專利名稱：一種利用雄蕊瓣化標記不結(jié)球白菜雄性不育基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種利用雄蕊瓣化標記不結(jié)球白菜雄性不育基因的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，用于不結(jié)球白菜雄性不育系的分子標記輔助選擇育種。
背景技術(shù)：
近年來，不結(jié)球白菜(Brassicacampestris L. ssp. chinensis Makino)的需求量不斷增長，但其具有不耐儲運的特性，且品種較為單一。這就使雜種優(yōu)勢利用的重要性日益突顯，通過雜交獲得具有優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)、抗逆性強的不結(jié)球白菜品種。目前，廣泛用于配制雜交種的途徑主要有自交不親和系、化學殺雄和雄性不育系等，但是前兩種途徑分別在工作量和效果方面具有很大的缺陷。因此，雄性不育系的利用成為當前雜種優(yōu)勢利用的首選途徑。通常情況下，無論是細胞質(zhì)雄性不育(CMS)還是細胞核雄性不育(GMS)，大都表 現(xiàn)雄蕊退化引起的不能產(chǎn)生花粉或不產(chǎn)生有活性花粉的雄性不育類型，其雄性器官雖然退化、畸形，但仍然殘存(俞咪娜，2008)。然而，雄蕊瓣化突變體表現(xiàn)為花瓣錯位表達于雄蕊位置以致雄蕊消失，雌雄兩性花變成無雄蕊的單性雌花，由此產(chǎn)生的雄性不育穩(wěn)定、徹底，是一種新的雄性不育類型，為雄性不育機理的研究提供了很好的材料，同時也豐富了現(xiàn)有不結(jié)球白菜雄性不育的類型(張彥鋒，2010)。因此，預(yù)測以這一新品系為材料獲得的差異基因與雄性不育性狀的相關(guān)度會更高。雄蕊瓣化同源異型突變多見于模式植物擬南芥，農(nóng)作物中也有報道，陸光遠等(2005)在甘藍型油菜、芥菜型油菜、蘿卜等材料中發(fā)現(xiàn)雄蕊瓣化突變體。對于這類突變材料的研究大都集中在花發(fā)育的機理方面，而利用它調(diào)取雄性不育相關(guān)基因的研究卻不多見。本試驗以白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052為材料，在試驗初期，我們發(fā)現(xiàn)W053常出現(xiàn)雄蕊缺失，花瓣增多的現(xiàn)象，且該特性具有相對穩(wěn)定的遺傳性。傳統(tǒng)的育種方法選育不育系周期長、效率低，這也是目前限制白菜雄性不育系選育和應(yīng)用的重要應(yīng)用。分子標記輔助選擇不受環(huán)境條件的限制，可實現(xiàn)苗期選擇，減少工作量，加速育種進程，提高白菜不育系的育種效率。隨著分子生物學的發(fā)展，國內(nèi)外都很重視開展基因組中育性基因的分子標記篩選以及分子標記輔助選擇。在蔬菜作物上，吳國平等(2012)利用SRAP技術(shù)，在甜椒胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系中篩選獲得了 I個與育性恢復(fù)基因緊密連鎖的分子標記。黃鎮(zhèn)(2009)利用AFLP技術(shù)，在甘藍型油菜中獲得了 5個育性相關(guān)基因，并成功轉(zhuǎn)化為SCAR標記，同時建立了甘藍型油菜隱形細胞核雄性不育系的分子標記輔助選擇方法。張慧(2010)利用SRAP和SSR技術(shù)，在大白菜中篩選獲得了 5個雄性不育相關(guān)基因，并成功轉(zhuǎn)化為更為穩(wěn)定的SCAR標記。李婧婧等(2012)利用AFLP技術(shù)，在甘藍型油菜隱性上位細胞核雄性不育兩型系中獲得了 7個與esp基因緊密連鎖的分子標記。cDNA-AFLP技術(shù)的應(yīng)用目前已經(jīng)非常廣泛且成熟，主要是針對基因差異表達分析方面的。本試驗以不結(jié)球白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052為材料，利用該技術(shù)，優(yōu)化cDNA-AFLP各反應(yīng)體系，獲得兩個材料間具有多態(tài)性的片段，對這些基因進行生物信息學的分析，設(shè)計引物將差異基因轉(zhuǎn)化為更為穩(wěn)定的SCAR標記，最終獲得雄性不育相關(guān)基因。目前還沒有以不結(jié)球白菜雄蕊瓣化這一新品系為材料，通過這項技術(shù)進行基因差異表達分析，進而獲得雄性不育相關(guān)基因的成功報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的篩選出一個或幾個與不結(jié)球白菜雄性不育基因緊密連鎖的分子標記，建立不結(jié)球白菜雄性不育系分子標記輔助選擇體系，從而提高不結(jié)球白菜雄性不育系的選擇效率，為雜種優(yōu)勢的利用提供理想材料。
