專利名稱：生產(chǎn)高效降解飼料底物的木聚糖酶的米曲霉及生產(chǎn)木聚糖酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵領(lǐng)域，具體地，涉及能生產(chǎn)高效降解飼料底物的木聚糖酶的米曲霉及生產(chǎn)木聚糖酶的方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)飼料資源中玉米供應(yīng)日趨緊張，使用麥類飼料作為能量飼料越來越受到重視。在小麥、大麥、高粱等植物性飼料原料中存在著大量的非淀粉多糖(NSPS)，特別是阿拉伯木聚糖，對(duì)動(dòng)物消化吸收存在一定的抗?fàn)I養(yǎng)作用，使飼料營(yíng)養(yǎng)成分尤其是脂肪和蛋白質(zhì)不能被充分消化吸收，最終導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率下降。此外，食糜在小腸的滯留會(huì)引起微生物的異常繁殖，使動(dòng)物生長(zhǎng)受阻，表觀代謝能(AME)受到抑制。木聚糖酶(xylanase)是指可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一組酶的總稱，主要包括外切β -1, 4-木聚糖酶、內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶和β-木聚糖酶。它可以將飼料中的非淀粉多糖(NSPS)分解成較小聚合度的低聚木糖，從而改善飼料性能，消除或降低非淀粉多糖在動(dòng)物腸胃中因粘度較大而引起的抗?fàn)I養(yǎng)作用；同時(shí)它可以破壞植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，提高內(nèi)源性消化酶的活性，提高飼料養(yǎng)分的利用表觀代謝能(AME);另外還可以減少微生物的定植、維持腸道正常結(jié)構(gòu)，取得了良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。目前飼用酶制劑的生產(chǎn)主要有液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵方式。固態(tài)發(fā)酵是高效生產(chǎn)酶制劑的方法之一，存在著很多優(yōu)點(diǎn)，如單位體積的培養(yǎng)基的生產(chǎn)能力大大高于液態(tài)培養(yǎng)基；對(duì)工廠、機(jī)械設(shè)備和能源等的要求不高，操作成本低；培養(yǎng)基含水量小，不易污染雜菌等。目前，在木聚糖酶生產(chǎn)成本中培養(yǎng)基的成本占總成本的30% 40%，因此，利用廉價(jià)的培養(yǎng)基成分(特別是碳源)是降低木聚糖酶生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。而農(nóng)業(yè)廢棄物如玉米芯、秸桿、蔗渣、麩皮等既是碳源，又是固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的良好載體。

隨著研究的深入，固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的水平也得到了較大的提高。Lakshmi等(2009)報(bào)道了 Aspergillus terreus MTCC 8661固態(tài)發(fā)酵木聚糖酶活力可達(dá)到115000IU/g干物質(zhì)，這是迄今為止木聚糖酶活力最高的報(bào)道。鄔敏辰等人(2007)報(bào)道了 Aspergillususamii利用麩皮、豆柏粉等農(nóng)作物廢棄物為發(fā)酵基質(zhì)，在28-32 °C發(fā)酵64_72h后，木聚糖酶活力達(dá)7783-9616IU/g，為目前國(guó)內(nèi)報(bào)道的最高水平。然而，很多研究主要涉及木聚糖酶活力的提高，而沒有涉及木聚糖酶的實(shí)際應(yīng)用功效，及木聚糖酶實(shí)際降解飼料的酶解效果。王前廣等人(2005)利用體外酶解法快速評(píng)定不同酶制劑在小麥型日糧中的應(yīng)用效果，結(jié)果表明酶活高的木聚糖酶其體外應(yīng)用效果并不一定好。這與本實(shí)驗(yàn)室得到的試驗(yàn)結(jié)果相一致。