2的生長與溫度關系的曲線圖。
具體實施例方式 本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式用于肉制品發(fā)酵劑的具有ACE抑制活性的菌株，它為地衣芽孢桿菌Qkicillus licheniformis) F2,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2012年9月18日，保藏編號為CGMCC No. 6574。本實施方式中具體的保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼為100101。地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) F2的分類命名為地衣芽抱桿菌Bacillus licheniformis。本實施方式中用于肉制品發(fā)酵劑的具有ACE抑制活性的菌株，該菌株自用傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的發(fā)酵豆中分離純化得到，其樣本現(xiàn)存于黑龍江八ー農(nóng)墾大學微生物實驗室；它按以下步驟進行分離純化培養(yǎng)1、培養(yǎng)基
營養(yǎng)瓊脂(g/L):蛋白胨10. 0g、牛肉粉3. 0g、氯化鈉5. 0g、瓊脂15. 0g、蒸餾水1000mL、pH值7. 3±0. 1，121°C高壓滅菌15分鐘。營養(yǎng)肉湯(g/L):蛋白胨lO.Og、牛肉粉3.0g、氯化鈉5.0g、蒸懼水lOOOmL、pH值7. 2±0. 2，121°C高壓滅菌15分鐘。酪蛋白培養(yǎng)基I1:酪蛋白lg、酵母浸膏l(xiāng)g、氯化鈉Sg、瓊脂粉4g、蒸餾水200mL，pH值 7. 2 7. 4。脂肪酶活性檢測培養(yǎng)基I1:15%豬油、0. 2g中性紅指示劑、IOOmL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。2、試劑
血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE) A-2580、馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL) (Sigma公司);pMD19_T載體、DL2000 DNA Marker (TaKaRa 公司)。硼酸緩沖液用去離子水配制，其中含硼酸100 mmol/L,NaCl 300 mmol/L，然后用6 mol/L NaOH 調(diào)整 pH 值至 8. 3。ACE液用去離子水溶解，配成0.1 U/mL。馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)溶液溶于硼酸鹽緩沖液，配制成5 mmo/L的溶液。3、方法發(fā)酵豆采用稀釋涂布法接種于營養(yǎng)瓊脂平板中，37°C培養(yǎng)24h，然后將生長出的菌落用營養(yǎng)瓊脂平板進ー步分離純化得到純菌株，命名為純菌株F2。抑制率測定
純菌株F2接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，取培養(yǎng)液離心(4000 rpm, 5min)后取上清液用NaOH調(diào)整pH值到8. 3，根據(jù)表1，將各試劑加入到試管中，在37°C水浴中反應30min，反應結(jié)束后馬上加入ImoL/L HCl以終止反應，然后各試管中加入こ酸こ酯1. 5mL,旋渦混合后進行離心(4000rpm，IOmin);吸取1. OmLこ酸こ酯于另ー試管中，放入真空烘箱中，100°C揮發(fā)溶劑30min，冷卻后加入去離子水3mL，旋渦混合后用紫外分光光度計在228nm測定其吸光值，按以下公式計算ACE抑制率。
權利要求
1.一株用于肉制品發(fā)酵劑的具有ACE抑制活性的菌株，其特征在于它為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) F2,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2012年9月18日，保藏編號為 CGMCC No. 6574。
全文摘要
一株用于肉制品發(fā)酵劑的具有ACE抑制活性的菌株，它涉及地衣芽孢桿菌。用于肉制品發(fā)酵劑的具有ACE抑制活性的菌株為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)F2，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012年9月18日，保藏編號為CGMCC No.6574。本發(fā)明中菌株F2，其ACE抑制率為83.13%，能耐受6%的NaCl及100mg/kg的亞硝酸鹽，不產(chǎn)酸；它具有顯著的蛋白酶活性，對金黃色葡萄球菌抑菌效果明顯，它作為發(fā)酵劑菌株，在合適的條件下，可以和其他菌株協(xié)同作用生產(chǎn)發(fā)酵食品，或單獨生產(chǎn)具有ACE抑制活性的食品或菌劑。
文檔編號C12R1/10GK103045505SQ201210528248
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月11日 優(yōu)先權日2012年12月11日
發(fā)明者俞龍浩, 王欣, 李艷青, 薛冰, 孟質(zhì)文 申請人:黑龍江八一農(nóng)墾大學