技術(shù)方案I、一種利用雄蕊瓣化標記不結(jié)球白菜雄性不育基因的方法，其特征在于用標記引物AFLP17，左端引物序列GACTGCGTACCAATTCAGC,右端引物序列:GATGAGTCCTGAGTAATGC :或者用標記引物 SCAR33，左端引物序列CTGAGTAATCGGGCATGCAA，右端引物序列GTAATCGCAGCCCAGACAAC。擴增由雄蕊瓣化品系及其保持系RNA反轉(zhuǎn)錄合成的DNA，如果能夠擴增出300bp的片段，則標志著不結(jié)球白菜雄性不育基因的存在；2、根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用雄蕊瓣化標記不結(jié)球白菜雄性不育基因的的方法，其中采用的AFLP17和SCAR33兩種分子標記引物是通過以下方法篩選獲得的I)選用不結(jié)球白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052 ；2)用于篩選標記引物的DNA模板的制備提取植物組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈DNA，按照相應(yīng)試劑盒內(nèi)附說明書進行操作；利用識別序列分別6bp和4bp的限制性內(nèi)切酶EcoRI和MseI將雙鏈DNA酶切并加上適宜的接頭，酶切體系 20 μ 1，其中 10XNEB 2 μ I, DNA 2 μ 1,100XBSAO. 2 μ I, ECORI-HF
O.5μ 1，MSEI0. 5μ 1，加ddH20至20μ 1，37°C反應(yīng)3h，再將該20 μ I產(chǎn)物加入到預(yù)先混好的 5μ I 連接體系中，包括 Τ4 Iigase O. 5μ 1,10ΧΤ4 ligase buffer O. 5 μ I, MseIadapter 0.5 μ I, EcoRI-HF adapter 0. 5 μ I,IOmMATP 0.5 μ I, dd H2O 2· 5 μ 1,16 °C 過夜；使用相應(yīng)的引物進行預(yù)擴增獲得大量的模板，20 μ I體系，其中DNA連接產(chǎn)物5 μ 1，EcoR primer(GACTGCGTACCAATTC)3 μ 1，Mse primer(GATGAGTCCTGAGTAA)3 μ 1,2. 5mM dNTP2μ 1,5U rTaq 0. 25 μ 1,10 X buffer (Mg2+) 2 μ I, ddH20 4. 75 μ 1，產(chǎn)物稀釋后用于選擇性擴增；3)標記引物的篩選使用64對選擇性擴增引物進行PCR反應(yīng)，體系為20 μ 1，其中模板2 μ 1，左端引物 I μ I，右端引物 I μ 1，10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ I, dNTP (2. 5mM) I. 6 μ I, Mg2+L 2 μ 1，5U rTaq O. 2 μ 1，加ddH20至20 μ I ;PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性2min，第一輪擴增參數(shù)94°C 30s, 65°C 30s, 72°C 45s，12輪循環(huán)，每輪循環(huán)溫度遞減O. 7°C。第二輪擴增參數(shù)940C 30s, 56°C 30s, 72°C 45s，重復(fù)23個循環(huán)，最后72°C延伸5min ;PCR產(chǎn)物于6%的變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離分析，電泳結(jié)束后通過銀染法顯示條帶，篩選出在雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052間的多態(tài)性片段，從而獲得白菜雄性不育基因的I個300bp的AFLP標記片段，其標記引物為AFLP17 ；4)差異片段的回收、克隆及測序
將差異條帶用潔凈的刀片刮下來，置于滅過菌的I. 5ml離心管內(nèi)，加入IOOu I的dd H20，在沸水中煮30分鐘，冷卻至室溫后取2 Ul用做模板，使用預(yù)擴增引物進行PCR擴增，然后瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下含有目的條帶的瓊脂糖凝膠塊，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒內(nèi)附方案進行DNA的回收與純化；將回收得到的DNA與PMD18-T載體進行連接，IOii I 體系，包括 pMD 18-T Vector lul, DNA4 u I, Solution I 5yl，16°C 過夜。將感受態(tài)從_70°C冰箱中取出，置于冰上融化，加入10 u I連接液，于冰上放置30min后，42°C水浴80s，迅速取出冰浴2min，再加入500 的LB液體培養(yǎng)基，將離心管放置于搖床上，37°C，250rpm復(fù)蘇45_60min,取出，在室溫下4000rpm離心3min,除去上清液,剩余約100 ii I液體，用槍頭吸打懸浮沉淀物，攪拌均勻后涂布在加入氨芐的培養(yǎng)基平板上，置于37度培養(yǎng)10到14小時。待培養(yǎng)基平板上長出單一的菌落時用事先滅過菌的牙簽挑菌，置于加入了氨芐的LB液體培養(yǎng)基中并封口，于37°C，250rpm震蕩培養(yǎng)12到16小時；以菌液為模板進行PCR檢測，有單一目的條帶的菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司測序；
