專利名稱：乳糖代替IPTG誘導(dǎo)重組雞α干擾素在大腸桿菌中的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程藥物制備領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種利用乳糖代替IPTG生產(chǎn)重組雞α干擾素的方法。
背景技術(shù)：
干擾素(interfeixm，IFN)是一類重要的細(xì)胞因子，具有廣譜的抗病毒、抗細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。動(dòng)物機(jī)體受到病毒感染后干擾素從細(xì)胞內(nèi)釋放出來，可保護(hù)與其接觸的其他細(xì)胞不受感染。由于天然干擾素在生物體內(nèi)含量少且不易提取，在應(yīng)用中受到限制。20世紀(jì)70年代起，科學(xué)家開始探索利用基因工程的方法來改造干擾素及其表達(dá)系統(tǒng)，取得了很大進(jìn)步。在我國，禽類干擾素的研究起步比較晚。目前，市售的干擾素價(jià)格高昂，與動(dòng)物價(jià)格低廉存在著尖銳的矛盾，無法在獸醫(yī)臨床上廣泛應(yīng)用。利用基因工程技術(shù)選擇一個(gè)合適的系統(tǒng)，使其得到高效表達(dá)，生產(chǎn)具有廉價(jià)、廣譜抗病毒活性、無毒害、無殘留等優(yōu)點(diǎn)的干擾素?zé)o疑是促使干擾素在獸醫(yī)臨床上推廣應(yīng)用的有效途徑。目前工業(yè)生產(chǎn)中大多使用大腸桿菌作為工程菌來生產(chǎn)目的蛋白。大腸桿菌作為工程菌表達(dá)目的蛋白主要有兩個(gè)優(yōu)勢一是大腸桿菌具有遺傳背景清楚，易于控制基因的表達(dá)；二是大腸桿菌容易培養(yǎng)，可以獲得較高產(chǎn)量的目的蛋白。乳糖(Lac)操縱子是研究的最為詳盡的大腸桿菌基因操縱子，目前利用乳糖操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)和構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)已得到了廣泛應(yīng)用。Novagen公司的pET系列大腸桿菌表達(dá)體系利用IPTG誘導(dǎo)lacUV5啟動(dòng)子來過量表達(dá)T7RNA聚合酶，從而產(chǎn)生大量的目的蛋白。IPTG可作為乳糖操縱子的安慰性誘導(dǎo)劑，且不會(huì)被菌體所分解利用，不會(huì)帶來復(fù)雜的代謝動(dòng)力學(xué)影響，但其價(jià)格昂貴又有潛在毒性，而乳糖具備無毒和價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)，使得其在重組蛋白的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中，具有潛在價(jià)值和優(yōu)勢。本試驗(yàn)選用乳糖作為誘導(dǎo)劑探索其對干擾素蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最優(yōu)化條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建了含雞α干擾素的重組質(zhì)粒，克服了天然干擾素在體內(nèi)含量少且不易提取等缺點(diǎn)，為雞α干擾素的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明的另一目的是克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足之處，提供一種利用乳糖誘導(dǎo)性表達(dá)載體生產(chǎn)重組雞α干擾素的方法。本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
(I)將已構(gòu)建好含雞α干擾素的重組質(zhì)粒的宿主菌進(jìn)行活化，制備種子液。(2)乳糖最佳誘導(dǎo)濃度確定以小三角瓶培養(yǎng)菌體，分別向處于最佳生長期的菌體培養(yǎng)基中加入乳糖，使乳糖終濃度分別為O. 5%、1%、2%、4%、8%，同時(shí)以加入O. 2mM/L的IPTG作為陽性對照，37°C，250rpm振蕩培養(yǎng)4h，同時(shí)用未誘導(dǎo)的菌液作為陰性對照。(3)菌體最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)確定菌體生長情況以0D_值來確定。以小三角瓶培養(yǎng)菌體，分別在菌體生長至OD600值為O. 4,0. 6,0. 8、1. O、1. 2、1. 4、1. 6時(shí)，向培養(yǎng)基中加入濃度為2%的乳糖，37°C誘導(dǎo)4h后，目的蛋白表達(dá)情況以誘導(dǎo)后的菌體全蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行目的蛋白占總蛋白的比例的分析。(4)乳糖最佳誘導(dǎo)時(shí)間確定根據(jù)以上試驗(yàn)所確定的條件，在小三角瓶培養(yǎng)的菌體中加入乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，于37°C分別誘導(dǎo)1、2、3、4、6、8、IOh，觀察目的蛋白的表達(dá)量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
