專(zhuān)利名稱(chēng)：抗菌肽lp基因轉(zhuǎn)化酵母的發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，更具體地說(shuō)是關(guān)于一種抗菌肽LP基因轉(zhuǎn)化酵母的發(fā)酵生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽LP基因是根據(jù)人源天然抗菌肽LL-37和豬源抗菌肽PG-I基因的氨基酸序列設(shè)計(jì)而人工合成的基因。由于抗菌肽的殺菌機(jī)理獨(dú)特，病原菌不易對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，且抗菌譜廣，因此，抗菌肽作為一種新型環(huán)?？咕暳咸砑觿?，對(duì)畜牧業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。而目前為止，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有該基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種抗菌肽LP基因轉(zhuǎn)化酵母的發(fā)酵生產(chǎn)方法。將含抗菌肽LP基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的基因工程酵母在適宜的條件下成功表達(dá)抗菌肽基因并分泌抗菌肽到菌體外。方法的工藝主要包括搖瓶種子的制備、發(fā)酵罐培養(yǎng)，具體工藝過(guò)程如下
(1)搖瓶種子的制備將含抗菌肽LP基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母作為菌種接入三角瓶中，在28-30°C，搖床轉(zhuǎn)速180-300轉(zhuǎn)/分的條件下，培養(yǎng)24-36小時(shí)得到搖瓶種子；
(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)將(I)中已培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵罐，接種量為2-10%，在28-30°C，攪拌速率200-700轉(zhuǎn)/分，罐壓O. 1-0. 4兆帕，風(fēng)量I: I. 2-1:1. 4體積/體積/分，pH 5. 0-7. O的條件下，培養(yǎng)24-72小時(shí)。將發(fā)酵所得抗菌肽在100-120°C下加熱10-20分鐘；
其中所用的搖瓶種子培養(yǎng)基組分及重量百分含量為蛋白胨2%、酵母粉1%、YNB
I.34%、生物素O. 4mg/L、甘油1%、磷酸鹽緩沖液100mmol/L。
發(fā)酵培養(yǎng)基IL 含85% 磷酸 26. 7mL, CaSO4 · 2H20 O. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H2014. 9g, KOH 4.13g，甘油 40. 0g，PTMl 溶液 4. 35mL，28% 氨水調(diào) pH 至 5. 0。PTMl 溶液 IL含=CuSO4 · 5H20 6. Og, Na2I 0. 08g, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3 0. 02g,COCl2 · 6H20 0. 5g, ZnCl2 20. Og, FeSO4 · 7H20 65. Og,生物素 0. 2g，硫酸 5. 0 ml。當(dāng)發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)菌種用量超過(guò)5升時(shí)，方法的工藝主要包括搖瓶種子的制備、種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)，具體工藝過(guò)程如下
(1)搖瓶種子的制備將含抗菌肽LP基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母作為菌種接入三角瓶中，在28-30°C，搖床轉(zhuǎn)速180-300轉(zhuǎn)/分的條件下，培養(yǎng)24-36小時(shí)得到搖瓶種子；
(2)種子罐培養(yǎng)將(I)中搖好的搖瓶種子接入種子罐中，接種量1-10%，在28-30°C，攪拌速率200-700轉(zhuǎn)/分，罐壓O. 1-0. 4兆帕，風(fēng)量I: I. 2-1:1. 4體積/體積/分，pH 5. 0-7. O的條件下，培養(yǎng)24-48小時(shí)；
(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)將(2)中已培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵罐，接種量2-10%，在28-30°C，攪拌速率200-700轉(zhuǎn)/分，罐壓O. 1-0. 4兆帕，風(fēng)量1:1. 2-1:1. 4體積/體積/分，pH 5. 0-7. O的條件下，培養(yǎng)24-72小時(shí)。將發(fā)酵所得抗菌肽在100-120°C下加熱10-20分鐘；
