專利名稱：解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微孔反應板的檢測技術，具體是一種解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum, Uu)和微小脲原體(Ureaplasma parvum, Up)的檢測方法。
背景技術：
支原體(Mycoplasma)是一類介于細菌和病毒之間，沒有細胞壁，能通過細菌濾器，能在人工培養(yǎng)基上生長繁殖的最小原核生物 。支原體歸屬于柔膜體綱，支原體目，支原體科。支原體科分為支原體，血蟲體，血巴爾通體和脲原體4個屬。其中，多項研究證明脲原體屬的解脲脲原體與女性泌尿生殖道的非淋菌性尿道炎、流產(chǎn)、早產(chǎn)、低體重兒等密切相關。Janet等于1984年報道金屬錳離子對Uu有抑制作用。ImM錳離子不僅抑制解脲脲原體在液體培養(yǎng)基中的生長或減少其生長比例，同時也改變其菌落形態(tài)和細胞的超微結構。然而這種抑制效應是獨立的而且具有種特異性，正是由于這種差別，Janet把解脲脲原體劃分為兩種生物群即 parvum群(Ureaplasma parvum, Up)和urealyticum群(Ureaplasmaurealyticum, Uu)(對于parvum群,猛離子對其生長的抑制是短暫的而對于urealyticum群卻是永久的。)。這是最早的對Uu和Up的劃分。隨著分子生物學的發(fā)展，從基因水平對脲原體進行了在系統(tǒng)發(fā)生學上的深入研究，Kong等報道在16SrRNA基因序列上Uu和Up存在1%位點的差異特別是在176、177和180-183位點，而它們的各血清型之間卻是一致的。同時Kong也對Uu和Up的16_23SrRNA基因間隔區(qū)進行了比對，發(fā)現(xiàn)它們之間有14個堿基的差別，而內部各血清型之間也是相似的。隨后Uu和Up之間在脲酶基因、MBA抗原、基因大小等處的差異也相繼報道，從而進一步提出了 Up作為一個獨立的新種即微小脲原體命名的觀點。在臨床致病性上，張帝開等研究表明，在健康婦女中Up為主要的脲原體(82. 5%)，且以血清1、3、6型的單型別陽性為主(共占87. 1%)。KONG等用宮頸拭子直接用PCR法檢測解脲脲原體，共調查了 100例孕婦，解脲脲原體總體陽性率58%，其中Up占91. 4 %。這個提示Up是正常人群攜帶菌的可能性較大。與此同時有研究指出，Uu和Up的毒力不同，其致病性亦不同，Uu或其中的某個血清型更容易致病。有學者認為Uu產(chǎn)脲酶量多，與Up相比，對宿主細胞的毒性更大，致病性更強。因此，2007年國際細菌學分類學會正式做出把解脲脲原體原來的parvum群分出獨立命名為新的物種微小脲原體而urealyticum群仍保留原解脲脲原體命名的決定。當前在我國臨床對解脲脲原體的檢測主要是培養(yǎng)法，以液體培養(yǎng)基顏色變紅診斷為陽性。然而，泌尿生殖道中常含有其他具有脲酶基因的微生物(如，變形桿菌、衣原體等)均可導致培養(yǎng)基變紅，故以培養(yǎng)基顏色判讀結果常出現(xiàn)假陽性的情況。同時，由于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法只能檢測出有脲原體的存在而不能準確對其進行Uu和Up的鑒別，這就限制了不同物種與臨床疾病關系的研究和流行病學的調查。因此，建立一種準確、快速同時能進行Uu和Up檢測鑒定的方法將具有重要的臨床意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明就是為了解決以液體培養(yǎng)基顏色改變判斷陽性結果的常規(guī)培養(yǎng)法出現(xiàn)假陽性結果，且不能準確對其進行Uu和Up鑒別的問題，而提供的一種具有重要的臨床意義的解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法。本發(fā)明是按以下技術方案實現(xiàn)的。一種解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其是按以下步驟進行的 ①.在分別包被有Uu和Up特異性探針的DNA-BINDING96孔測定板微孔內，分別加入20 μ I經(jīng)PCR擴增后熱變性處理的臨床樣本；
另將分別包被有Uu和Up特異性探針的DNA-BINDING96孔測定板4個陽性對照孔內，分別加入經(jīng)PCR擴增后熱變性處理的Uu血清型8標準株產(chǎn)物和Up血清型3標準株產(chǎn)物各20μ I ；
上述各孔分別加180 μ I雜交液混勻，65 1溫箱雜交60min，棄液后，用O. 1%SDS洗液
II、TBST洗板，棄液拍干；
②.每孔加入鏈霉親和素辣根過氧化物酶封閉液I: 1000稀釋的混合物50 μ I，室溫放置30分鐘，用TBST洗板后加入含1%SDS的洗液II 200 μ I浸泡15分鐘；再用TBST洗滌，晾干；
