專利名稱：一種檢測中外不同牛群體的基因診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性的檢測，特別涉及ー種檢測中外不同牛群體的基因診斷方法。
背景技術(shù)：
遺傳標(biāo)記指可追蹤染色體、染色體某ー節(jié)段、某個位點在家系中傳遞的任何ー種遺傳特性。它具有兩個基本特征，即可遺傳性和可識別性，因此生物的任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標(biāo)記。遺傳標(biāo)記大致經(jīng)歷了形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記四個發(fā)展階段。1974年,Grodzicker等首次提出用限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)作為遺傳標(biāo)記,開創(chuàng)了直接用DNA作為遺傳標(biāo)記的先河，從而揭開了分子標(biāo)記研究的序幕。經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，尤其是1985年Mullis等[27]發(fā)明了 PCR技術(shù)以后，分子標(biāo)記研究呈現(xiàn)出“百家爭鳴”的景象。分子標(biāo)記之所以能反映DNA水平的遺傳變異情況主要是基于被研究的DNA分子由于缺失、插入、易位、倒位、重排或存在長短與重排不一的重復(fù)機(jī)制而產(chǎn)生多態(tài)性。經(jīng)過大量的研究發(fā)現(xiàn)，DNA分子標(biāo)記有許多特點，如直接以DNA的形式表現(xiàn)；某些標(biāo)記表現(xiàn)共顯性；標(biāo)記數(shù)量多；表現(xiàn)為中性；多態(tài)性高等。如今，分子標(biāo)記在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，在遺傳標(biāo)記中占主導(dǎo)地位。單核苷酸多態(tài)性(sinTle nucleotide polymorphism, SNP)是由美國麻省理工學(xué)院的人類基因組研究中心的學(xué)者Lander (1996)提出的ー類遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/T)的變化而引起的多態(tài)性。它的變異形式有顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失等，主要由單個堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起。具有轉(zhuǎn)換型的堿基變異的SNPs約占2/3。在任何已知或未知的基因內(nèi)或附近都可能找到數(shù)量不等的SNPs，基因編碼區(qū)內(nèi)的SNPs (cSNPs)比較少，因為在外顯子內(nèi)的變異率僅占周圍序列的1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義， 因此倍受關(guān)注。標(biāo)記輔助選擇就是將現(xiàn)代生物技術(shù)與常規(guī)選擇方法相結(jié)合，通過對遺傳標(biāo)記的選擇來間接選擇控制某性狀的數(shù)量性狀位點(QTL)，使之能夠同時利用標(biāo)記位點信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。標(biāo)記輔助選擇主要經(jīng)歷了三個階段第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋白質(zhì)(酶)標(biāo)記對數(shù)量性狀的標(biāo)記階段；第三個階段是分子遺傳標(biāo)記階段。隨著分子標(biāo)記技術(shù)日漸成熟與豐富，使覆蓋整個基因組的標(biāo)記成為可能，通過與QTL間的連鎖分析，實現(xiàn)分子標(biāo)記輔助選擇的目標(biāo)。SNP作為新的遺傳標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種及多祥性的研究。分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇(molecularmark-assist selection, MAS),該技術(shù)是借助DNA分子標(biāo)記對遺傳資源或育種材料進(jìn)行選擇，對畜禽的綜合性狀進(jìn)行品種改良，它是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合的方法，進(jìn)行新品種選育。在畜禽育種中，人們期望，通過對生長性狀密切相關(guān)，并且與數(shù)量性狀緊密連鎖的DNA標(biāo)記的選擇，達(dá)到早期選種和提高育種值準(zhǔn)確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進(jìn)展。近年來，人們發(fā)展了許多用于探尋分子遺傳標(biāo)記的方法，最常見的有單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)(SSCP) ,PCR-RFLP和直接測序技術(shù)等，SSCP它可以發(fā)現(xiàn)靶DNA片段中未知位置的堿基突變。Takao經(jīng)實驗證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發(fā)現(xiàn)，他認(rèn)為現(xiàn)在知道的所有單堿基改變絕大多數(shù)可用該方法檢測出來。另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進(jìn)ー步提純。用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。該方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器。Gli3基因?qū)儆贕L1-Kruppel基因家族中的ー員。其參與的Shh信號通路在動物生長發(fā)育，尤其是骨骼，神經(jīng)系統(tǒng)及肢體的發(fā)育過程中有重要作用。本研究采用PCR-SSCP和DNA測序技術(shù)，檢測了 3個中國地方黃牛群體(南陽牛187頭；秦川牛287頭；郟縣紅牛139頭)和I個國外品種(荷斯坦牛95頭)共708個個體的Gli3基因的遺傳變異，分析了其遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，為中國黃牛的高效選育和分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫的建立、種質(zhì)資源保存與利用提供遺傳學(xué)依據(jù)。本研究在3個中國黃牛群體的Gli3基因外顯子I檢測到I個SNP(A8143G)，這個SNP未引起氨基酸突變(SerTCA —SerTCG)。在荷斯坦牛中沒有發(fā)現(xiàn)多態(tài)?？ǚ綑z驗顯示，四個牛品種均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。南陽牛、秦川牛、郟縣紅牛和荷斯坦牛4個群體遺傳多態(tài)指數(shù) He/Ne/PIC 分別為 0. 48/1. 91/0. 36，0. 44/1. 78/0. 34，0. 49/1. 97/0. 37，