其中所用的搖瓶種子培養(yǎng)基組分及重量百分含量為蛋白胨2%、酵母粉1%、YNBI.34%、生物素O. 4mg/L、甘油1%、磷酸鹽緩沖液100mmol/L。發(fā)酵培養(yǎng)基IL 含85% 磷酸 26. 7mL, CaSO4 · 2H20 O. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H2014. 9g, KOH 4.13g，甘油 40. 0g，PTMl 溶液 4. 35mL，28% 氨水調(diào) pH 至 5. 0。PTMl 溶液 IL含=CuSO4 · 5H20 6. Og, Na2I 0. 08g, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3 0. 02g,COCl2 · 6H20 0. 5g, ZnCl2 20. Og, FeSO4 · 7H20 65. Og,生物素 0. 2g，硫酸 5. 0 ml。本發(fā)明所用的抗菌肽LP基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的工程酵母可用現(xiàn)有的基因工程手段得到。 利用該發(fā)酵培養(yǎng)法生產(chǎn)的抗菌肽酵母制劑殺菌效價(jià)高，質(zhì)量穩(wěn)定，可大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短且成本低。


圖I發(fā)酵產(chǎn)物抗菌肽LP的Tricine-SDS-PAGE，I.抗菌肽LP上清，2.空載體對(duì)照，M.低分子量蛋白Marker對(duì)照。圖2不同時(shí)間發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑。
具體實(shí)施方案下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的方法作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例I 一次50升罐的抗菌肽的生產(chǎn)
I、搖瓶種子的制備
50升發(fā)酵罐，裝量30升，設(shè)接種量為5%，則配搖瓶培養(yǎng)基的量為30升X 5%= I. 5升，按蛋白胨2%、酵母粉1%、YNB I. 34%、生物素O. 4mg/L、甘油1%、磷酸鹽緩沖液100mmol/L的配方，配I. 5升培養(yǎng)基，分裝在500毫升三角瓶中，每瓶裝量為100毫升，裝好后滅菌，冷卻至30°C接入菌種(約5毫升/瓶)，搖床轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分，控制溫度為30°C，經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后，接入50升發(fā)酵罐培養(yǎng)。2、發(fā)酵罐培養(yǎng)
50升罐實(shí)際裝量為30升，減去搖瓶種子I. 5升，則實(shí)配量為30-1. 5升=28. 5升，按發(fā)酵培養(yǎng)基配方配28. 5升的培養(yǎng)基于50升罐中(實(shí)際裝水量為26升，因滅菌時(shí)產(chǎn)生約3升的蒸汽冷凝水)，滅菌，待溫度下降至30°C左右時(shí)，接入已培養(yǎng)好的搖瓶種子，控制培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為400轉(zhuǎn)/分，罐壓0. 2兆帕，風(fēng)量為1:1.2體積/體積/分，培養(yǎng)24小時(shí)后，每隔2h加入終體積為0. 5%的甲醇(即150毫升)誘導(dǎo)，培養(yǎng)48小時(shí)，即可產(chǎn)生抗菌肽，發(fā)酵液經(jīng)100°C，15分鐘滅活后，即為抗菌肽成品，發(fā)酵效價(jià)為5000單位/毫升。實(shí)施例2 —次500升罐的抗菌肽的生產(chǎn)
I、搖瓶種子的制備
50升發(fā)酵罐，裝量30升，設(shè)接種量為10%，則配搖瓶培養(yǎng)基的量為30升X 10%=3升，按蛋白胨2%、酵母粉1%、YNB I. 34%、生物素0. 4mg/L、甘油1%、磷酸鹽緩沖液lOOmmol/L的配方，配3升培養(yǎng)基，分裝在500毫升三角瓶中，每瓶裝量為100毫升，裝好后滅菌，冷卻至30°C接入菌種(約5毫升/瓶)，搖床轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分，控制溫度為30°C，經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后，接入50升發(fā)酵罐培養(yǎng)。2、種子罐培養(yǎng)50升罐實(shí)際裝量為30升,減去搖瓶種子3升,則實(shí)配量為30-3升=27升,按發(fā)酵培養(yǎng)基配方配27升的培養(yǎng)基于50升罐中(實(shí)際裝水量為25升，因滅菌時(shí)產(chǎn)生約3升的蒸汽冷凝水)，滅菌，待溫度下降至30°C左右時(shí)，接入已培養(yǎng)好的搖瓶種子，控制培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為500轉(zhuǎn)/分，罐壓O. 2兆帕，風(fēng)量為1:1.4體積/體積/分，培養(yǎng)24小時(shí)后便可接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)。3、發(fā)酵罐培養(yǎng)
500升罐實(shí)際裝量為300升，減去種子罐種量30升(種量為10%)，則實(shí)配量為300-30升=270升，按發(fā)酵培養(yǎng)基配方配270升的培養(yǎng)基于500升罐中(實(shí)際裝水量為260升，因滅菌時(shí)產(chǎn)生約10升的蒸汽冷凝水)，滅菌，待溫度下降至30°C左右時(shí)，接入已培養(yǎng)好的種子罐種子，控制培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為400轉(zhuǎn)/分，罐壓O. 2兆帕，風(fēng)量為1:1.4體積/體積/分，培養(yǎng)30小時(shí)后，每隔2h加入終體積為O. 5%的甲醇(即1500毫升)誘導(dǎo)，培養(yǎng)48小時(shí)后，即可產(chǎn)生抗菌肽，發(fā)酵液經(jīng)100°C，15分鐘滅活后，即為抗菌肽成品，發(fā)酵效價(jià)為5000單 位/毫升。