③.每孔各加入顯色底物Α、B各50μ I，混勻后置于暗處顯色20分鐘，最后加入終止液50 μ I,以顏色變化判斷結果；
④.經(jīng)PCR擴增后熱變性處理的臨床樣本加入終止液后，包被Uu探針的孔變黃或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值大于O. 500，而包被Up探針的孔為無色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值小于O. 200則證明Uu陽性；
包被Uu探針的孔為無色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值小于O. 200，而包被Up探針的孔為黃色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值大于O. 500則證明Up陽性；Uu、Up探針孔同時為黃色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值均大于O. 500則證明同時感染Uu和Up ；而同時為無色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值均小于O. 200則證明無Uu和Up感染；Uu陽性對照Uu探針孔為黃色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值大于O. 500，Up探針孔為無色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值小于O. 200 ；
Up陽性對照Uu探針孔為無色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值小于O. 200，Up探針孔為黃色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值大于O. 500。所述解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其所述PCR擴增后熱變性處理的臨床樣本，是將女性受檢者宮頸和陰道分泌物或男性首段尿提取菌液的核酸DNA，經(jīng)PCR擴增后，100 1水浴變性10分鐘后，立即冰浴5分鐘獲得的；
所述解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其所述經(jīng)PCR擴增后熱變性處理的Uu血清型8標準株產(chǎn)物和Up血清型3標準株產(chǎn)物，是經(jīng)100 1水浴變性10分鐘后，立即冰浴5分鐘獲得的。所述一種解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其Uu特異性探針的核酸序列為5’ NH2-C12-AGC AAT TAA CTT CGC TGA AGG C 3’。所述一種解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其Up特異性探針的核酸序列為5’ NH2-C12-GGC AAT TAA TTT CGC TAG TGG T 3’。這樣設計的本發(fā)明，在對擴增產(chǎn)物的觀測上，采用基于DNA-BINDING96孔板的微反應板的核酸雜交反應進行PCR產(chǎn)物的檢測。該反應過程，與傳統(tǒng)的PCR產(chǎn)物電泳檢測相t匕，提高了檢測的敏感度，同時也實現(xiàn)了高通量的檢測，不僅解決以液體培養(yǎng)基顏色改變判斷陽性結果出現(xiàn)假陽性結果的問題，還能準確地進行Uu和Up的鑒別，可廣泛用于臨床篩查。


附圖是本發(fā)明吸光度值坐標圖。
具體實施方案
下面結合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細說明。I.標本女性的宮頸和陰道分泌物；男性首段尿IOml ；
Uu,Up陽性對照Up血清型3標準菌株(ATCC 27815)和Uu血清型8標準菌株(ATCC27618),購自 American Type Culture Collection, ATCC。2.標本核酸DNA的提取
a.用無菌棉拭子分別采集女性的宮頸和陰道分泌物，洗脫在磷酸緩沖液(PBS:磷酸二氫鉀(KH2P04) :0. 27g，磷酸氫二鈉(Na2HP04) :1.42g，氯化鈉(NaCl) :8g，氯化鉀(KCl) O. 2g,加去離子水約800mL充分攪拌溶解,然后加入濃鹽酸調pH至7. 4,最后定容到IL0高溫高壓滅菌后室溫保存。)中，12，000轉/分，離心10分鐘，棄去上清液，用Iml生理鹽水溶解沉淀，取Iml加入EP管中，用細菌基因組提取試劑盒(DP302，天根生化科技有限公司，北京)提取核酸，步驟如下
