專利名稱：檢測(cè)食品中乳酸菌的方法及檢測(cè)用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及食用乳酸菌檢測(cè)的方法以及其中所使用的引物對(duì)等。
背景技術(shù)：
乳酸菌是一群形態(tài)、代謝性能和生理學(xué)特征不完全相同的革蘭氏陽性菌。由于具有許多有益的代謝特征，被廣泛用于輕工業(yè)、食品、醫(yī)藥及飼 料工業(yè)等許多行業(yè)上。目前在自然界中已發(fā)現(xiàn)的乳酸菌在細(xì)菌分類學(xué)上劃分為23個(gè)屬，常用于微生態(tài)制劑的菌種有雙歧桿菌、乳酸桿菌、乳酸球菌、腸球菌、鏈球菌、明串珠菌、片球菌和地衣芽孢桿菌等。多數(shù)乳酸菌通常被認(rèn)為是安全的，因此相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)不完善，所以對(duì)乳酸菌的檢測(cè)一致為人所忽視。目前市場(chǎng)上銷售的含乳酸菌制品，僅在標(biāo)簽中列明菌種名稱，缺乏一些具體的菌種信息，甚至部分菌種名稱是廠家自行命名的，與國際標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫的信息無法對(duì)應(yīng)，也就無法溯源，更不用提相應(yīng)產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。尤其是，近來的一些研究表明，部分乳酸菌也可能致病(參見劉小青，等.乳酸菌的安全性研究.中國微生態(tài)學(xué)雜志，21 (10) :952-955)。因此，本發(fā)明人認(rèn)為，在食品安全日益引起重視的今天，確定食品生產(chǎn)廠家所用乳酸菌的菌種、菌株及其所內(nèi)在決定的穩(wěn)定性和安全性是非常有必要的。要保證乳酸菌及其制劑的安全性和質(zhì)量，需要對(duì)其菌“株”在投產(chǎn)前進(jìn)行生物學(xué)、遺傳學(xué)特征的檢測(cè)，以便核實(shí)其安全性。由于即使菌株進(jìn)行保藏、培養(yǎng)，通常也難以分辨。而最有效的檢測(cè)方法是DNA測(cè)序，但是由于含乳酸菌制品成分復(fù)雜，往往是多種乳酸菌的混合物，直接測(cè)序的干擾嚴(yán)重；分離菌株并培養(yǎng)后再測(cè)序，耗費(fèi)的時(shí)間長(zhǎng)。更為嚴(yán)重的是，DNA測(cè)序的成本較高，廠家和食品監(jiān)督機(jī)構(gòu)日常使用的成本太高，不易施行，即使制定相應(yīng)方法也難以大面積實(shí)施，使得該方法形同虛設(shè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供新的檢測(cè)食品中乳酸菌的方法，其能夠?qū)环N或多種乳酸菌的制品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可以有效排除假陽性。另外，本發(fā)明還提供了該方法中所用的引物或引物對(duì)及其應(yīng)用等。具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)食品中乳酸菌的方法，其包括，(I)提取食品中乳酸菌基因組DNA ;(2 )對(duì)步驟(I)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中所使用的引物對(duì)是兼并弓I物對(duì)；(3)將步驟(2)的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)；如檢測(cè)到唯一 PCR擴(kuò)增條帶，則檢測(cè)結(jié)果為陽性，否則檢測(cè)結(jié)果為陰性；如檢測(cè)結(jié)果為陽性則不需要進(jìn)行步驟(4)，如檢測(cè)結(jié)果為陰性則需要進(jìn)行步驟(4)；(4)任選對(duì)步驟(2)的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，食品是酸奶。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的方法中，乳酸菌是嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱乳鏈球菌、保加利亞乳桿菌、雙歧乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳酸菌、兩歧雙歧桿菌、乳雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌中的一種或多種。在本發(fā)明中，兼并引物對(duì)指的是引物對(duì)中的正向和/或反向引物中至少有一條是兼并引物。在本發(fā)明中，兼并引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，即引物的至少有一個(gè)位置上具有兩種或兩種以上核苷酸。在核酸合成儀順序合成引物的過程中，通過當(dāng)要合成具有兩種或兩種以上核苷酸的位置時(shí)，同時(shí)加入該兩種或兩種以上核苷酸即可。這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是完全能夠合成的，并且有商業(yè)化的公司提供合成服務(wù)。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的方法中，引物對(duì)中的引物選自SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQID NO. 4,SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9 和 SEQ I DNO. 10。更優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的方法中，引物對(duì)中的正向引物選自SEQ I D NO. K·SEQ IDN0.2、SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4 ;和/或，引物對(duì)中的反向引物選自SEQ ID NO. 5,SEQID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ I D NO. 8、SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10。優(yōu)選地，步驟(2)中，所述PCR擴(kuò)增的體系采用Takara DRR006A Ex Taq Hot StartVersion試劑盒，如下TaKaRa Ex Taq HS (5U/μ I) O. 25 μ IIOXEx Taq Buffer (Mg2+Plus) 5 μ IdNTP Mixture (各 2. 