權(quán)利要求
1.一種抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括搖瓶種子的制備、發(fā)酵罐培養(yǎng)，其特征在于 (1)搖瓶種子的制備將含抗菌肽LP基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母作為菌種接入三角瓶中，在28-30°C，搖床轉(zhuǎn)速180-300轉(zhuǎn)/分的條件下，培養(yǎng)24-36小時(shí)得到搖瓶種子； (2)發(fā)酵罐培養(yǎng)將(I)中已培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵罐，接種量為2-10%，在28-30°C，攪拌速率200-700轉(zhuǎn)/分，罐壓0. 1-0. 4兆帕，風(fēng)量I: I. 2-1:1. 4體積/體積/分，pH.5.0-7. 0的條件下，培養(yǎng)24-72小時(shí)，將發(fā)酵所得抗菌肽在100-120°C下加熱10-20分鐘；其中所用的搖瓶種子培養(yǎng)基組分及重量百分含量為蛋白胨2%、酵母粉1%、YNB 1.34%、生物素0. 4mg/L、甘油1%、磷酸鹽緩沖液100mmol/L ;發(fā)酵培養(yǎng)基IL含85%磷酸26. ImL,CaSO4 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，甘油 40. Og, PTMl 溶液.4.35mL, 28% 氨水調(diào) pH 至 5. 0，PTMl 溶液 IL 含=CuSO4 5H20 6. 0g, Na2I 0. 08g, MnSO4 H2O .3.Og, Na2MoO4 2H20 0. 2g, H3BO3 0. 02g, COCl2 6H20 0. 5g, ZnCl2 20. Og, FeSO4 7H20.65. Og,生物素 0. 2g，硫酸 5.0 ml o
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗菌肽LP基因轉(zhuǎn)化酵母發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)菌種用量超過(guò)5升時(shí)，在搖瓶培養(yǎng)后和發(fā)酵罐培養(yǎng)前進(jìn)行種子罐培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗菌肽LP基因轉(zhuǎn)化酵母發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于所述的種子罐培養(yǎng)，是將搖好的搖瓶種子接入種子罐中，接種量2-10%，在28-30°C，攪拌速率200-700轉(zhuǎn)/分，罐壓0. 1-0. 4兆帕，風(fēng)量I: I. 2-1:1. 4體積/體積/分，pH 5. 0-7. 0的條件下，培養(yǎng)24-72小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的抗菌肽LP基因轉(zhuǎn)化酵母發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于所用的搖瓶種子培養(yǎng)基組分及重量百分含量為蛋白胨2%、酵母粉1%、YNB I. 34%、生物素.0.4mg/L、甘油1%、磷酸鹽緩沖液100mmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的抗菌肽LP基因轉(zhuǎn)化酵母發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于所用的發(fā)酵培養(yǎng)基組分及含量為(1L) 85%磷酸26. 7mL, CaSO4 2H20 0. 93g，K2SO4 18. 2g，MgSO4 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g,甘油 40. Og, PTMl 溶液 4. 35mL, 28% 氨水調(diào) pH 至 5. 0，PTMl溶液 IL 含=CuSO4 5H20 6. 0g, Na2I 0. 08g, MnSO4 H2O 3. Og, Na2MoO4 2H20 0. 2g, H3BO3.0. 02g, COCl2 6H20 0. 5g, ZnCl2 20. Og, FeSO4 7H20 65. 0g，生物素 0. 2g，硫酸 5. 0 ml。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，提供了一種抗菌肽的發(fā)酵方法，包括步驟(1)搖瓶種子的制備；(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)。本發(fā)明將含LP基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的工程酵母在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)出搖瓶種子，然后將搖瓶種子擴(kuò)大到發(fā)酵培養(yǎng)基再進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便且成本低，發(fā)酵產(chǎn)物無(wú)需分離純化，質(zhì)量穩(wěn)定，可大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102965390SQ201210528750
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者申艷敏, 馬仲彬, 李秋霞, 張帥帥, 李榮譽(yù), 王新娟, 王興濤 申請(qǐng)人:河南省康星藥業(yè)股份有限公司