0.00/1. 00/0. 00。以上研究表明，Gli3基因可以作為檢測中外不同牛群體的有效選擇標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決 的技術(shù)問題在于提供一種檢測黃牛GLI3基因單核苷酸多態(tài)性的方法，尋找與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)的SNP作為分子標(biāo)記，加快具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀黃牛種群的建立。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種檢測黃牛GLI3基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，以包含GLI3基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛GLI3基因；瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大?。挥米冃詣┨幚鞵CR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對變性后的擴(kuò)增片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛GLI3基因第8143位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對P為上游引物5’-CAGGGGAAAAGGATGGG-3’ ；下游引物5’-CGAGGTAAGTGCACATGC-3’ ；所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 30s，58. 5°C退火 30s，72°C延伸 30s，34 個循環(huán)；72°C延伸IOmin0瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，所用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1. 5%。所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳質(zhì)量濃度為10%。所述根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛GLI3基因第8143位的單核苷酸多態(tài)性為AA基因型表現(xiàn)為8143位為核苷酸A純和；AG基因型表現(xiàn)為8143位為核苷酸A/G雜合；GG基因型表現(xiàn)為8143位為脫氧核苷酸G純和；其中，單核苷酸多態(tài)性GG基因型為突變純合基因型。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下獨特的技術(shù)效果本發(fā)明根據(jù)已公布牛GLI3基因(GenBank Accession No. NW 001494928)的序列設(shè)計引物，分別以3個黃牛品種的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序后得到的黃牛GLI3基因的部分序列與NCBI公布的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在GLI3基因的第8143位存在SNP多態(tài)性。針對上述第8143位的SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其篩查和檢測方法，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，用變性劑處理擴(kuò)增產(chǎn)物后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，能夠簡單、快速、低成本、精確地檢測其單核苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明提供的檢測方法為GLI3基因的SNP與黃牛部分生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，研究表明基因型對南陽牛群體的體重有顯著影響(P〈0. 05)。以上研究表明，GLI3基因結(jié)果表明該位點能夠作為提高黃牛體重和日增重的分子標(biāo)記，以便用于中國黃牛肉用生長性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。本發(fā)明還涉及ー種用于實施本發(fā)明所述方法的專用試劑盒，所述試劑盒內(nèi)容包括一、試劑盒引物成分1.1 特異引物(上下游)F:5’ -CAGGGGAAAAGGATGGG-3’ ；R:5，-CGAGGTAAGTGCACATGC-3，；ニ、試劑盒操作說明(I) PCR操作說明1.1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)體系見表2。1. 2PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序95°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 30s，58. 5°C退火 30s，72°C延伸 30s，34 個循環(huán)；72°C延伸IOmin0(2)電泳檢測與基因型判斷2.1PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增得到長度為452bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)用1%的瓊脂糖電泳檢測，表現(xiàn)唯一的452bp的PCR條帶，見圖2所示。2. 2PCR 產(chǎn)物的 SSCP 分析對每個個體擴(kuò)增片段變性處理后，進(jìn)行10%聚丙稀酰胺凝膠電泳檢測，其個體可以出現(xiàn)AA，或AG，或GG帶型，見圖4所示。(3)待檢個體的選擇與淘汰①中國牛群體選擇-M ;GA和AA型；(有3基因型基因型，有多態(tài)性)。②國外牛群體選擇AA型；(有I種基因型，無多態(tài)性)。(4)注意事項1. DNA的提取可以按照以上提供的步驟操作，也可以依據(jù)不同廠家的全血DNA提取試劑盒的要求來提取，但是要保證DNA的純度，若提取效果不佳，需要純化后再進(jìn)行后續(xù)的試驗。2.反應(yīng)體系和反應(yīng)程序可以依據(jù)不同的廠家產(chǎn)品的要求來操作，但要保證擴(kuò)增的特異性和擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度，以免影響后續(xù)的試驗結(jié)果。