5mM) 4 μ I正向和反向引物(各20μΜ)各0·5μ I細(xì)菌基因組提取液中的DNA50ng加水定容至50μ1;所述PCR擴(kuò)增條件為95°C 2min 預(yù)變性；95°C 30s,55°C 30s, 72°C 40s，45 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 5min。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的方法中，步驟(3)中，如果PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)是大小為250-300bp的唯一一條PCR擴(kuò)增條帶，則檢測(cè)結(jié)果為陽性，不進(jìn)行步驟(4);如果出現(xiàn)該條帶的同時(shí)也出現(xiàn)了其他條帶，則檢測(cè)結(jié)果為陰性，進(jìn)行步驟(4)。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的方法中，測(cè)序是illumina genome analyzer測(cè)序。Illuminagenome analyzer測(cè)序是一種基于單分子簇的邊合成邊測(cè)序的方法。具體而言,測(cè)序時(shí)將基因組DNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面(即Flow cell)，這些DNA片段經(jīng)過延伸和橋式擴(kuò)增后，在Flow cell上形成了數(shù)以億計(jì)Cluster,每個(gè)Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBS (邊合成邊測(cè)序)技術(shù)對(duì)待測(cè)的模板DNA進(jìn)行測(cè)序。IIllumina Genome Analyzer測(cè)序技術(shù)避免了像傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)那樣耗費(fèi)大量人力、物力進(jìn)行片段克隆、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提等工作，測(cè)序通量有著若干個(gè)數(shù)量級(jí)的提高。在第二方面，本發(fā)明提供了引物，其選自SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ I D NO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9 和 SEQI D NO. 10。另外，本發(fā)明還提供了引物對(duì)，引物對(duì)由正向引物和反向引物組成，其中引物對(duì)中的正向引物選自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4，而且其中引物對(duì)中的反向引物選自 SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9和 SEQ ID NO. 10。在第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第二方面的弓I物或引物對(duì)在檢測(cè)食品中乳酸菌的方法中的應(yīng)用。優(yōu)選檢測(cè)食品中乳酸菌的方法是本發(fā)明的第一方面的方法。本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明結(jié)合含乳酸菌制品中乳酸菌優(yōu)勢(shì)的特點(diǎn)，基于PCR方法建立了一套簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)識(shí)別乳酸菌的方法，直接可對(duì)各廠家的含一種或多種乳酸菌的制品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可以有效排除假陽性，從而便于推廣實(shí)施，而對(duì)于檢測(cè)陰性的制品，再配合測(cè)序，可以確保檢測(cè)結(jié)果的正確性。應(yīng)用于食品工業(yè)時(shí)，能檢測(cè)含多種乳酸菌的制品，適應(yīng)性好；檢測(cè)速度快，絕大多數(shù)可以在2 3小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)；操作簡(jiǎn)便，成本低，絕大多數(shù)無需動(dòng)用昂貴的測(cè)序工序；檢測(cè)準(zhǔn)確率高，尤其是假陽性率很低，因而便于推廣應(yīng)用。以下將通過具體的實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是， 這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見了。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例2中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)圖譜。
具體實(shí)施例方式以下通過具體的實(shí)施例進(jìn)行示例，其中所用試劑均可通過市場(chǎng)渠道購買，如有未盡之處，可以參考相應(yīng)的PCR和基因測(cè)序的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。實(shí)施例1食品中包括乳酸菌的細(xì)菌基因組的提取從市場(chǎng)可以購買的進(jìn)出口酸奶樣本24個(gè)，其中進(jìn)口產(chǎn)品11種，國產(chǎn)或合資品牌13種，采用Tiangen細(xì)菌DNA提取試劑盒(商品編號(hào)DP302-02)分別提取24種酸奶產(chǎn)品中細(xì)菌的全基因組DNA。即取不同樣本酸奶液1ml，以IOOOOrpm離心I分鐘,棄去上清液體,然后將沉淀參照試劑盒的廠商說明書進(jìn)行提取，得細(xì)菌基因組提取液。通過測(cè)定提取液0D260/280比值，確定DNA濃度。實(shí)施例2乳酸菌菌株的PCR檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明人前期對(duì)各廠商的菌株安全性和測(cè)序研究，設(shè)計(jì)了如下表I所示的兼并引物對(duì)，委托上海英駿生物科技有限公司合成，分別針對(duì)實(shí)施例1記載的從各廠商酸奶中提取的細(xì)菌基因組提取液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，另取大腸桿菌、阪崎腸桿菌(又稱阪崎氏腸桿菌)基因組提取液作為對(duì)照。表I