因此，僅僅通過提高木聚糖酶活力是不能評(píng)判飼用木聚糖酶的作用效果。這個(gè)問題阻礙了木聚糖酶在飼料工業(yè)中的生產(chǎn)與在養(yǎng)殖業(yè)中的規(guī)模使用。許多研究表明，體外模擬法是評(píng)價(jià)酶制劑品質(zhì)的有效方法之一，體外法能夠在一定程度上反映酶制劑的作用效果，并與動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果有較強(qiáng)的一致性。動(dòng)物試驗(yàn)是準(zhǔn)確評(píng)價(jià)酶制劑使用效果的方法。因此，飼用木聚糖酶的品質(zhì)不僅僅是提高木聚糖酶活力，而且還要結(jié)合體外法對(duì)飼料底物的降解效果以及動(dòng)物試驗(yàn)的驗(yàn)證。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是針對(duì)目前固態(tài)發(fā)酵木聚糖酶的研究只側(cè)重酶活的提高，而沒有涉及木聚糖酶的實(shí)際應(yīng)用效果而提出并完成的。首先，本發(fā)明的目的是提供一種能夠高效降解飼料的木聚糖酶的菌株。本發(fā)明的再一目的是提供一種生產(chǎn)高效降解飼料的木聚糖酶的方法。根據(jù)本發(fā)明的能夠高效降解飼料的木聚糖酶的菌株米曲霉(Aspergi I Iusoryzae)Y_l 其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 6842。米曲霉(Aspergillus oryzae)Y_l 自廣東珠海市飼料廠麩皮堆放處周圍土壤中分離得到。首先將土樣用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后用含有O. 5%木聚糖的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，最后固態(tài)發(fā)酵木聚糖酶進(jìn)行復(fù)篩，最終得到米曲霉Y-1。米曲霉Y-1質(zhì)地疏松，初白色、黃色，后變?yōu)楹稚恋G褐色，背面無色。分生孢子頭放射狀，層球形或近球形。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)高效降解飼料的木聚糖酶的方法包括通過發(fā)酵上述米曲霉(Aspergillus oryzae) Y-1得到木聚糖酶的步驟。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)高效降解飼料的木聚糖酶的方法，其中，米曲霉(Aspegillusoryzae) Y-1在固態(tài)培養(yǎng)基上發(fā)酵。所述固態(tài)培養(yǎng)基為麩皮70%，玉米芯30%，硫酸銨3%，磷酸二氫鉀1. 5% (m/m)，料水比1:1-1. 2 (m/m)的發(fā)酵培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)高效降解飼料的木聚糖酶的方法，其中，發(fā)酵工藝為采用曲房多層固態(tài)發(fā)酵方法，將孢子懸浮液噴灑至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，調(diào)節(jié)空氣溫度在30-32°C，控制相對(duì)濕度80%-95%的條件下培養(yǎng)72_84h，然后于45_50°C下低溫干燥。本發(fā)明所提供的木聚糖酶，具有高效降解飼料的能力，即在相同條件下應(yīng)用于體外酶解飼料原料，較其它市售商品木聚糖酶具有顯著的酶解效果(以凈還原糖為指標(biāo))。本發(fā)明所提供的木聚糖酶，具有顯著提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，即動(dòng)物試驗(yàn)顯示小麥型日糧添加本發(fā)明的木聚糖酶后，動(dòng)物的生產(chǎn)性能得到了顯著的提高。本發(fā)明所提供的由米曲霉(Aspergillus oryzae)Y_1產(chǎn)生的木聚糖酶具有高效降解飼料，顯著提高動(dòng)物生產(chǎn)性能的能力，生產(chǎn)過程不產(chǎn)生廢水廢渣，無二次環(huán)境污染，設(shè)備簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，可作為禽、畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的飼料添加劑，使用范圍廣。