專利名稱：一種新城疫病毒核酸rt-pcr檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒檢測方法，更具體的講是一種新城疫病毒核酸RT-PCR檢測的方法。
背景技術(shù)：
新城疫((Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV )引起禽的一種急性、烈性傳染性疾病，給養(yǎng)禽業(yè)和珍禽業(yè)帶來極大的經(jīng)濟損失。另外從多種野禽如麻雀、鴿、烏鴉等中也已分離出NDV。融合蛋白F是NDV感染細胞所必需的。病毒囊膜與靶細胞融合，使病毒進入細胞內(nèi)進行復制，融合的過程就是靠F蛋白來實現(xiàn)。大量的研究表明，NDV的F蛋白F1/F2多肽裂解位點氨基酸的基序和NDV的毒力密切相關(guān)，其致病機理已通過反向遺傳操作技術(shù)得以證實。F蛋白通常以無活性的H)前體形式存在，但 H)必須裂解成以二硫鍵連接的Fl和F2亞單位后，才使病毒具有感染性。F蛋白能否被裂解取決于病毒毒力的強弱和宿主細胞的特性。FO的裂解是病毒與細胞融合所必需的，也是病毒感染所必需的。強毒株的氨基酸基序為112R/K-R-Q-K/R-R_F117，弱毒株的基序為112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117,兩種情況都是在117位前裂解。對病毒的檢測可以取內(nèi)臟組織、泄殖腔和氣管棉拭子或排泄物，但有些時候如對野禽和飛禽進行調(diào)查時則需取糞便進行檢測。直接取糞便檢測病毒核酸，相對省 時，但是由于樣本中毒量較少，容易漏檢。發(fā)明內(nèi)容
針對以上不足，本發(fā)明提供了一種新城疫病毒核酸RT-PCR檢測的方法，本發(fā)明的方法是取待檢禽的糞便，用滅菌生理鹽水研磨成乳懸液，無菌處理后接種SPF雞胚，收集雞胚尿囊液，再提取其全基因組RNA，以RNA為模板，以F為靶基因的引物進行RT-PCR，隨后對得到的產(chǎn)物進行電泳，根據(jù)電泳圖譜分析被檢禽糞便中是否感染有新城疫病毒，對目的片段進行測序可判斷出新城疫病毒強弱毒株，不宜發(fā)生漏檢現(xiàn)象。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種新城疫病毒核酸RT-PCR檢測的方法，包括以下步驟(O病毒增殖取需要檢測的動物糞便，將質(zhì)量比為1:3的動物糞便與生理鹽水加入離心管中充分震蕩形成混懸液，按每毫升混懸液加入青霉素和鏈霉素各1000單位，反應(yīng) 4_6h后進行8000 g離心，取無菌上清液，將上清液經(jīng)尿囊腔接種9-11日齡雞胚，棄去24h 內(nèi)死亡雞胚，收取24h 96h的雞胚尿囊液，_20°C備用；(2)設(shè)計引物參照GenBank中新城疫病毒的F基因序列，設(shè)計一對引物F-F和F-R， 用于擴增F基因，序列為F-F :5，-TCTGGAGGAAGGAGACARRRR-3，；所述R為簡并引物，當R為A，擴增成功的是強毒株序列，當R為G時，擴增成功的是弱毒株序列。
F-R :5’-GATCAGGCCGCTACCAATTAA-3’ ；擴增長度為483bp ；(3)提取核酸在1.5ml無RNA酶的離心管中加入200ul尿囊液和Iml的Trizol，充分混勻后在室溫放置5分鐘；加入O. 2 ml的氯仿，加蓋好后劇烈震蕩15秒，在室溫放置2-3min，然后進行12000 g離心15 min，將水相轉(zhuǎn)移到另一無RNA酶的離心管中，加入與水相等體積的異丙醇，室溫靜置10 min, 12000g離心15min,除去上層清液，向沉淀中加入Iml 75%乙醇洗滌RNA沉淀，混勻，12000 g離心5min，除去上層清液，超凈臺內(nèi)風干RNA沉淀，加入IOul DEPC水充分溶解RNA;(4)RT-PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系；2x Buffer25 μ I混合酶3 μ IF-F、F-R 引物(10 μ Μ)3μ IRNA 模板IOul (約 IOng-1 μ g)RNase-free ddH20補至 50 μ I。