圖1是本發(fā)明的技術(shù)流程示意圖。圖2是本發(fā)明用來檢測PCR產(chǎn)物片段大小的瓊脂糖凝膠電泳(泳道1-7分別代表不同黃牛個體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物ポ為Marker I，條帶分別為100，200，300，400，500，600bp ；)。圖3是本發(fā)明用來檢測各樣本突變情況的聚丙烯酰胺凝膠電泳(自左至右泳道分別代表基因型AG、GG和AA的電泳帶型)。圖4是本發(fā)明中PCR產(chǎn)物混合測序篩查到的黃牛GLI3基因序列8143位A-G突變測序結(jié)果圖(黒色方框所指處為單核苷酸突變位置，自上至下分別為AA、AG和GG基因型的測序結(jié)果圖)。
具體實施例方式本發(fā)明首先根據(jù)NCBI公布的GLI3基因序列(GenBankAccession No. NW001494928)設(shè)計引物，分別以3個黃牛品種的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，混合PCR產(chǎn)物并對其純化，測序。然后，進(jìn)行測序圖分析和序列比對篩查出SNP位點；其次，對待測群體進(jìn)行多態(tài)位點的PCR-SSCP檢測；最后，根據(jù)在群體中檢測到的基因型，進(jìn)行群體遺傳統(tǒng)計分析和生長性狀的關(guān)聯(lián)分析，篩選出與黃牛生長性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記。下面對本發(fā)明做詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明 的解釋而不是限定。I地方黃牛品種GLI3基因部分DNA序列的克隆1、黃牛樣本采集本發(fā)明具體以3個中國地方黃牛品種的種群作為檢測對象，具體采集樣本見表1:河南南陽牛(175)，陜西秦川牛(287)，河南郟縣紅牛(140)；表I黃牛樣本的采集
權(quán)利要求
1.一種檢測黃牛GLI3基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于， (1)以包含GLI3基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛GLI3基因， 所述的引物對P為 上游引物5’ -CAGGGGAAAAGGATGGG-3’ ； 下游引物5’ -CGAGGTAAGTGCACATGC-3’ ； (2)用瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟(I)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大?。? (3)用變性劑處理步驟(I)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對變性后的擴(kuò)增片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛GLI3基因第8143位的單核苷酸多態(tài)性。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛GLI3基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，步驟(I)所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為 95°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s, 58. 5°C退火30s，72。。延伸30s，34個循環(huán)；72°C延伸IOmin0
3.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛GLI3基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度為1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛GLI3基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳為質(zhì)量濃度10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛GLI3基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述步驟(3)中根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛GLI3基因第8143位的單核苷酸多態(tài)性為AA基因型表現(xiàn)為8143位為核苷酸A純合；AG基因型表現(xiàn)為8143位為核苷酸A/G雜合；GG基因型表現(xiàn)為8143位為核苷酸G純和；其中，單核苷酸多態(tài)性GG基因型為突變純合基因型。
6.權(quán)利要求1-5中任意一權(quán)利要求所述的檢測黃牛GLI3基因單核苷酸多態(tài)性的方法在鑒定不同黃牛群體多態(tài)性中的診斷應(yīng)用。
7.權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于用于中國黃牛肉用和生長性狀的分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
8.一種檢測中外不同牛群體的基因診斷試劑盒包括 (1)特異引物，所述特性性弓I物包括 上游引物5，-CAGGGGAAAAGGATGGG-3，； 下游引物5’ -CGAGGTAAGTGCACATGC-3’ ； (2)生化試劑，所述生化試劑為 (3)操作說明書，所述操作說明書包括 PCR操作說明； 電泳檢測與基因型判斷； 待檢個體的選擇與淘汰； 注意事項。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測中外不同牛群體的基因診斷試劑盒，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。一種GLI3基因檢測中外不同牛群體的方法，包括以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛GLI3基因；進(jìn)行DNA測序和SSCP多態(tài)性的檢測及其不同基因型與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析。該方法是一種在DNA水平上篩查和檢測與中外不同牛群體中特異分子遺傳標(biāo)記，故本發(fā)明提供的檢測方法可用于區(qū)分中外不同牛群體，進(jìn)而快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。本發(fā)明的優(yōu)點是首次提供了在3個中國黃牛群體中GLI3基因存在一種突變，并且該突變在國外牛品種中不存在多態(tài)性。本發(fā)明檢測方法簡單、成本低，檢測結(jié)果直接、可靠，適用于中外不同牛群體GLI3基因大規(guī)模的篩查和診斷。
文檔編號C12Q1/68GK103031376SQ20121052885
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者陳宏 , 黃永震, 王珂憶, 藍(lán)賢勇, 雷初朝, 胡沈榮 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)