專利名稱：一種發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葡萄糖氧化酶(β-D-glucose:oxygenl-oxidoreductase;EC I. I. 2. 3. 4,簡(jiǎn)稱GOD)，是一種富含糖基的黃體蛋白，它能夠在有氧氣的條件下專一性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫。葡萄糖氧化酶(GOD)是生物領(lǐng)域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks將GOD固定在Clark氧電極表面，將其應(yīng)用于血糖測(cè)定以來，GOD被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等許多相關(guān)領(lǐng)域。
在食品工業(yè)中，由于氧的存在，引起許多不利于產(chǎn)品質(zhì)量的化學(xué)反應(yīng)，并為許多微生物生長(zhǎng)創(chuàng)造了條件。目前，許多國(guó)家已將GOD作為工人的安全抗氧劑而廣泛應(yīng)用于各種食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成過氧化氫、形成葡萄糖酸四個(gè)方面。利用其專一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析儀，能快速準(zhǔn)確簡(jiǎn)易地測(cè)定各種食品中的葡萄糖含量，指導(dǎo)生產(chǎn)。在醫(yī)藥工業(yè)中，GOD作為試劑盒、酶電極等用于血清(漿)、尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；G0D制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑、牙垢和齲齒的形成防止口腔疾病和牙病的發(fā)生。此外，由于可以催化生成過氧化氫，還可用于對(duì)過氧化氫敏感的淋巴瘤的導(dǎo)向目標(biāo)的治療。GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動(dòng)物腸道環(huán)境，調(diào)節(jié)飼糧消化，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。含葡萄糖氧化酶、乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑，可用于預(yù)防牲畜胃腸道感染、腹瀉，并有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)作用。GOD廣泛地分布于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，但由于微生物具有生長(zhǎng)繁殖速度快，來源廣等特點(diǎn)使之成為葡萄糖氧化酶的主要來源。從動(dòng)植物組織中提取GOD有一定的局限，酶量亦不豐富；細(xì)菌GOD產(chǎn)酶量少；一般采用黑曲霉(具有GRAS資格)和青霉屬菌株作為GOD生產(chǎn)菌。產(chǎn)量低、酶活低、檢測(cè)方法復(fù)雜是GOD產(chǎn)業(yè)化的限制性因素。葡萄糖氧化酶大規(guī)模生產(chǎn)廣泛采用黑曲霉或青霉發(fā)酵，但青霉和黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生過氧化氫酶，纖維素酶，淀粉酶等其他多種副產(chǎn)物，大量的雜蛋白對(duì)后期的分離純化工作造成很大的困難，也增加了生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，以一種產(chǎn)葡萄糖氧化酶的基因工程菌為生產(chǎn)菌株，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2012266，于2012年7月3日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；其特征在于將活化后YH)擴(kuò)培的菌液接入全自動(dòng)發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵處理，接種量為10%，以25%氨水控制pH 5. 5，溫度30°C，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量維持溶氧30%以上；當(dāng)甘油耗盡DO迅速上升時(shí)，開始流加50%甘油補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基，當(dāng)菌體干重達(dá)到100g/L后，停止補(bǔ)料；待甘油再次耗盡，繼續(xù)保持基質(zhì)匱乏狀態(tài)約Ih后，開始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)條件為溫度降低至20-25°C，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例為10:1-5:1 (W/W)，并且維持整個(gè)誘導(dǎo)過程的甲醇濃度為I. 5-2. 5%(W/V)，誘導(dǎo)葡萄糖氧化酶表達(dá)。誘導(dǎo)條件優(yōu)選溫度降低至22°C，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例為10:1 (ff/W)，并且維持整個(gè)誘導(dǎo)過程的甲醇濃度為1.8%(w/v)，誘導(dǎo)葡萄糖氧化酶表達(dá)。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(IL):85% 磷酸 26. 7mL/L，CaS04 O. 93g/L, K2SO4 18. 2g/L, MgSO4 · 7H20 14. 9g/L, KOH 4. 13g/L,甘油 40. Og/L, PTM1 4. 35mL/L, 25% 氨水調(diào) pH 5. 5 ；其中 PTM1 (IL)組成為CuS04, 6. 0g; KI, 0. 08g;MnSO4, 3. 0g; Na2MoO4, 0. 2g; H3BO3, 0. 02g;CoCI2, 0. 5g;ZnCl2, 20. Og;FeSO4 · 7H20, 65. 0g;biotin, 0. 2g;and 98%(w/w)H2SO4, 5mL。