(5)擴征條件第一步50 min 50°C，I個循環(huán)；第二步94°C 3 min，I個循環(huán)；第三步 94°C1 min,52°C I min,72°C 2 min，35 個循環(huán)，第四步 72°C延伸 7min，I 個循環(huán)；(6)產(chǎn)物鑒定取5 L上述反應(yīng)產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，以Marker DL2000作為參考，TAE緩沖液為電泳緩沖液，以5V/cm電泳lh，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果； (7)序列鑒定回收目的條帶，16°C1.5 h連接至PMD19-T Easy Vector，轉(zhuǎn)化感受態(tài) DH5 α，均勻涂布于含Amp、IPTG和Χ-gal的LB固體培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)16h，挑取白色菌落小量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒作PCR擴增鑒定，將陽性菌液測序。
本發(fā)明的有益效果是本方法采用先接種雞胚增殖病毒，而后進行PCR檢測，通過將F-F引物中添加R簡并引物，使得在進行檢測的同時對弱病毒和強病毒進行檢測，檢測準確，并減少了分別對弱病毒和強病毒檢測的時間，解決了傳統(tǒng)方法中容易漏檢的問題。


圖1為本發(fā)明電泳結(jié)果示意圖；圖中1- Marker DL2000，2-強毒 NDV，3-弱毒株 NDV，4-水。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，以便本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更好的了解本發(fā)明，但并不因此限制本發(fā)明。
一種新城疫病毒核酸RT-PCR檢測的方法，包括以下步驟(O病毒增殖取需要檢測的動物糞便，將質(zhì)量比為1:3的動物糞便與生理鹽水加入離心管中充分震蕩形成混懸液，按每毫升混懸液加入青霉素和鏈霉素各1000單位，反應(yīng) 4_6h后進行8000 g離心，取無菌上清液，將上清液經(jīng)尿囊腔接種9-11日齡雞胚，棄去24h 內(nèi)死亡雞胚，收取24h 96h的雞胚尿囊液，_20°C備用；(2)設(shè)計引物參照GenBank中新城疫病毒的F基因序列，設(shè)計一對引物F-F和F-R， 用于擴增F基因，序列為F-F :5，-TCTGGAGGAAGGAGACARRRR-3，；所述R為簡并引物，當R為A，擴增成功的是強毒株序列，當R為G時，擴增成功的是弱毒株序列。
F-R :5，-GATCAGGCCGCTACCAATTAA-3，；引物F-F和F-R擴增長度為483bp(3)提取核酸在1.5ml無RNA酶的離心管中加入200ul尿囊液和Iml的Trizol，充分混勻后在室溫放置5分鐘；加入O. 2 ml的氯仿，加蓋好后劇烈震蕩15秒，在室溫放置2-3min，然后進行12000 g離心15 min，將水相轉(zhuǎn)移到另一無RNA酶的離心管中，加入與水相等體積的異丙醇，室溫靜置10 min, 12000g離心15min,除去上層清液，向沉淀中加入Iml 75%乙醇洗滌RNA沉淀，混勻，12000 g離心5min，除去上層清液，超凈臺內(nèi)風干RNA沉淀，加入IOul DEPC水充分溶解RNA;(4)RT-PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系；2x Buffer25 μ I混合酶3 μ IF-F、F-R 引物(10 μ Μ)3μ IRNA 模板IOul (IOng-1 μ g)RNase-free ddH20補至 50 μ I。
(5)擴征條件第一步50 min 50°C，I個循環(huán)；第二步94°C 3 min，I個循環(huán)；第三步 94°C1 min,52°C I min,72°C 2 min，35 個循環(huán)，第四步 72°C延伸 7min，I 個循環(huán)； (6)產(chǎn)物鑒定取5 L上述反應(yīng)產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，以Marker DL2000作為參考，TAE緩沖液為電泳緩沖液，以5V/cm電泳lh，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果；(7)序列鑒定回收目的條帶，16°C1.5 h連接至PMD19-T Easy Vector，轉(zhuǎn)化感受態(tài) DH5 α，均勻涂布于含Amp、IPTG和Χ-gal的LB固體培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)16h，挑取白色菌落小量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒作PCR擴增鑒定，將陽性菌液測序。