(I)本發(fā)明成功運(yùn)用乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)劑來誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。(2)通過本發(fā)明所述的技術(shù)方案，大腸桿菌BL21 (DE3)菌體得率高，菌體濕重達(dá)40-80g/L。(3)本發(fā)明的目的蛋白表達(dá)水平高，目的蛋白占菌體總蛋白的水平可達(dá)11-15%，與
IPTG誘導(dǎo)水平相當(dāng)。(4)本發(fā)明利用乳糖誘導(dǎo)蛋白表達(dá)外，它還能大幅提高菌的生物量。(5)本發(fā)明所述的發(fā)酵方法簡便，發(fā)酵時(shí)間短，生產(chǎn)成本低，此外，無IPTG存在，后
處理簡單。


圖1，不同乳糖濃度和IPTG誘導(dǎo)后的蛋白表達(dá)情況，其中泳道M為蛋白Marker，泳道1-7依次分別為未誘導(dǎo)、O. 2mMIPTG誘導(dǎo)、O. 5%乳糖誘導(dǎo)、1%乳糖誘導(dǎo)、2%乳糖誘導(dǎo)、4%乳糖誘導(dǎo)、8%乳糖誘導(dǎo)。圖2，添加乳糖誘導(dǎo)不同時(shí)間的蛋白表達(dá)情況,其中泳道M為蛋白Marker，泳道I_8依次分別為添加乳糖誘導(dǎo)0h，lh, 2h, 3h, 4h, 6h, 8h, IOh。圖3，不同菌體生長階段加入乳糖誘導(dǎo)的目的蛋白占全菌總蛋白的比例。圖4，干擾素濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述。實(shí)施例1
雞α干擾素重組質(zhì)粒的構(gòu)建
參照NCBI中已發(fā)表雞α干擾素基因序列(ΑΒ021154)，利用Primer Premier 5. O軟件設(shè)計(jì)2對引物，用于擴(kuò)增雞IFN-α全基因(CKF1和CKR1)和去信號(hào)肽的成熟蛋白編碼基因(CKF2和CKR2)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
權(quán)利要求
1.一種乳糖代替IPTG誘導(dǎo)重組雞α干擾素在大腸桿菌中的表達(dá)，其特征在于包括如下步驟(1)種子培養(yǎng)方法從-70°C冰箱中取出含雞α干擾素重組質(zhì)粒的甘油保藏管I支，于冰水浴中解凍，混勻后以1%接種量轉(zhuǎn)接到50mlLB培養(yǎng)基中，在37°C的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng) 12h，轉(zhuǎn)速為 200r/min;(2)發(fā)酵和誘導(dǎo)將經(jīng)活化的種子液按1%的接種量接種于2L培養(yǎng)基中，37°C恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200r/min，當(dāng)菌體濃度達(dá)到一定OD值時(shí)，添加誘導(dǎo)劑乳糖，分別調(diào)整誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間因素進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以誘導(dǎo)后目的蛋白的濃度作為依據(jù)，確定最佳誘導(dǎo)方案。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述的宿主菌為大腸桿菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3)，表達(dá)載體為 PET28a。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征在于菌體濃度分別為OD6tltl為O.4-1. 6時(shí)添加誘導(dǎo)劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征在于用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開一種乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)pET28a載體生產(chǎn)重組雞α干擾素的方法。對乳糖誘導(dǎo)的時(shí)機(jī)、乳糖濃度、誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間條件進(jìn)行研究，確定了乳糖誘導(dǎo)的最佳條件。結(jié)果表明，乳糖能有效地誘導(dǎo)重組α干擾素表達(dá)的表達(dá)，并且目的蛋白的表達(dá)量高于IPTG的誘導(dǎo)量。生產(chǎn)成本降低10%左右，菌體量提高20%，同時(shí)乳糖不會(huì)對環(huán)境造成污染。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102994596SQ201210528728
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者馬仲彬, 徐公豹, 李炳志, 李秋霞, 申艷敏, 王興濤, 王新娟 申請人:河南省康星藥業(yè)股份有限公司