所述補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基50%(W/V)甘油，其中含12mL/L PTM10所述發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為100%甲醇，其中含12mL/L PTM1與山梨醇其中含12mL/L PTM1 混合之比為 10 :1 (W/W)。葡萄糖氧化酶的酶活測(cè)定方法G0D活性測(cè)定一般采用鄰-聯(lián)(二)茴香胺分光光度法。在有氧條件下，GOD催化葡萄糖脫氫產(chǎn)生H2O2，在過氧化物酶(POD)作用下，氧供體鄰-聯(lián)(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色產(chǎn)物。測(cè)540nm處吸光度的變化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果，計(jì)算葡萄糖氧化酶活力單位。本發(fā)明的有益效果該菌株表達(dá)的葡萄糖氧化酶在3L發(fā)酵罐上酶活為645. 3U/mL,比不添加山梨醇(427. 6U/mL)提高了 50. 9%，大大提高了酶活，這為葡萄糖氧化酶的高效生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。生物材料保藏一株產(chǎn)葡萄糖氧化酶的基因工程菌，該菌株為巴斯德畢赤酵母，命名為PichiapastorisGS115-pPIC9K-G0X，在專利申請(qǐng)?zhí)枮?01210349289. 9的專利申請(qǐng)中已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2012266，保藏日期為2012年7月3日。


圖I :誘導(dǎo)階段山梨醇的添加對(duì)GOD酶活的影響。圖2 :誘導(dǎo)階段山梨醇的添加對(duì)生物量的影響。圖3 :誘導(dǎo)階段山梨醇的添加對(duì)GOD比酶活的影響。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I重組菌的3L發(fā)酵罐發(fā)酵以本實(shí)驗(yàn)室前期工作中構(gòu)建的Pichia pastoris GS115-pPIC9K_G0X為生產(chǎn)菌株，活化后，挑單菌落，接種于50mL YPD中(50mL培養(yǎng)基/500mL三角瓶)，并于30°C、200r/min培養(yǎng)24h。將YPD中菌液接入3L全自動(dòng)發(fā)酵罐(LiFlusGM BioTRON，Korea)，接種量為10%，以25%氨水控制pH 5. 5，溫度30°C，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量維持溶氧30%以上。當(dāng)甘油耗盡(D0迅速上升)時(shí)，開始流加50%甘油補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基。當(dāng)菌體達(dá)到100g/L后，停止補(bǔ)料。待甘油再次耗盡，繼續(xù)保持基質(zhì)匱乏狀態(tài)約Ih后，開始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，把誘導(dǎo)溫度降低至22°C，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例為10:1 (W/W)并且維持整個(gè)誘導(dǎo)過程甲醇濃度為I. 8%(W/V)，誘導(dǎo)葡萄糖氧化酶表達(dá)。培養(yǎng)基I)種子和斜面培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g ;斜面培養(yǎng)基添加瓊脂20g ；2)分批發(fā)酵培養(yǎng)基 BSM (1L) 85% 磷酸 26. 7mL/L, CaS04 O. 93g/L, K2S04 18. 2g/L, MgS04 · 7H20 14. 9g/L, KOH 4. 13g/L,甘油 40. Og/L, PTM1I 35mL/L, 25% 氨水調(diào) pH 5. 5。3) PTM1 (1L) CuSO4, 6. Og; KI, 0. 08g;MnSO4, 3. Og; Na2MoO4, 0. 2g; H3BO3, 0. 02g; CoCl2, 0. 5g;ZnCl2, 20. Og;FeSO4 · 7H20, 65. 0g;biotin, 0. 2g;and 98%(w/w)H2SO4, 5ml4)補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基50% (W/V)甘油(含12mL/L PTM1)。 5)發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基100%甲醇(含UmIVLPTM1)與山梨醇(含UmLzlPTM1)混合之比為 10 1 (w/w)。表達(dá)的葡萄糖氧化酶在3L發(fā)酵罐上酶活最高為645. 3U/mL，比不添加山梨醇(427.6U/mL)提高了 50.9% (圖I )，干重最大為227. 6g/L，比不添加山梨醇(179. 2g/L)提高了 27% (圖2)，比酶活最高為86499U/g,比不添加山梨醇(54845U/g)提高了 57. 7% (圖