米曲霉(Aspergillus oryzae)Y_1于2012年11月20日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏編號(hào)是CGMCC No. 6842。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、菌種的分離、篩選1、分離、篩選所用的培養(yǎng)基分離培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂15_20g/L，pH自然，121°C滅菌 20min。初篩培養(yǎng)基在分離培養(yǎng)基中添加O. 5% (m/v)的樺木木聚糖(SigmaX4252_100G)，121°C 滅菌 20min。
復(fù)篩固體發(fā)酵培養(yǎng)基麩皮70%，玉米芯30%，硫酸銨3%，磷酸二氫鉀1. 5%，(m/m),料水比 I 1-1. 2 (m/m)。121°C滅菌 30min。2、分離、篩選的方法及步驟將Ig從廣東珠海市飼料廠麩皮堆放處周圍土壤與9mL無菌水充分混勻，靜置30min后取ImL上層液作為微生物樣品。取ImL微生物樣品，梯度稀釋到10_3、10_4、10_5、10-6、10-7，各取50 μ I均勻涂布于分離培養(yǎng)基(PDA)上，30°C倒置培養(yǎng)72h，再通過稀釋涂板，菌落劃線等方法得到單一純化菌種。吸5μ L菌液滴在初篩培養(yǎng)基的中央，各重復(fù)一次。30°C，培養(yǎng)48h后用O. 4%的剛果紅給平板染色lOmin，然后用IM氯化鈉褪色lh。測(cè)定各菌落的透明圈直徑/菌落直徑(D/d)，依據(jù)(D/d)大小來選擇產(chǎn)酶菌株。選取(D/d)比值大的菌株進(jìn)行復(fù)篩，固態(tài)發(fā)酵完成后測(cè)定木聚糖酶的活力。最終得到產(chǎn)木聚糖酶活力最高為1856U/g干曲的菌株米曲霉Y-1。米曲霉Y-1質(zhì)地疏松，初白色、黃色，后變?yōu)楹稚恋G褐色，背面無色。分生孢子頭放射狀，層球形或近球形。以下實(shí)施例中一、發(fā)酵菌種的制備菌種為發(fā)明人篩選保藏,本發(fā)明經(jīng)篩選所用菌種為米曲霉(Aspergillus oryzae)Y-1 ;菌種的制備分一級(jí)菌種和二級(jí)菌種制備?！?jí)菌種的制備將保藏菌種米曲霉Y-1劃線接種于麥芽汁斜面培養(yǎng)基上，30-32 0C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)84-96h，用無菌水將斜面孢子沖洗干凈，轉(zhuǎn)移至裝有無菌玻璃珠的三角瓶中，震蕩打散，制備成孢子懸浮液。二級(jí)菌種的制備麩皮70%，玉米芯30%，硫酸銨3%，磷酸二氫鉀1. 5% (m/m),每500mL三角瓶裝干料20g，料 水比1:1-1. 2 (m/m)，加水混勻，121 °C滅菌30min，冷卻，分別接一級(jí)菌種1. OmL，攪拌均勻，30-32°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72_84h，用無菌水洗下孢子，制備成孢子懸浮液備用。二、發(fā)酵生產(chǎn)1、發(fā)酵方式采用曲房多層固態(tài)發(fā)酵方法，控溫、控濕、保持通氣。2、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配制先將70%麩皮與30%玉米芯混合均勻，然后將固體基質(zhì)與含有3%硫酸銨和1. 5%磷酸二氫鉀的營(yíng)養(yǎng)鹽溶液按固體基質(zhì)重量1:1-1. 2的比例攪拌均勻，裝入布袋中，經(jīng)121°C滅菌35min。3、發(fā)酵培養(yǎng)待滅菌后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻至常溫后，接固態(tài)培養(yǎng)基重量的10%-15%的二級(jí)菌種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻后進(jìn)行發(fā)酵。曲料厚度為3-4cm，曲盤水平放置，垂直間隔距離為O. 2m，均勻分布在整個(gè)曲房托架上。發(fā)酵進(jìn)行到20-24h，用無菌棒劃線翻曲。調(diào)節(jié)空氣溫度在30-32°C，控制相對(duì)濕度80%-95%的條件下培養(yǎng)72_84h。