權(quán)利要求
1.檢測(cè)食品中乳酸菌的方法，其特征在于，包括如下步驟(I)提取食品中細(xì)菌基因組DNA ；(2 )對(duì)步驟(I)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中所使用的引物對(duì)是兼并引物對(duì)；(3)將步驟(2)的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)；如檢測(cè)到唯一PCR擴(kuò)增條帶，則檢測(cè)結(jié)果為陽性，否則檢測(cè)結(jié)果為陰性；如檢測(cè)結(jié)果為陽性則不需要進(jìn)行步驟(4)，如檢測(cè)結(jié)果為陰性則需要進(jìn)行步驟(4);(4)任選對(duì)步驟(2)的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述食品是酸奶。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌是嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱乳鏈球菌、保加利亞乳桿菌、雙歧乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳酸菌、兩歧雙歧桿菌、乳雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌中的一種或多種。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述引物對(duì)中的引物選自SEQIDNO. USEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ IDN0. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述引物對(duì)中的正向引物選自SEQID NO.1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4。
6.如權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述引物對(duì)中的反向引物選自 SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR擴(kuò)增的體系采用TakaraDRR006A Ex Taq Hot Start Version 試劑盒，如下TaKaRa Ex Taq HS (5U/μ I) O. 25 μ IIOXEx Taq Buffer (Mg2+Plus) 5 μ IdNTP Mixture (各 2· 5mM) 4 μ I正向和反向引物(各20μΜ)各O. 5μ I細(xì)菌基因組提取液中的DNA50ng加水定容至50μ I ；所述 PCR擴(kuò)增條件為95°C 2min 預(yù)變性；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s，45 個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。
8.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(3)中，如果PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)是大小為250-300bp的唯一一條PCR擴(kuò)增條帶，則檢測(cè)結(jié)果為陽性，不進(jìn)行步驟(4);如果出現(xiàn)該條帶的同時(shí)也出現(xiàn)了其他條帶，則檢測(cè)結(jié)果為陰性，進(jìn)行步驟(4)。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，所述測(cè)序是illuminagenomeanalyzer 測(cè)序。
10.用于檢測(cè)食品中乳酸菌的引物或引物對(duì)，其特征在于，所述引物選自SEQID NO.1、SEQID NO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7、SEQIDNO. 8、SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10，其中引物對(duì)中的正向引物選自SEQ ID NO.1、SEQ IDNO. 2、SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4，其中引物對(duì)中的反向引物選自SEQ ID NO. 5、SEQ IDNO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10。
11.如權(quán)利要求10所述的引物或引物對(duì)在檢測(cè)食品中乳酸菌的方法中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測(cè)食品中乳酸菌的方法，其包括，(1)提取食品中細(xì)菌基因組DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中所使用的引物對(duì)是兼并引物對(duì)；(3)對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，如檢測(cè)到唯一PCR擴(kuò)增條帶，則檢測(cè)結(jié)果為陽性，否則檢測(cè)結(jié)果為陰性；如檢測(cè)結(jié)果為陽性則不需要進(jìn)行步驟(4)，如檢測(cè)結(jié)果為陰性則需要進(jìn)行步驟(4)；(4)任選對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。本發(fā)明還提供了其中所用的引物等。本發(fā)明方法，直接可對(duì)各廠家的含一種或多種乳酸菌的制品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可以有效排除假陽性，從而便于推廣實(shí)施，而對(duì)于檢測(cè)陰性的制品，再配合測(cè)序，可以確保檢測(cè)結(jié)果的正確性。
文檔編號(hào)C12Q1/14GK103014160SQ201210532379
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者楊捷琳, 倪勝, 王敏, 呂蓉, 楊柳, 潘良文 申請(qǐng)人:上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 上海欣景生物科技有限公司