5)將AFLP標記轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的SCAR標記根據(jù)AFLP擴增特異序列的測序結(jié)果，利用Primer Premier 5.0設(shè)計SCAR弓丨物，進行 PCR 擴增，反應(yīng)體系 20ii 1，其中 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 u 1，Mg2+L 2 u 1，dNTP(2. 5mM) I. 6u 1，引物各 I U 1，雙鏈 DNA 2u 1,5U rTaq 0. 2 u I，加 ddH20 至 20 y I ;擴增程序為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，58°C退火45s，72°C延伸80s，40個循環(huán)；72°C延伸5min，PCR產(chǎn)物于I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在UVP成像系統(tǒng)上自動成像，篩選出不結(jié)球白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052間的多態(tài)性片段，從而獲得不結(jié)球白菜雄性不育基因的I個300bp的SCAR標記片段，其標記引物為SCAR33。本發(fā)明獲得了不結(jié)球白菜雄性不育基因的一個AFLP標記，并將其轉(zhuǎn)化為更為穩(wěn)定的SCAR標記。有益效果本發(fā)明選用的是不結(jié)球白菜雄蕊瓣化品系及其保持系為材料開展不結(jié)球白菜雄性不育分子標記的篩選及分子標記輔助選擇體系的建立。與目前技術(shù)相比，其優(yōu)點是(I)標記穩(wěn)定。本研究以不結(jié)球白菜雄蕊瓣化品系及其保持系這一對近等基因系為材料，鑒定出AFLP標記一個，并轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的SCAR標記。(2)分子標記輔助選擇體系操作方便，節(jié)約成本。不結(jié)球白菜雄性不育系的常規(guī)選育方法周期長，成本高，費時又費力。通過本發(fā)明獲得了適用于不結(jié)球白菜的cDNA-AFLP反應(yīng)體系，優(yōu)化了變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的流程，篩選出了不結(jié)球白菜雄性不育基因的I個AFLP標記及I個SCAR分子標記用于輔助選擇，建立了從凝膠中高效快速回收目的條帶的方法，建立的分子標記輔助選擇方法可以實現(xiàn)苗期選擇，減少工作量，大大提高不結(jié)球白菜雄性不育系的選擇效率，從而加速育種進程。
四

圖I NAU-AFLP■標記的篩選不同引物組合在兩個品系中的cDNA-AFLP擴增圖譜，其中左邊為IOObp DNALadderMarker0雄蕊瓣化品系標記為T,對應(yīng)每對引物右邊的泳道,保持系標記為B,對應(yīng)每對引物左邊的泳道。引物編號為1-22，箭頭所指為引物17在雄蕊瓣化品系中擴增得到的差異條帶，命名為NAU-AFLP3citl。圖2 NAU-SCAR3tltl 標記的篩選左邊為DL1000的Marker,前邊四個泳道為保持系的4個單株,標記為B,后邊四個泳道為雄蕊瓣化品系的4個單株，標記為T。條帶是由引物SCAR33在雄蕊瓣化品系中擴增得到的，命名為NAU-SCAR3citl。
五具體實施例方式本發(fā)明的實施程序是一、材料與方法不結(jié)球白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052這一近等基因系來自南京農(nóng)業(yè)大 學園藝學院蔬菜學科白菜課題組。二、分子標記篩選分析主要利用AFLP標記和SCAR標記。使用64對選擇性擴增引物進行PCR反應(yīng)，體系為20 μ 1，其中模板2 μ 1，左端引物 I μ I，右端引物 I μ 1，10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ I, dNTP (2. 5mM) I. 6 μ I, Mg2+L 2 μ 1，5U rTaq O. 2 μ 1，加ddH20至20 μ I ;PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性2min，第一輪擴增參數(shù)94°C 30s, 65°C 30s, 72°C 45s，12輪循環(huán)，每輪循環(huán)溫度遞減O. 7°C。第二輪擴增參數(shù)940C 30s, 560C 30s, 72°C 45s，重復(fù)23個循環(huán)，最后72°C延伸5min ;PCR產(chǎn)物于6%的變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離分析，電泳結(jié)束后通過銀染法顯示條帶，篩選出在雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052間的多態(tài)性片段，從而獲得不結(jié)球白菜雄性不育基因的I個300bp的AFLP標記片段，其標記引物為AFLP17 ；將差異條帶用潔凈的刀片刮下來，置于滅過菌的I. 