專利名稱：糖尿病病理演變前期SORL-1基因的mRNA水平原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物檢測領域，更具體地說，是涉及與糖尿病病理演變mRNA表達改變(病理演變過程)的相關檢測技術。
背景技術：
2011年統(tǒng)計的最新數(shù)據(jù)顯示全國已經(jīng)確診的糖尿病有9240萬，糖尿病前期的人群有I. 48億。糖尿病并發(fā)癥是一種常見的慢性并發(fā)癥，是由糖尿病病變轉變而來，后果相當嚴重，如足病(足部壞疽、截肢)、腎病(腎功能衰竭、尿毒癥)、眼病(模糊不清、失明)、腦病(腦血管病變)、心臟病、皮膚病、性病等是糖尿病最常見的并發(fā)癥，是導致糖尿病患者死亡的主要因素。糖尿病的病理生理變化是由于胰島素分泌不足和組織糖利用障礙，導致血糖過高代謝障礙。糖尿病有原發(fā)性與繼發(fā)性兩種。原發(fā)性病因尚未清楚；，可能與遺傳等因素有關，繼發(fā)性見于慢性胰腺炎、癌癥、血色病、胰大部分手術切除、腦垂體前葉機能亢進、促腎上腺皮質機能亢進、腎上腺嗜鉻細胞瘤、胰島α細胞瘤、妊娠糖尿病等。近來科學家們都把糖尿病的發(fā)病機制的放在基因病理生理學水平進行深入研究，發(fā)現(xiàn)了一些與糖尿病發(fā)病有關一些基因，如S0RL-1基因是近來發(fā)現(xiàn)與患糖尿病有關，發(fā)現(xiàn)S0RL-1蛋白在糖尿病患者體內的水平明顯增高，研究人員認為這一指標可以通過簡單的血液測試，指示正常體重的中年人患糖尿病的風險。這將給他們更強的動力來盡早改善生活方式，以預防糖尿病。臨床上當患者被確診為二型糖尿病時，往往這一疾病早已在患者體內發(fā)展了多年，而且已經(jīng)對血管和眼部造成了傷害，及早篩查出糖尿病的早期風險是很有價值的，這樣人們就可以盡早采取預防性療法。本發(fā)明人在長期研究中發(fā)現(xiàn)，導致重大疾病死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期診治。因此，開發(fā)出用于糖尿病發(fā)病前期的相關基因水平篩查試劑盒有非常大的臨床價值。隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，疾病基因組學等研究的深入展開，為了尋求更早期的診斷糖尿病、治療糖尿病、以及預防糖尿病，已取得長足進步。至今，我們已有可能在基因的一級轉錄功能產(chǎn)物mRNA水平上做更精確的早期篩查和診斷，在糖尿病前期做預測和篩查，這樣就能將糖尿病的發(fā)病率降下來，可以大大降低社會成本，進一步提高國民的健康體質。發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)用雙標記技術，同步檢測蛋白質與檢測mRNA，有時候mRNA有表達，但蛋白質有時候沒有轉錄出來，它們有時候存在表達時空不對應現(xiàn)象，檢測mRNA會更準確。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)S0RL-1基因在糖尿病患者、高危人群、正常對照人有明顯的表達量變化，將S0RL-1作為篩查糖尿病病變前期有非常重要的臨床意義。S0RL-1在糖尿病患者病變中高表達。他作于糖尿病預警有非常重要的臨床意義。發(fā)明人在長期的研究中，得出了一種新理念，重大疾病的臨床診治模式一定要改變，不能只停留現(xiàn)在治已病(發(fā)病后診治)，要做到預防性診治，做到治已病，只有這樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率，降低社會成本和醫(yī)療成本。因此，發(fā)明人在開發(fā)和生產(chǎn)重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術上都做了創(chuàng)新。特別是篩選臨床標本(正常人群、高危人群、疾病患者)，突破了正常組織與病理組織比較的一貫性研發(fā)思路，來尋找和開發(fā)病變前期的mRNA水平，與疾病早期基因病理生理學演變密切相關，而且臨床意義非常重要mRNA靶標，將臨床上疾病形成后診治模式變成重大疾病的預防性診治，爭取了疾病診治的時間和空間，達到預防疾病。根據(jù)現(xiàn)有的文獻資料采用原位雜交技術和組化免疫方法檢測S0RL-1基因mRNA水平表達量的檢測技術及試劑盒未見報道。本發(fā)明人在針對創(chuàng)新性發(fā)明的要求，設計了(糖尿病患者、高危人群、正常對照)不同數(shù)據(jù)例組，用原位雜交技術進行檢測，結果表明以上糖尿病病人高表達，高危人群有不同程度表達10-20%，正常對照都是不表達。表明S0RL-1基因是糖尿病病變前期篩查的重要標志物。原位雜交技術(in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術結合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含有特異序列、經(jīng)過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。 原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對何靶分子)，探針的種類按核酸性質不同又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標記，以利于以后的檢測。常用的標記物包括放射性核素和非放射性標記物兩大類。常用的同位素標記物有3H、35S、125I和32P。同位素標記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點，但是由于放射性同位素對人和環(huán)境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測這些標記物的方法都是極其靈敏的。根據(jù)所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA雜交。但不論哪一種形式的雜交，都必須經(jīng)過五大過程，即組織細胞的固定，預雜交、雜交、沖洗和顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針(RNA)和檢測的靶RNA是采用堿基互補(雜交互補)的原理，同時經(jīng)過長時間研究和觀察，啟動和中止處得殘基對檢測的結果沒有影響。鑒于目前臨床上人類重大疾病診斷大部分是晚期，治療也是晚期，導致死亡率不降的診治模式。本發(fā)明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預防性治未病，達到重大疾病預防性診治目的，在理念和技術做出了創(chuàng)新性的突破，提供疾病變化mRNA水平篩查技術，使臨床上有了一項新的疾病變化前期mRNA水平篩查的技術，為臨床重大疾病的診治爭取時間和空間，實現(xiàn)重大的預防。綜上所述，本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包含原位雜交檢測探針和標記物。其次，本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于與糖尿病前期篩查及早期預警相關的原位雜交檢測方法。

發(fā)明內容
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術方案如下
