專利名稱：糖尿病病理演變前期SFRP4基因的mRNA水平原位雜交檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，是涉及與糖尿病病理演變mRNA表達(dá)改變(病理演變過(guò)程)的相關(guān)檢測(cè)技術(shù)。
背景技術(shù)：
2011年統(tǒng)計(jì)的最新數(shù)據(jù)顯示全國(guó)已經(jīng)確診的糖尿病有9240萬(wàn)，糖尿病前期的人群有I. 48億。糖尿病并發(fā)癥是一種常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，是由糖尿病病變轉(zhuǎn)變而來(lái)，后果相當(dāng)嚴(yán)重，如足病(足部壞疽、截肢)、腎病(腎功能衰竭、尿毒癥)、眼病(模糊不清、失明)、腦病(腦血管病變)、心臟病、皮膚病、性病等是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要因素。糖尿病的病理生理變化是由于胰島素分泌不足和組織糖利用障礙，導(dǎo)致血糖過(guò)高代謝障礙。糖尿病有原發(fā)性與繼發(fā)性兩種。原發(fā)性病因尚未清楚；，可能與遺傳等因素有關(guān)，繼發(fā)性見(jiàn)于慢性胰腺炎、癌癥、血色病、胰大部分手術(shù)切除、腦垂體前葉機(jī)能亢進(jìn)、促腎上腺皮質(zhì)機(jī)能亢進(jìn)、腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤、胰島α細(xì)胞瘤、妊娠糖尿病等。近來(lái)科學(xué)家們都把糖尿病的發(fā)病機(jī)制的放在基因病理生理學(xué)水平進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)了一些與糖尿病發(fā)病有關(guān)一些基因，如SFRP4基因是近來(lái)發(fā)現(xiàn)，SFRP4是在機(jī)體炎癥過(guò)程中起作用的分子，這是人們首次將其與二型糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)聯(lián)系起來(lái)，SFRP4基因?qū)倬幋a分泌型卷曲相關(guān)蛋白
4。SFRP4的表達(dá)與炎癥標(biāo)志物，其胰島釋放白細(xì)胞介素-I β刺激。全身SFRP4升高引起糖耐量降低，通過(guò)減少胰島細(xì)胞表達(dá)的Ca (2 +)通道，并抑制胰島素胞吐作用，SFRP4從而提供了胰島炎癥和胰島素分泌受損之間的聯(lián)系。此外，增加血清中的蛋白質(zhì)被從T2D患者幾年前診斷，這表明SFRP4 T2D胰島功能障礙可能是一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物。研究人員對(duì)糖尿病患者與非糖尿病患者的beta細(xì)胞(負(fù)責(zé)生產(chǎn)胰島素的細(xì)胞)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)SFRP4蛋白在糖尿病患者體內(nèi)的水平明顯較高，發(fā)現(xiàn)血液中SFRP4蛋白水平高于平均值的人，在未來(lái)幾年患糖尿病的可能性比SFRP4低于平均水平的人高五倍。這也是首次證明beta細(xì)胞中的炎癥與糖尿病有關(guān)，研究人員指出慢性低度炎癥削弱了 beta細(xì)胞，使它們不再能夠生產(chǎn)足量的胰島素。無(wú)疑，有多種因素參與了這一削弱過(guò)程，而SFRP4蛋白就是其中之一。研究人員每隔三年對(duì)上述非糖尿病患者血液中的SFRP4蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，這樣的檢測(cè)總共進(jìn)行了三次。研究顯示，血液中SFRP4高于平均水平的人中有37%在研究期間患上了糖尿病。而那些血液中SFRP4低于平均水平的人中，只有9%在研究期間患糖尿病。表明SFRP4蛋白可作為糖尿病的有力風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)，有望將診斷時(shí)間提前數(shù)年。研究人員還解析了 SFRP4損害胰島素分泌的機(jī)制，指出SFRP4水平升高會(huì)減少鈣離子通道在胰島的表達(dá)并抑制胰島素分泌，導(dǎo)致葡萄糖耐量減低。該蛋白標(biāo)志不僅能指示糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)，還能夠反映疾病的進(jìn)程。研究顯示，這一指標(biāo)獨(dú)立于其他已知二型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)因子，例如肥胖和年齡等等。研究人員認(rèn)為這一指標(biāo)可以通過(guò)簡(jiǎn)單的血液測(cè)試，指示正常體重的中年人患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。這將給他們更強(qiáng)的動(dòng)力來(lái)盡早改善生活方式，以預(yù)防糖尿病。此外，該研究也有助于人們開(kāi)發(fā)治療二型糖尿病的新方法，即阻斷beta細(xì)胞中的SFRP4蛋白以減少炎癥從而保護(hù)細(xì)胞。臨床上當(dāng)患者被確診為二型糖尿病時(shí)，往往這一疾病早已在患者體內(nèi)發(fā)展了多年，而且已經(jīng)對(duì)血管和眼部造成了傷害，及早篩查出糖尿病的早期風(fēng)險(xiǎn)是很有價(jià)值的，這樣人們就可以盡早采取預(yù)防性療法。本發(fā)明人在長(zhǎng)期研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致重大疾病死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期診治。