4、干燥將發(fā)酵結(jié)束的固體基質(zhì)，在45_50°C下低溫氣流干燥，粉碎得到本發(fā)明的木聚糖酶。實(shí)施例2將實(shí)施例1分離的米曲霉Y-1接種于新鮮的麥芽汁斜面上，置于恒溫培養(yǎng)箱中30°C培養(yǎng)84-96h，待斜面長(zhǎng)滿孢子后，加入適量的無菌水洗下孢子，制成一級(jí)種孢子懸液。在500mL的三角瓶中裝入麩皮14g，玉米芯6g，硫酸銨O. 6g，磷酸二氫鉀O. 3g，水20ml，121°C滅菌30min。冷卻后，接米曲霉Yl孢子懸液1. OmL，攪拌均勻，置于恒溫培養(yǎng)箱中30°C培養(yǎng)72-84h，待發(fā)酵培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿孢子，用無菌水洗下孢子，制成二級(jí)種米曲霉孢子懸液。配制50kg干料發(fā)酵培養(yǎng)基(麩皮35kg,玉米芯15kg,硫酸銨1. 5kg,磷酸二氫鉀
O.5kg),加自來水50kg,混合機(jī)攪拌均勻，12TC滅菌35min。冷卻后,接米曲霉I孢子懸液5L均勻噴灑于發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻。采用多層曲盤發(fā)酵，曲料厚度為3-4cm，曲盤水平放置，垂直間隔距離為O. 2m，均勻分布在整個(gè)曲房托架上。調(diào)節(jié)空氣溫度在30-32°C，控制相對(duì)濕度80%-95%。發(fā)酵進(jìn)行到20-24h，用無菌棒劃線翻曲，整個(gè)過程保持溫度和相對(duì)濕度，繼續(xù)培養(yǎng)48h后發(fā)酵結(jié)束。將發(fā)酵料于45-50°C下氣流干燥至含水量8-10%，送入粉碎機(jī)粉碎，檢驗(yàn)合格后，裝Ikg錫紙袋包裝成成品。經(jīng)測(cè)定，所得產(chǎn)品的木聚糖酶活力為2326U/g。實(shí)施例3將米曲霉Yl接種于新鮮的麥芽汁斜面上，置于恒溫培養(yǎng)箱中30°C培養(yǎng)84_96h，待斜面長(zhǎng)滿孢子后，加入適量的無菌水將孢子洗下，制成一級(jí)種孢子懸液。在500mL的三角瓶中裝入麩皮14g,玉米芯6g,硫酸銨O. 6g,磷酸二氫鉀O. 3g,水20ml, 121°C滅菌30min。冷卻后，接米曲霉Yl孢子懸液1. OmL，攪拌均勻，置于恒溫培養(yǎng)箱中30°C培養(yǎng)72_84h，待發(fā)酵培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿孢子，用無菌水洗下孢子，制成二級(jí)種黑曲霉孢子懸液。配制50kg干料發(fā)酵培養(yǎng)基(麩皮35kg,玉米芯15kg,硫酸銨1. 5kg,磷酸二氫鉀
O.5kg),加自來水55kg,混合機(jī)攪拌均勻，121°C滅菌35min。冷卻后,接米曲霉I孢子懸液6L均勻噴灑于發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻。采用多層曲盤發(fā)酵，曲料厚度為3-4cm，曲盤水平放置，垂直間隔距離為O. 2m，均勻分布在整個(gè)曲房托架上。調(diào)節(jié)空氣溫度在30-32°C，控制相對(duì)濕度80%-95%。發(fā)酵進(jìn) 行到20h-24h，用無菌棒劃線翻曲，整個(gè)過程保持溫度和相對(duì)濕度，繼續(xù)培養(yǎng)48h后發(fā)酵結(jié)束。將發(fā)酵料于45-50°C下氣流干燥至含水量8-10%，送入粉碎機(jī)粉碎，檢驗(yàn)合格后，裝Ikg錫紙袋包裝成成品。經(jīng)測(cè)定，所得產(chǎn)品的木聚糖酶活力為2434U/g。實(shí)施例4將米曲霉Yl接種于新鮮的麥芽汁斜面上，置于恒溫培養(yǎng)箱中30°C培養(yǎng)84_96h，待斜面長(zhǎng)滿孢子后，加入適量的無菌水將孢子洗下，制成一級(jí)種孢子懸液。在500mL的三角瓶中裝入麩皮14g,玉米芯6g,硫酸銨O. 6g,磷酸二氫鉀O. 3g,水20mL, 121°C滅菌30min。冷卻后，接米曲霉Yl孢子懸液1. OmL，攪拌均勻，置于恒溫培養(yǎng)箱中30°C培養(yǎng)72_84h，待發(fā)酵培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿孢子，用無菌水洗下孢子，制成二級(jí)種黑曲霉孢子懸液。配制50kg干料發(fā)酵培養(yǎng)基(麩皮35kg,玉米芯15kg,硫酸銨1. 5kg,磷酸二氫鉀