⑴取含有Iml菌液的EP管，10, 000轉/分Γ ，500Χ克)離心I分鐘，盡量吸凈上清。⑵向菌體沉淀中加入200 μ I緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮。⑶向管中加入20 μ I蛋白酶K溶液，混勻。⑷加入220 μ I緩沖液GB，振蕩15秒，70°C放置10分鐘，溶液應變清涼，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。(5)加220 μ I無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。(6)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000轉/分Γ13，400Χ克)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。(7)向吸附柱CB3中加入500 μ I緩沖液GD，12，000轉/分Γ13，400克)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。(8)向吸附柱CB3中加入600 μ I漂洗液PW，12，000轉/分Γ13，400克)離心30秒，
倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。⑶重復操作步驟8。(10)將吸附柱CB3放回收集管中，12，000轉/分Γ13，400克)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
(11)將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 μ I洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12，000轉/分Γ13，400克)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。b.用無菌尿液收集管，收集男性首段尿10ml，12，000轉/分，離心10分鐘，棄去上層尿液，用Iml生理鹽水溶解沉淀，取Iml加入EP管，按上述步驟提取菌液的核酸DNA。3. PCR擴增反應
本發(fā)明采用特異性擴增Uu和Up脲酶基因的引物，對臨床標本和Uiu Up陽性對照進行特異性PCR擴增。PCR 反應體系 PCR 反應系(50μ I) :2XTaq PCR MasterMix (KT201,天根，北京)25μ 1，上游引物U5 2μ I,下游引物U4 2μ I,去離子水18. 5μ1,標本核酸提取液 2. 5 μ I。所述上游引物U5:5，CAA TCT GCT CGT GAA GTA TTA C 3，；
下游引物U4: 5，Biotin-ACG ACG TCC ATA AGC AAC T 3’。PCR反應條件94°C 3分鐘，94°C 30秒，56°C I分鐘共35循環(huán)，然后72 °C 5分鐘。4. PCR產(chǎn)物微孔板雜交
a.用于區(qū)分Uu和Up特異性探針的設計本發(fā)明采用特異性擴增Uu和Up脲酶基因的引物，利用Genbank數(shù)據(jù)庫找出該引物所擴增的Uu和Up的核酸序列，并用Blast軟件比對找出Uu和Up之間的差異，最后依據(jù)差異設計特異性Uu和Up的捕獲探針。Uu 的特異性探針核酸序列為:5，NH2-C12-AGC AAT TAA CTT CGC TGA AGG C 3，； Up 的特異性探針核酸序列為:5，NH2-C12-GGC AAT TAA TTT CGC TAG TGG T 3’。b.選擇包被核酸的微孔板本發(fā)明采用DNA-BIND96孔微孔板(購自Corning LifeScience, American),該微孔板能較容易的結合5’端或3’端有氨基修飾的核酸,使核酸能穩(wěn)定的包被到微孔板上。c.捕獲探針的包被用包被液(Na2HP04 · 2H20 179. 07g, EDTANa2 · 2H20 O. 372g,用NaOH調PH8. 5，最后定容至1L)稀釋Uu、Up探針，使其終濃度為1000nmol/l，每孔加50 μ IUu或Up探針到DNA結合微孔板上；封孔后置37 V I小時或4 °C過夜，棄液，用TBST (Tris3g, NaCl 8. 0g, KCl O. 2g溶解于800ml蒸餾水中，用lmol/L HCl調PH至8. 0，補充蒸餾水至1L，加O. 5mlTween-20 (JF0134,上海源葉生物科技有限公司))洗3次，洗去未結合的Uu、Up探針。再加入200μ1/孔封閉液(O. Ig胎牛血清白蛋白(BSA) (D0008-1，上海滬宇生物科技有限公司)，2mg賴氨酸溶于ImlTBST中)，封閉未結合位點，37 °C，60分鐘后棄去。d. PCR產(chǎn)物雜交，取臨床樣本的PCR擴增產(chǎn)物40 μ 1，100 1水浴變性10分鐘后立即置冰浴5分鐘。