專利名稱：一種polyoxinK高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多氧霉素有效組分polyoxinK高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法,屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了更加廣闊的前景；同時(shí)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展，對(duì)相應(yīng)的抗生素的需求量增加。目前需要高產(chǎn)高效藥物來(lái)應(yīng)對(duì)日益增加的市場(chǎng)需求。作為幾丁質(zhì)合成酶的特異性抑制劑，多氧霉素不僅具有廣譜的抗真菌活性，并且對(duì)動(dòng)植物毒性較低。多氧霉素屬于多組分抗生素。附圖
5所示是多氧霉素多種組分的結(jié)構(gòu)。在所有的組分中,polyoxinA與polyoxinH為主要組分,但生物活性最高的組分卻是polyoxinB (煙草赤星病,蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病),polyoxinD (水稻紋枯病),polyoxinK (稻痕病)以及polyoxinL (煙草赤星病,蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病),但是四者卻是少量組分,所以這是一對(duì)矛盾。在傳統(tǒng)的育種實(shí)踐中，通過(guò)誘變提高多氧霉素整體效價(jià)的同時(shí)，生物活性較弱的組分效價(jià)也相應(yīng)的提高，但是隨著多氧霉素生物合成基因簇的成功克隆以及生物合成深入闡明為實(shí)現(xiàn)多氧霉素組分的優(yōu)化與途徑改造提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本發(fā)明通過(guò)基因工程的手段對(duì)多氧霉素工業(yè)菌株特定的功能基因進(jìn)行敲出，從而來(lái)特定的積累具有較高生物活性的組分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的問(wèn)題是提供一種多氧霉素有效組分polyoxinK的高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法。本發(fā)明利用基因工程的策略對(duì)多氧霉素工業(yè)菌株的特定基因進(jìn)行敲出而定向的積累特定的有效組分。polyoxinK,其結(jié)構(gòu)式如下所示:
權(quán)利要求
1.一種polyoxinK高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法,其特征在于,包括以下步驟: 1)工業(yè)菌株的polB突變株CXRl的構(gòu)建及篩選 將polB的中斷載體pJTU4720，通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入ET12567/Puz8002的感受態(tài)中；挑取單菌落接入指形瓶中8-10h后按照1:10的比例轉(zhuǎn)接到LB內(nèi)37°C搖3小時(shí)；進(jìn)行通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)到金產(chǎn)色鏈霉菌工業(yè)菌株中，接合子經(jīng)過(guò)抗性驗(yàn)證及PCR復(fù)證正確后，經(jīng)放松培養(yǎng)，梯度稀釋，在阿泊拉霉素和硫鏈絲菌素平板上驗(yàn)證，證明挑取的候選突變株為預(yù)期的polB中斷突變株； 2)突變株的發(fā)酵 調(diào)節(jié)發(fā)酵液PH值至3.0，將突變株直接進(jìn)行發(fā)酵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述 的構(gòu)建方法，其特征在于，用草酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液PH值至3.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種polyoxinK高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法。通過(guò)構(gòu)建polB中斷載體，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)到工業(yè)菌株中，從而構(gòu)建工業(yè)菌株的polB突變株CXR1。通過(guò)生物學(xué)測(cè)定發(fā)現(xiàn)突變株的發(fā)酵液與野生型相比，生物活性明顯提高。同時(shí)又進(jìn)行了進(jìn)一步的液相和質(zhì)譜的分析發(fā)現(xiàn)CXR1突變株所產(chǎn)的主要化合物為PolyoxinK組分。該發(fā)明對(duì)于在工業(yè)菌株之中實(shí)現(xiàn)組分改造提高多氧霉素的相對(duì)生物效價(jià)具有重要意義。
文檔編號(hào)C12R1/465GK103114103SQ20121053370
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者陳文青, 鄧子新, 秦娜娜, 周佳海 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)