專利名稱：人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是源自中胚層的一類干細(xì)胞，近些年研究發(fā)現(xiàn)MSC具有良好的可塑性和擴(kuò)增能力，能為病損組織的修復(fù)再生提供祖細(xì)胞。Arnold1. caplan認(rèn)為“利用培養(yǎng)法擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞對特定組織進(jìn)行的大量重建或修復(fù)，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了它們的正常利用和實(shí)用范圍?！币虼耍煌M織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞成為各研究組的研究熱點(diǎn)。臍帶來源的MSC因來源充足且無創(chuàng)性，擴(kuò)增技術(shù)成熟，成為許多研究小組設(shè)計(jì)大量擴(kuò)增方案的聚焦點(diǎn)。C6cile DB研究組在培養(yǎng)第3代獲得> 7X IO9個(gè)細(xì)胞；Fong CY研究組的培養(yǎng)方案臍帶MSC的生產(chǎn)效應(yīng)是100%，獲得的細(xì)胞數(shù)約為4 X IO6至5 X IO6個(gè)細(xì)胞/cm2臍帶；有些研究技術(shù)使臍帶的生產(chǎn)效應(yīng)能達(dá)到100%但收獲的細(xì)胞數(shù)卻只夠或不夠一個(gè)病人的治療劑量；有些研究技術(shù)臍帶擴(kuò)增到第3代的細(xì)胞數(shù)量是最多達(dá)7X109，這些擴(kuò)增方案的細(xì)胞收獲量均未突破IO9個(gè)細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法，克服了上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，其能有效解決目前獲取人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的方法收獲人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的量過少而造成無法滿足治療劑量的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案是 通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法，按下述步驟進(jìn)行第一步，在無菌條件下人臍帶活組織，洗凈，切碎成組織碎塊；第二步，將組織碎塊放入培養(yǎng)皿中 ，并向其中加入低糖混合培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3天至4天培養(yǎng)皿換一次低糖混合培養(yǎng)液；第三步，待培養(yǎng)皿中的組織碎塊周邊有梭形細(xì)胞爬出時(shí)后，將組織碎塊移入新的培養(yǎng)皿中內(nèi)，并向新的培養(yǎng)皿中加入低糖混合培養(yǎng)液，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)；第四步，反復(fù)重復(fù)第三步，直至最后一次轉(zhuǎn)移的培養(yǎng)皿中的組織碎塊周邊不再有梭形細(xì)胞長出。下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)
上述CO2培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件可為37°C、3. 6% CO2、飽和濕度。上述第一步中可將活組織洗凈后切碎成2 mm3至3mm3的小塊。上述在第四步之后，可將每次轉(zhuǎn)移出組織碎塊后的培養(yǎng)皿底粘附的梭形細(xì)胞用低糖混合培養(yǎng)液培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長匯合為80%至95%后用胰蛋白酶消化獲得細(xì)胞，收集獲得后的細(xì)胞，離心，棄上清液，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度按要求密度重新接種入新培養(yǎng)皿中并向其中加入低糖混合培養(yǎng)液，待新培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞生長匯合達(dá)80%至95%后繼續(xù)按此步驟進(jìn)行消化。上述胰蛋白酶的濃度可為O. 5g/L至2. 5g/L，其中還添加有O. 53mmol/L的EDTA-Na2O
上述離心條件為轉(zhuǎn)速可為1000r/min至1500r/min、時(shí)間為5min至lOmin。上述進(jìn)行重新接種時(shí)的要求密度可為5 X IO3個(gè)細(xì)胞/cm2培養(yǎng)皿底面積至10 X IO3個(gè)細(xì)胞/cm2培養(yǎng)皿底面積。上述低糖混合培養(yǎng)液可為向低糖DMEM培養(yǎng)液中分別加入胎牛血清、L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉、L- α -磷酸抗壞血酸和青-鏈霉素溶液形成混合培養(yǎng)液，混合培養(yǎng)液中胎牛血清的體積濃度為15%、L-谷氨酰胺的濃度為2mM、碳酸氫鈉的濃度為10. 2mM、L-α -磷酸抗壞血酸的濃度為50 μ g/mL、青霉素的濃度為100u/ml、鏈霉素的濃度為100ug/ml。本發(fā)明利用反復(fù)轉(zhuǎn)移使臍帶組織中的細(xì)胞反復(fù)移出，再將此細(xì)胞反復(fù)進(jìn)行培養(yǎng)，從而達(dá)到大量獲得細(xì)胞的目的，生產(chǎn)效應(yīng)在100%的基礎(chǔ)上，提高細(xì)胞的收獲量，培養(yǎng)第3代獲得4. 04 X 101°個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)第6代獲得1. 56 X IO12個(gè)細(xì)胞，為臨床組織工程和基因治療提供充足的細(xì)胞源。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案與實(shí)際情況來確定具體的實(shí)施方式。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述