將熱變性的PCR擴增產(chǎn)物分別加入包被有Uu、Up探針的DNA結合微孔板內各加入20 μ 1，接著加入180 μ I 65°C預熱的雜交液(20 X SSC 10ml，去離子水30ml，十二烷基硫酸鈉(SDS) O. 04g, 20 X SSC:NaCl 175g，檸檬酸三鈉88g，溶解于800ml去離子水中，加入IOmoVlNaOH調節(jié)PH至7. 0，定容至1L)，混勻，65°C溫箱雜交60min。棄液后，用65 V預溫的0. 1%SDS洗液II (2 X SSC, 0. 1%SDS. 2 X SSC由20 X SSC稀釋10被而來)洗滌3次，然后用TBST再洗一次，棄液，拍干。每孔加鏈霉親和素辣根過氧化物酶封閉液為I : 1000稀釋的混合物50 μ 1，室溫放置30分鐘；用BST洗3次，然后加入含1%SDS的洗液II 200 μ I浸泡15分鐘；再用TBST洗2遍，晾干。加入顯色底物A(檸檬酸鈉，Η202)、B (四甲基聯(lián)苯胺(TMB))各50 μ 1，混勻后置于暗處顯色20分鐘，加入終止液(lmol/1 H2S04)50y I,以顏色變化判斷結果。另外，用Uu血清型8標準株(ATCC27618)和Up血清型3標準株(ATCC27815)取PCR擴增后熱變性處理的產(chǎn)物，分別作為Uu、Up陽性對照孔。5.結果判讀，參照附表。包被Uu探針的孔變黃或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值大于O. 500，而同時包被Up探針的孔為無色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值小于O. 200則證明Uu陽性； 包被Uu探針的孔為無色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值小于O. 200，而同時包被Up探針的孔為黃色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值大于O. 500則證明Up陽性；Uu、Up探針孔同時為黃色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值均大于O. 500則證明同時感染Uu和Up ;同時為無色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值均小于O. 200則證明無Uu和Up感染；
Uu陽性對照Uu探針孔為黃色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值均大于O. 500，Up探針孔為無色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值小于O. 200 ；
Up陽性對照Uu探針孔為無色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值小于O. 200，Up探針孔為黃色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值均大于O. 500。結合附表可知結果如下
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SEQUENCE LISTING<110>天津醫(yī)科大學
〈120〉解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法
〈130〉I
〈160〉2
<170>PatentIn version 3.3
〈210〉I
〈211〉22
〈212〉DNA
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum〈220〉
〈221〉Uu
〈222〉(1)..(22)
〈400〉I
agcaattaac ttcgctgaag gc22〈210〉2
〈211〉22
〈212〉DNA
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum〈220〉
〈221〉Up
〈222〉(1)..(22)
〈400〉I
ggcaattaat ttcgctagtg gt22。
權利要求