選取了 350份鳥類和家禽糞便進行上述方法的檢測，檢測出了 14株陽性樣品，經(jīng)序列比對證實為新城疫病毒，其中有5株經(jīng)序列比對強毒，9株為弱毒，結(jié)果與分離毒的生物學毒力測定結(jié)果一致。
權(quán)利要求
1.一種新城疫病毒核酸RT-PCR檢測的方法，包括以下步驟 (1)病毒增殖取需要檢測的動物糞便，將質(zhì)量比為1:3的動物糞便與生理鹽水加入離心管中充分震蕩形成混懸液，按每毫升混懸液加入青霉素和鏈霉素各1000單位，反應(yīng)4-6h后進行8000 g離心，取無菌上清液，將上清液經(jīng)尿囊腔接種9-11日齡雞胚，棄去24h內(nèi)死亡雞胚，收取24h 96h的雞胚尿囊液，_20°C備用； (2)設(shè)計引物參照GenBank中新城疫病毒的F基因序列，設(shè)計一對引物F-F和F-R，用于擴增F基因,序列為F-F :5，-TCTGGAGGAAGGAGACARRRR-3，；F-R :5，-GATCAGGCCGCTACCAATTAA-3，； 擴增片段長度483bp ； (3)提取核酸在1.5ml無RNA酶的離心管中加入200ul尿囊液和Iml的Trizol，充分混勻后在室溫放置5分鐘；加入0. 2 ml的氯仿，加蓋好后劇烈震蕩15秒，在室溫放置2-3min，然后進行12000 g離心15 min，將水相轉(zhuǎn)移到另一無RNA酶的離心管中，加入與水相等體積的異丙醇，室溫靜置10 min, 12000g離心15min,除去上層清液，向沉淀中加入Iml75%乙醇洗滌RNA沉淀，混勻，12000 g離心5min，除去上層清液，超凈臺內(nèi)風干RNA沉淀，力口A IOul DEPC水充分溶解RNA; (4)RT-PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系 2x Buffer25 u I 混合酶3 u I F-F、F-R 引物(IOiiM) 3 ill RNA 模板IOul RNase-free ddH20補至 50 U I ; (5)擴征條件第一步50min 50°C, I個循環(huán)；第二步94°C 3 min, I個循環(huán)；第三步940C I min,52°C I min,72°C 2 min，35 個循環(huán)，第四步 72°C延伸 7min，I 個循環(huán)； (6)產(chǎn)物鑒定取5 L上述反應(yīng)產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，以DL2000的Marker作為參考，TAE緩沖液為電泳緩沖液，以5V/cm電泳lh，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果； (7)序列鑒定回收目的條帶，16°C1.5 h連接至PMD19-T Easy Vector，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 a，均勻涂布于含Amp、IPTG和X_gal的LB固體培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)16h，挑取白色菌落小量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒作PCR擴增鑒定，將陽性菌液測序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新城疫病毒核酸RT-PCR檢測的方法，其特征在于所述F-F引物中R為簡并引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種病毒檢測方法，更具體的講是一種新城疫病毒核酸RT-PCR檢測的方法，其包括病毒增殖、設(shè)計引物、提取核酸、產(chǎn)物鑒定、序列鑒定，本發(fā)明的有益效果是本方法采用先接種雞胚增殖病毒，而后進行PCR檢測，通過將F-F引物中添加R簡并引物，使得在進行檢測的同時對弱病毒和強病毒進行檢測，檢測準確，并減少了分別對弱病毒和強病毒檢測的時間，解決了傳統(tǒng)方法中容易漏檢的問題。
文檔編號C12Q1/70GK102994652SQ201210531418
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月6日
發(fā)明者袁小遠, 王友令, 張玉霞, 徐紹建 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所