本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包括雜交探針和標記物，其中，所述的雜交探針序列為序列表SEQ ID NO. I所示序列，是S0RL-1基因序列⑶S中的一段，從601-1080bp，共480bp，S0RL-1基因為序列表SEQ ID NO. 2所示序列，位于染色體llq23. 2-24. 2〃 上，全長 10973bp。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是，所述的標記物選自放射性物質、化學發(fā)光或顯色物質、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括雜交液。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括增強劑。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括顯色劑。本發(fā)明的糖尿病病變前期S0RL-1篩查試劑盒應用價值在于，對糖尿病前期篩查及預警有非常重要臨床意義，進一步配合臨床做預防性治療。本發(fā)明還提供一種S0RL-1基因原位雜交的檢測方法，包括以下步驟
(1)在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和
(2)檢測所述雜交復合體。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16 - 24小時。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的血液細胞標本或其它器官組織細胞標本。更優(yōu)選地是，所述的血液標本或其它器官組織細胞標本來自糖尿病患者、高危人群、健康正常人群。本發(fā)明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術和組化免疫方法相結合，以S0RL-1為檢測對象,合成探針為序列表SEQ ID NO. I所示序列，480bp，檢測的底物是人體血液標本白細胞或組織細胞的RNA的表達量。原位雜交技術的顯示方法能提供S0RL-1的半定量或定量表達程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上RNA的表達量，正常人S0RL-1基因不表達，即無顯色，在糖尿病病人高度表達，大量染色，高危人群有輕度染色。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業(yè)內人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報告，其中雜交的具體步驟包括
1).將待測標本放入反應槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3).儀器自動棄去液體，自動后固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C);
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C);
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；
8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；9).儀器自動棄去液體，自動清洗,顯色；
10).取出封片鏡檢。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例的方案是以S0RL-1合成的核酸探針用地高辛標記(地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優(yōu)點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察RNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷目的RNA的表達量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術，該方法通過檢測底物細胞中的S0RL-1表達量，用來確定糖尿病病理演變前期的mRNA變化量，預警糖尿病基因病理生理學變化。因為S0RL-1在正常人中不表達，在糖尿病患者高表達，如果高危人群有表達表明有發(fā)生糖尿病的風險，及時進行(介入)預防性治療。一個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測糖尿病發(fā)生的風險。在生化指標未產(chǎn)生異常之前，及早做到以上基因mRNA表達異常的信息采集，給臨床醫(yī)生一個真正的早期預警和預防性治療參考和指導。此外，本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點，同時，本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。


圖I是本發(fā)明S0RL-1基因原位雜交技術流程圖。圖2是本發(fā)明實施例中糖尿病病人S0RL-1表達圖片。圖3是本發(fā)明實施例中輕度血糖升高的高危人群圖片。圖4是本發(fā)明實施例中正常人S0RL-1表達圖片。
具體實施例方式下面結合實施例，更具體地說明本發(fā)明的內容。應該理解，下面的實施例用于說明而非限定本發(fā)明內容，任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護范圍。實施例I
按照常規(guī)方法制備本實施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以S0RL-1基因設計的雜交探針、標記物、說明書，其中
本實施例的探針標記物選用地高辛。試劑盒雜交液組成
權利要求
1.一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. I所示序列。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的標記物選自放射性物質、化學發(fā)光或顯色物質、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種S0RL-1基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)在權利要求I所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和(2)檢測所述雜交復合體。
7.如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16 - 24小時。
8.如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液細胞標本。
9.如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的血液細胞標本選自糖尿病患者、聞危人群、正常人標本。
10.SFRP4基因在制備檢測糖尿病原位雜交試劑盒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與糖尿病病理演變前期密切相關的SORL-1基因mRNA的方法，包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和(2)檢測所述雜交復合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法可在mRNA水平上檢測SORL-1基因表達量，比現(xiàn)有的臨床生化檢測指標更早期，能實現(xiàn)真正的糖尿病病理演變前期mRNA水平篩查，做到糖尿病的預防性診治，將糖尿病消滅在萌芽狀態(tài)。同時，本發(fā)明的檢測方法簡單方便，成本低,便于醫(yī)院推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK102943124SQ20121053404
公開日2013年2月27日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權日2012年12月12日
發(fā)明者張玉麗, 裘建英, 張云福, 裘霖 申請人:芮屈生物技術(上海)有限公司