3)。此外，本發(fā)明采用實(shí)施例I的技術(shù)方法，為的是提高酶的產(chǎn)量，但在試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，此方法不但提高了酶的產(chǎn)量，同時(shí)也有效縮短了發(fā)酵周期，縮短發(fā)酵周期達(dá)36小時(shí)，為本發(fā)明獲得的意想不到的技術(shù)效果。實(shí)施例2重組菌的3L發(fā)酵罐發(fā)酵其它條件同實(shí)施例1，只改變誘導(dǎo)條件，把誘導(dǎo)溫度降低至20°C，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例為10:2 (W/W)并且維持整個(gè)誘導(dǎo)過程甲醇濃度為2. 5%(W/V)，誘導(dǎo)葡萄糖氧化酶表達(dá)。表達(dá)的葡萄糖氧化酶在3L發(fā)酵罐上酶活最高為600U/mL，干重最大為231. 6g/L,比酶活最高為82452U/g。實(shí)施例3重組菌的3L發(fā)酵罐發(fā)酵其它條件同實(shí)施例1，只改變誘導(dǎo)條件，把誘導(dǎo)溫度降低至25°C，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例為10:1 (W/W)并且維持整個(gè)誘導(dǎo)過程甲醇濃度為2. 0%(W/V)，誘導(dǎo)葡萄糖氧化酶表達(dá)。表達(dá)的葡萄糖氧化酶在3L發(fā)酵罐上酶活最高為615U/mL，干重最大為234. 2g/L,比酶活最高為83255U/g。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，以一種產(chǎn)葡萄糖氧化酶的基因工程菌為生產(chǎn)菌株，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2012266，于2012年7月3日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；其特征在于將活化后YPD擴(kuò)培的菌液接入全自動(dòng)發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵處理，接種量為10%，以25%氨水控制pH 5. 5，溫度30°C，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量維持溶氧30%以上；當(dāng)甘油耗盡DO迅速上升時(shí)，開始流加50%甘油補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基，當(dāng)菌體干重達(dá)到IOOg/L后，停止補(bǔ)料；待甘油再次耗盡，繼續(xù)保持基質(zhì)匱乏狀態(tài)約Ih后，開始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)條件為溫度降低至20-25°C，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例為10:1-5:1 (W/W)，并且維持整個(gè)誘導(dǎo)過程的甲醇濃度為I. 5-2. 5%(W/V)，誘導(dǎo)葡萄糖氧化酶表達(dá)。
2.一種發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于誘導(dǎo)條件優(yōu)選溫度降低至22° C，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例為10:1 (W/W)，并且維持整個(gè)誘導(dǎo)過程的甲醇濃度為I.8%(W/V)，誘導(dǎo)葡萄糖氧化酶表達(dá)。
3.權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(1L):85%磷酸26.7mL/L, CaSO4 O. 93g/L, K2SO4 18. 2g/L, MgSO4 · 7H20 14. 9g/L, KOH 4. 13g/L,甘油 40. Og/L, PTM14. 35mL/L, 25% 氨水調(diào) pH 5. 5 ;其中 PTM1 (IL)組成為=CuSO4, 6. 0g;ΚΙ, 0. 08g;MnSO4, 3. Og;Na2MoO4, 0. 2g; H3BO3, 0. 02g; CoCl2, 0. 5g; ZnCl2, 20. Og; FeSO4 · 7H20, 65. Og; biotin, 0. 2g; and98% (w/w) H2SO4, 5mL。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基50%(W/V)甘油，其中含12mL/LPTM10
5.權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為100%甲醇，其中含UmIVLPTM1與山梨醇其中含UmIVLPTM1混合之比為10 :1 CWO。
6.權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述產(chǎn)葡萄糖氧化酶的基因工程菌保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2012266，于2012年7月3日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶酶活的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明采用本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中構(gòu)建的可以產(chǎn)較高活性葡萄糖氧化酶的重組畢赤酵母Pichia pastorisGS115-pPIC9K-GOX基因工程菌，保藏編號(hào)為CCTCC NOM 2012266。在甲醇誘導(dǎo)階段通過添加山梨醇來提高葡萄糖氧化酶的酶活:即控制發(fā)酵液中甲醇?xì)埩魸舛?.8%(W/V)，且甲醇與山梨醇混合添加比例為10:1(W/W)時(shí)，葡萄糖氧化酶的酶活為645.3U/mL，比不添加山梨醇(427.6U/mL)提高了50.9%，而且有效縮短了發(fā)酵周期，這為葡萄糖氧化酶的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/84GK102936585SQ20121052831
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者張娟, 陳堅(jiān), 顧磊, 堵國(guó)成, 沈伊娜, 李婷, 李夢(mèng)潔, 殷政 申請(qǐng)人:江南大學(xué)