O.5kg),加自來水60kg,混合機(jī)攪拌均勻，121°C滅菌35min。冷卻后,接米曲霉孢子懸液7L均勻噴灑于發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻。采用多層曲盤發(fā)酵，曲料厚度為3-4cm，曲盤水平放置，垂直間隔距離為O. 2m，均勻分布在整個(gè)曲房托架上。調(diào)節(jié)空氣溫度在30-32°C，控制相對(duì)濕度80%-95%。發(fā)酵進(jìn)行到20h-24h，用無菌棒劃線翻曲，整個(gè)過程保持溫度和相對(duì)濕度，繼續(xù)培養(yǎng)48h后發(fā)酵結(jié)束。將發(fā)酵料于45-50°C下氣流干燥至含水量8-10%，送入粉碎機(jī)粉碎，檢驗(yàn)合格后，裝Ikg錫紙袋包裝成成品。經(jīng)測(cè)定,所得產(chǎn)品的木聚糖酶活力為2385U/g。
實(shí)施例5本發(fā)明的木聚糖酶與其它市售商品木聚糖酶對(duì)飼料體外酶解比較通過發(fā)酵本發(fā)明的米曲霉Yl制備的木聚糖酶，具有高效降解飼料的能力。體外酶處理飼料及其原料方法稱飼料或飼料原料IOg于300ml三角瓶中，按料水比1:10加入
O.1M pH5. 5的乙酸乙酸鈉緩沖液100ml，加酶量為50U/g飼料，于40°C恒溫振蕩酶解5h。反應(yīng)結(jié)束后加入5ml 10%三氯乙酸處理lOmin，酶解液于4000r/min離心lOmin，收集上清液，DNS法測(cè)定還原糖含量。結(jié)果見表I。表I本發(fā)明的木聚糖酶與其它市售商品木聚糖酶對(duì)飼料體外酶解比較
權(quán)利要求
1.高效降解飼料的米曲霉(Aspergillusoryzae)菌株Y_l,其保藏編號(hào)為CGMCCNo. 6842。
2.—種生產(chǎn)高效降解飼料的木聚糖酶的方法，其特征在于，所述方法包括通過發(fā)酵權(quán)利要求I所述米曲霉(Aspegillus oryzae) Υ-1得到木聚糖酶的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,所述米曲霉(Aspergillusoryzae) Y-1在固態(tài)培養(yǎng)基上發(fā)酵，所述固態(tài)培養(yǎng)基為麩皮70%，玉米芯30%，硫酸銨3%，磷酸二氫鉀1. 5%(m/m),料水比1:1-1. 2 (m/m)的發(fā)酵培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，采用固態(tài)發(fā)酵方法，將孢子懸浮液噴灑至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，調(diào)節(jié)空氣溫度在30-32 °C，控制相對(duì)濕度80%-95%的條件下培養(yǎng)72-84h，然后于45-50°C下低溫干燥。
全文摘要
本發(fā)明涉及發(fā)酵領(lǐng)域，具體地，涉及能生產(chǎn)高效降解飼料底物的木聚糖酶的米曲霉及生產(chǎn)木聚糖酶的方法。根據(jù)本發(fā)明的能夠高效降解飼料的木聚糖酶的菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)Y-1其保藏編號(hào)為CGMCC No.6842。發(fā)明所提供的由米曲霉(Aspergillus oryzae)Y-1產(chǎn)生的木聚糖酶具有高效降解飼料，顯著提高動(dòng)物生產(chǎn)性能的能力，生產(chǎn)過程不產(chǎn)生廢水廢渣，無二次環(huán)境污染，設(shè)備簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，可作為禽、畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的飼料添加劑，使用范圍廣。
文檔編號(hào)C12N9/42GK103060202SQ201210529320
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者周平發(fā), 王敏, 崔細(xì)鵬, 謝志恒, 翁曉輝, 史寶軍 申請(qǐng)人:廣東溢多利生物科技股份有限公司