實(shí)施例1，該人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法按下述步驟進(jìn)行第一步，在無菌條件下人臍帶活組織，洗凈，切碎成組織碎塊；第二步，將組織碎塊放入培養(yǎng)皿中，并向其中加入低糖混合培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3天至4天培養(yǎng)皿換一次低糖混合培養(yǎng)液；第三步，待培養(yǎng)皿中的組織碎塊周邊有梭形細(xì)胞爬出時(shí)后，將組織碎塊移入新的培養(yǎng)皿中內(nèi)，并向新的培養(yǎng)皿中加入低糖混合培養(yǎng)液，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)；第四步，反復(fù)重復(fù)第三步，直至最后一次轉(zhuǎn)移的培養(yǎng)皿中的組織碎塊周邊不再有梭形細(xì)胞長出?？筛鶕?jù)實(shí)際需要，對上述人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法作進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)
實(shí)施例2，作為上述實(shí)施例的優(yōu)選，CO2培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為37°C、3. 6% CO2、飽和濕度。3. 6% CO2中的百分?jǐn)?shù)為體積百分?jǐn)?shù)。實(shí)施例3，作為上述實(shí)施例的優(yōu)選，第一步中將活組織洗凈后切碎成2 mm3至3mm3的小塊。實(shí)施例4，與上述實(shí)施例的不同之處在于，在第四步之后，將每次轉(zhuǎn)移出組織碎塊后的培養(yǎng)皿底粘附的梭形細(xì)胞用低糖混合培養(yǎng)液培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長匯合為80%至95%后用胰蛋白酶消化獲得細(xì)胞，收集獲得后的細(xì)胞，離心，棄上清液，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度按要求密度重新接種入新培養(yǎng)皿中并向其中加入低糖混合培養(yǎng)液，待新培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞生長匯合達(dá)80%至95%后繼續(xù)按此步驟進(jìn)行消化。80%和95%分別為匯合生長后細(xì)胞總面積占培養(yǎng)皿底面積的百分?jǐn)?shù)。實(shí)施例5，作為上述實(shí)施例的優(yōu)選，胰蛋白酶的濃度為O. 5g/L至2. 5g/L，其中還添加有 O. 53mmol/L 的 EDTA-Na2。實(shí)施例6,作為上述實(shí)施例的 優(yōu)選,離心條件為轉(zhuǎn)速為1000r/min至1500r/min、時(shí)間為 5min 至 IOmin。
實(shí)施例7，作為上述實(shí)施例的優(yōu)選，進(jìn)行重新接種時(shí)的要求密度為5X103個(gè)細(xì)胞/cm2培養(yǎng)皿底面積至IOX IO3個(gè)細(xì)胞/cm2培養(yǎng)皿底面積。實(shí)施例8，作為上述實(shí)施例的優(yōu)選，低糖混合培養(yǎng)液為向低糖DMEM培養(yǎng)液中分別加入胎牛血清、L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉、L- α -磷酸抗壞血酸和青-鏈霉素溶液形成混合培養(yǎng)液，混合培養(yǎng)液中胎牛血清的體積濃度為15%、L-谷氨酰胺的濃度為2mM、碳酸氫鈉的濃度為10. 2mM、L-α -磷酸抗壞血酸的濃度為50 μ g/mL、青霉素的濃度為100u/ml、鏈霉素的濃度為100ug/ml。實(shí)施例9，一種人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法按下述步驟進(jìn)行第一步，無菌條件下將人臍帶活組織切碎成2 mm3至3mm3的組織碎塊；第二步，將組織碎塊加入低糖混合培養(yǎng)液中，置入37°C、3. 6%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天至4天培養(yǎng)皿換一次低糖混合培養(yǎng)液；第三步，培養(yǎng)15天至20天后見組織碎塊周邊有細(xì)胞移出，并生長為梭形細(xì)胞時(shí)將組織碎塊移入新培養(yǎng)皿中，新培養(yǎng)皿中加入半量新的低糖混合培養(yǎng)液對組織碎塊繼續(xù)培養(yǎng)，3天至5天后組織碎塊周邊又有移出細(xì)胞長成梭形；第四步，此時(shí)將組織碎塊再次移入新的培養(yǎng)皿中，組織塊反復(fù)轉(zhuǎn)移至少可達(dá)20次以上，直至培養(yǎng)的組織塊周邊不再有梭形細(xì)胞長成；第五步，轉(zhuǎn)移出組織碎塊的培養(yǎng)皿加入半量新的低糖混合培養(yǎng)液對細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至80%至95%并成漩渦狀時(shí)，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，將收獲細(xì)胞計(jì)數(shù)后按8X IO3/ cm2進(jìn)行分皿接種，為培養(yǎng)的第一代細(xì)胞，按此進(jìn)行反復(fù)消化、分皿接種和培養(yǎng)，每輪細(xì)胞培養(yǎng)至第3代至6代。3. 6% CO2中的百分?jǐn)?shù)為體積百分?jǐn)?shù),80%和95%分別為匯合生長后細(xì)胞總面積占培養(yǎng)皿底面積的百 分?jǐn)?shù)。