5ml離心管內(nèi)，加入100 μ I的dd H20，在沸水中煮30分鐘，冷卻至室溫后取2μ I用做模板，使用預(yù)擴增引物進行PCR擴增，然后瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下含有目的條帶的瓊脂糖凝膠塊，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒內(nèi)附方案進行DNA的回收與純化；將回收得到的DNA與PMD18-T載體進行連接，10μ1 體系，包括 pMD 18-T Vector I μ 1，DNA 4 μ I, Solution I 5yl，16°C過夜。將感受態(tài)從_70°C冰箱中取出，置于冰上融化，加入10 μ I連接液，于冰上放置30min后，42°C水浴80s，迅速取出冰浴2min，再加入500 μ I的LB液體培養(yǎng)基，將離心管放置于搖床上，37°C，250rpm復(fù)蘇45_60min,取出，在室溫下4000rpm離心3min,除去上清液,剩余約100 μ I液體，用槍頭吸打懸浮沉淀物，攪拌均勻后涂布在加入氨芐的培養(yǎng)基平板上，置于37度培養(yǎng)10到14小時。待培養(yǎng)基平板上長出單一的菌落時用事先滅過菌的牙簽挑菌，置于加入了氨芐的LB液體培養(yǎng)基中并封口，于37°C，250rpm震蕩培養(yǎng)12到16小時；以菌液為模板進行PCR檢測，有單一目的條帶的菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司測序；根據(jù)AFLP擴增特異序列的測序結(jié)果，利用Primer Premier 5. O設(shè)計SCAR引物，進行 PCR 擴增，反應(yīng)體系 20μ 1，其中 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ 1，Mg2+ I. 2μ I,dNTP (2. 5mM) I. 6 μ 1，引物各 I μ 1，雙鏈DNA 2μ 1，5U rTaq 0. 2 μ 1，加(1(1!120至2(^ I ;擴增程序為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，58°C退火45s，72°C延伸80s，40個循環(huán)；72°C延伸5min，PCR產(chǎn)物于I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在UVP成像系統(tǒng)上自動成像，篩選出不結(jié)球白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052間的多態(tài)性片段，從而獲得不結(jié)球白菜雄性不育基因的I個300bp的SCAR標記片段，其標記引物為SCAR33。
三、結(jié)果與分析分子標記篩選結(jié)果表明，使用64對引物對兩個品系進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)一個不結(jié)球白菜雄蕊瓣化基因的AFLP標記，即用引物AFLP17擴增出的300bp的片段，命名為NAU-AFLP3tltl(圖I)。根據(jù)該片段的序列設(shè)計引物分別對雄蕊瓣化品系的4個單株與保持系的4個單株進行擴增檢測， 結(jié)果顯示，該引物組合在不結(jié)球白菜雄蕊瓣化品系的4個單株中均能擴增出一條穩(wěn)定的特異條帶，大約為300bp，與預(yù)期片段大小一致，而保持系單株中均沒有擴增出相應(yīng)的條帶(圖2)，表明已成功將該AFLP標記轉(zhuǎn)化為SCAR標記,命名為NAU-SCAR3tltl。由于SCAR標記在不結(jié)球白菜雄蕊瓣化品系中的特異性，我們推測獲得的SCAR標記可能與雄性不育性狀連鎖。獲得了適用于不結(jié)球白菜的cDNA-AFLP反應(yīng)體系，優(yōu)化了變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的流程，篩選出了不結(jié)球白菜雄性不育基因的I個AFLP標記及I個SCAR分子標記用于輔助選擇，建立了從凝膠中高效快速回收目的條帶的方法，建立的分子標記輔助選擇方法可以實現(xiàn)苗期選擇，減少工作量，大大提高不結(jié)球白菜雄性不育系的選擇效率，從而加速育種進程。
權(quán)利要求