1.一種解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其是按以下步驟進行的 ①.在分別包被有Uu和Up特異性探針的DNA-BINDING96孔測定板微孔內，分別加入20 ill經(jīng)PCR擴增后熱變性處理的臨床樣本； 另將分別包被有Uu和Up特異性探針的DNA-BINDING96孔測定板4個陽性對照孔內，分別加入經(jīng)PCR擴增后熱變性處理的Uu血清型8標準株產(chǎn)物和Up血清型3標準株產(chǎn)物各20u I ； 上述各孔分別加180 u I雜交液混勻，65 1溫箱雜交60min，棄液后，用0. 1%SDS洗液II、TBST洗板，棄液拍干； ②.每孔加入鏈親和素辣根過氧化物酶封閉液I: 1000稀釋的混合物50 Ul，室溫放置30分鐘，用200 u I TBST洗板后加入含1%SDS的洗液II浸泡15分鐘；再用TBST洗漆，晾干； ③.每孔各加入顯色底物A、B各50Ul，混勻后置于暗處顯色20分鐘，最后加入終止液50 u I,以顏色變化判斷結果； ④.經(jīng)PCR擴增后熱變性處理的臨床樣本加入終止液后，包被Uu探針的孔變黃或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值大于0. 500，而同時包被Up探針的孔為無色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值小于0. 200則證明Uu陽性； 包被Uu探針的孔為無色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值小于0. 200，而同時包被Up探針的孔為黃色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值大于0. 500則證明Up陽性； Uu,Up探針孔同時為黃色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值均大于0. 500則證明同時感染Uu和Up ;而同時為無色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值均小于0. 200則證明無Uu和Up感染； Uu陽性對照Uu探針孔為黃色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值均大于0. 500，Up探針孔為無色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值小于0. 200 ； Up陽性對照Uu探針孔為無色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值小于0. 200，Up探針孔為黃色或經(jīng)酶標儀在450nm處測定吸光度值均大于0. 500。
2.根據(jù)權利要求I所述解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其特征在于所述PCR擴增后熱變性處理的臨床樣本，是將女性受檢者宮頸和陰道分泌物或男性首段尿提取菌液的核酸DNA，經(jīng)PCR擴增后，100 1水浴變性10分鐘后，立即冰浴5分鐘獲得的。
3.根據(jù)權利要求I所述解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其特征在于所述經(jīng)PCR擴增后熱變性處理的Uu血清型8標準株產(chǎn)物和Up血清型3標準株產(chǎn)物，是經(jīng)100 °C水浴變性10分鐘后，立即冰浴5分鐘獲得的。
4.根據(jù)權利要求I所述一種解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其特征在于Uu特異性探針的核酸序列為:5，NH2-C12-AGC AAT TAA CTT CGC TGA AGG C。
5.根據(jù)權利要求3所述一種解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其特征在于Up特異性探針的核酸序列為5’ NH2-C12-GGC AAT TAA TTT CGC TAG TGG T。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，屬于微孔反應板的檢測技術。本發(fā)明是在包被有Uu和Up特異性探針的DNA-BINDING96孔測定板微孔內，分別加入經(jīng)PCR擴增后熱變性處理的臨床樣本，另外設立分別加入Uu、Up血清型標準株PCR擴增后熱變性處理的陽性對照孔；經(jīng)溫箱雜交后洗板，拍干；每孔加入鏈親和素辣根過氧化物酶結合物，后經(jīng)洗板，晾干；每孔加入顯色底物A、B，混勻后暗處顯色，最后加入終止液，以顏色變化判斷結果。本發(fā)明不僅解決了以液體培養(yǎng)基顏色改變判斷陽性結果出現(xiàn)假陽性的問題，還能準確地進行Uu和Up的鑒別，提高了檢測的敏感度，同時也實現(xiàn)了高通量的檢測，可廣泛用于臨床篩查。
文檔編號C12Q1/68GK102952888SQ201210530739
公開日2013年3月6日 申請日期2012年12月11日 優(yōu)先權日2011年12月20日
發(fā)明者劉運德, 王蓉, 李雪, 張楠, 谷亞軍, 鮑會靜, 齊新, 李建 申請人:天津醫(yī)科大學