權(quán)利要求
1.一種人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法，其特征在于按下述步驟進(jìn)行 第一歩，在無菌條件下人臍帶活組織，洗浄，切碎成組織碎塊； 第二步，將組織碎塊放入培養(yǎng)皿中，并向其中加入低糖混合培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3天至4天培養(yǎng)皿換一次低糖混合培養(yǎng)液； 第三步，待培養(yǎng)皿中的組織碎塊周邊有梭形細(xì)胞爬出時(shí)后，將組織碎塊移入新的培養(yǎng)皿中內(nèi)，并向新的培養(yǎng)皿中加入低糖混合培養(yǎng)液，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)； 第四步，反復(fù)重復(fù)第三步，直至最后一次轉(zhuǎn)移的培養(yǎng)皿中的組織碎塊周邊不再有梭形細(xì)胞長出。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法，其特征在于CO2培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為37°C、3. 6% CO2、飽和濕度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法，其特征在于第一歩中將活組織洗浄后切碎成2 mm3至3mm3的小塊。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法，其特征在于在第四步之后，將每次轉(zhuǎn)移出組織碎塊后的培養(yǎng)皿底粘附的梭形細(xì)胞用低糖混合培養(yǎng)液培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長匯合為80%至95%后用胰蛋白酶消化獲得細(xì)胞，收集獲得后的細(xì)胞，離心，棄上清液，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度按要求密度重新接種入新培養(yǎng)皿中井向其中加入低糖混合培養(yǎng)液，待新培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞生長匯合達(dá)80%至95%后繼續(xù)按此步驟進(jìn)行消化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法，其特征在于胰蛋白酶的濃度為 0. 5g/L 至 2. 5g/L，其中還添加有 0. 53mmol/L 的 EDTA-Na^
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法，其特征在于離心條件為轉(zhuǎn)速為 1000r/min 至 1500r/min、時(shí)間為 5min 至 lOmin。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6所述的人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法，其特征在于進(jìn)行重新接種時(shí)的要求密度為5 X IO3個(gè)細(xì)胞/cm2培養(yǎng)皿底面積至IOX IO3個(gè)細(xì)胞/cm2培養(yǎng)皿底面積。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7所述的人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法，其特征在于低糖混合培養(yǎng)液為向低糖DMEM培養(yǎng)液中分別加入胎牛血清、L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉、L- a -磷酸抗壞血酸和青-鏈霉素溶液形成混合培養(yǎng)液，混合培養(yǎng)液中胎牛血清的體積濃度為15%、L-谷氨酰胺的濃度為2mM、碳酸氫鈉的濃度為10. 2mM、L-a -磷酸抗壞血酸的濃度為50 ii g/mL、青霉素的濃度為100u/ml、鏈霉素的濃度為100ug/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法，一種人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的獲得方法，按下述步驟進(jìn)行第一步，在無菌條件下人臍帶活組織，洗凈，切碎成組織碎塊；第二步，將組織碎塊放入培養(yǎng)皿中，并向其中加入低糖混合培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3天至4天培養(yǎng)皿換一次低糖混合培養(yǎng)液。本發(fā)明利用反復(fù)轉(zhuǎn)移使臍帶組織中的細(xì)胞反復(fù)移出，再將此細(xì)胞反復(fù)進(jìn)行培養(yǎng)，從而達(dá)到大量獲得細(xì)胞的目的，生產(chǎn)效應(yīng)在100%的基礎(chǔ)上，提高細(xì)胞的收獲量，培養(yǎng)第3代獲得4.04×1010個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)第6代獲得1.56×1012個(gè)細(xì)胞，為臨床組織工程和基因治療提供充足的細(xì)胞源。
文檔編號C12N5/077GK103045537SQ20121053117
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者溫浩, 江明, 馬艷, 盧曉梅, 朱啟英, 畢曉娟, 段顯琳 申請人:新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院