1.一種利用雄蕊瓣化標記不結(jié)球白菜雄性不育基因的方法，其特征在于用標記引物 AFLP17，左端引物序列GACTGCGTACCAATTCAGC，右端引物序列GATGAGTCCTGAGTAATGC ；或者用標記引物SCAR33，左端引物序列CTGAGTAATCGGGCATGCAA，右端引物序列GTAATCGCAGCCCAGACAAC。擴增由雄蕊瓣化品系及其保持系RNA反轉(zhuǎn)錄合成的DNA，如果能夠擴增出300bp的片段，則標志著不結(jié)球白菜雄性不育基因的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用雄蕊瓣化標記不結(jié)球白菜雄性不育基因的方法，其中采用的AFLP17和SCAR33兩種分子標記引物是通過以下方法篩選獲得的 1)選用不結(jié)球白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052； 2)用于篩選標記引物的DNA模板的制備 提取植物組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈DNA，利用識別序列分別6bp和4bp的限制性內(nèi)切酶EcoRI和MseI將雙鏈DNA酶切并加上適宜的接頭，使用相應(yīng)的引物進行預(yù)擴增獲得大量的模板，產(chǎn)物稀釋后用于選擇性擴增； 3)標記引物的篩選 使用64對選擇性擴增引物進行PCR反應(yīng)，體系為20μ 1，其中模板2μ 1，左端引物I μ 1，右端引物 I μ 1，IOXPCR buffer (Mg2+free) 2 μ 1，dNTP (2. 5mM) I. 6μ I, Mg2+L 2 μ 1，5U rTaq O. 2 μ 1，加ddH20至20 μ I ;PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性2min，第一輪擴增參數(shù)94°C 30s, 65°C 30s, 72°C 45s，12輪循環(huán)，每輪循環(huán)溫度遞減O. 7°C。第二輪擴增參數(shù)940C 30s, 560C 30s, 72°C 45s，重復(fù)23個循環(huán)，最后72°C延伸5min ;PCR產(chǎn)物于6%的變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離分析，電泳結(jié)束后通過銀染法顯示條帶，篩選出在雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052間的多態(tài)性片段，從而獲得不結(jié)球白菜雄性不育基因的I個300bp的AFLP標記片段，其標記引物為AFLP17 ； 4)差異片段的回收、克隆及測序 刮下差異條帶置于I. 5ml離心管，加入100 μ I dd H20，在沸水中煮30分鐘，冷卻后取2μ1做模板，使用預(yù)擴增引物進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行回收與純化；回收得到的DNA與PMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌；菌液PCR檢測，選取有單一目的條帶的送南京金斯瑞生物科技有限公司測序； 5)將AFLP標記轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的SCAR標記 根據(jù)AFLP擴增特異序列的測序結(jié)果，利用Primer Premier 5. O設(shè)計SCAR引物，進行 PCR 擴增，反應(yīng)體系 20 μ 1，其中 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ 1，Mg2+L 2 μ 1，dNTP (2. 5mM) I. 6 μ 1，引物各 I μ 1，雙鏈DNA 2μ 1，5U rTaq 0. 2 μ 1，加(1(1!120至2(^ I ;擴增程序為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，58°C退火45s，72°C延伸80s，40個循環(huán)；72°C延伸5min，PCR產(chǎn)物于I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在UVP成像系統(tǒng)上自動成像，篩選出不結(jié)球白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052間的多態(tài)性片段，從而獲得不結(jié)球白菜雄性不育基因的I個300bp的SCAR標記片段，其標記引物為SCAR33。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用雄蕊瓣化標記不結(jié)球白菜雄性不育基因的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，用于不結(jié)球白菜雄性不育系的分子標記輔助選擇育種。用標記引物AFLP17，或者用標記引物SCAR33，擴增由雄蕊瓣化品系及其保持系RNA反轉(zhuǎn)錄合成的DNA，如果能夠擴增出300bp的片段，就標志著不結(jié)球白菜雄性不育基因的存在。本發(fā)明對不結(jié)球白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052 RNA反轉(zhuǎn)錄合成的DNA進行cDNA-AFLP及SCAR分子標記的篩選，可有效開展不結(jié)球白菜雄性不育系的分子標記輔助選育，大大提高選擇效率，從而加快育種進程。
文檔編號C12Q1/68GK102978287SQ20121053359
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者胡春梅, 李樹燕 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學