因此，開(kāi)發(fā)出用于糖尿病發(fā)病前期的相關(guān)基因水平篩查試劑盒有非常大的臨床價(jià)值。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，疾病基因組學(xué)等研究的深入展開(kāi)，為了尋求更早期的診斷糖尿病、治療糖尿病、以及預(yù)防糖尿病，已 取得長(zhǎng)足進(jìn)步。至今，我們已有可能在基因的一級(jí)轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物mRNA水平上做更精確的早期篩查和診斷，在糖尿病前期做預(yù)測(cè)和篩查，這樣就能將糖尿病的發(fā)病率降下來(lái)，可以大大降低社會(huì)成本，進(jìn)一步提高國(guó)民的健康體質(zhì)。發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)用雙標(biāo)記技術(shù)，同步檢測(cè)蛋白質(zhì)與檢測(cè)mRNA,有時(shí)候mRNA有表達(dá)，但蛋白質(zhì)有時(shí)候沒(méi)有轉(zhuǎn)錄出來(lái)，它們有時(shí)候存在表達(dá)時(shí)空不對(duì)應(yīng)現(xiàn)象，才檢測(cè)mRNA更準(zhǔn)確。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)SFRP4基因在糖尿病患者、高危人群、正常對(duì)照人有明顯的表達(dá)量變化，將SFRP4作為篩查糖尿病病變前期有非常重要的臨床意義。發(fā)明人在長(zhǎng)期的研究中，得出了一種新理念，重大疾病的臨床診治模式一定要改變，不能只停留現(xiàn)在治已病(發(fā)病后診治)，要做到預(yù)防性診治，做到治已病，只有這樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率，降低社會(huì)成本和醫(yī)療成本。因此，發(fā)明人在開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術(shù)上都做了創(chuàng)新。特別是篩選臨床標(biāo)本(正常人群、高危人群、疾病患者)，突破了正常組織與病理組織比較的一貫性研發(fā)思路，來(lái)尋找和開(kāi)發(fā)病變前期的mRNA水平，與疾病早期基因病理生理學(xué)演變密切相關(guān)，而且臨床意義非常重要mRNA靶標(biāo)，將臨床上疾病形成后診治模式變成重大疾病的預(yù)防性診治，爭(zhēng)取了疾病診治的時(shí)間和空間，達(dá)到預(yù)防疾病。根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料采用原位雜交技術(shù)和組化免疫方法檢測(cè)SFRP4基因mRNA水平表達(dá)量的檢測(cè)技術(shù)及試劑盒未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明人在針對(duì)創(chuàng)新性發(fā)明的要求，設(shè)計(jì)了(糖尿病患者、高危人群、正常對(duì)照)不同數(shù)據(jù)例組，用原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明以上糖尿病病人高表達(dá)，高危人群有不同程度表達(dá)10-20%，正常對(duì)照都是不表達(dá)。表明SFRP4基因是糖尿病病變前期篩查的重要標(biāo)志物。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測(cè)特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含有特異序列、經(jīng)過(guò)標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行探測(cè)，從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。 原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對(duì)何靶分子)，探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標(biāo)記，以利于以后的檢測(cè)。常用的標(biāo)記物包括放射性核素和非放射性標(biāo)記物兩大類。常用的同位素標(biāo)記物有3H、35S、125I和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點(diǎn)，但是由于放射性同位素對(duì)人和環(huán)境均會(huì)造成傷害，近來(lái)有被非同位素取代的趨勢(shì)。非同位素標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測(cè)這些標(biāo)記物的方法都是極其靈敏的。根據(jù)所用探針及所要檢測(cè)核酸的不同又可分為DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA雜交。但不論哪一種形式的雜交，都必須經(jīng)過(guò)五大過(guò)程，即組織細(xì)胞的固定，預(yù)雜交、雜交、沖洗和顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針(RNA)和檢測(cè)的靶RNA是采用堿基互補(bǔ)(雜交互補(bǔ))的原理，同時(shí)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間研究和觀察，啟動(dòng)和中止處得殘基對(duì)檢測(cè)的結(jié)果沒(méi)有影響。
鑒于目前臨床上人類重大疾病診斷大部分是晚期，治療也是晚期，導(dǎo)致死亡率不降的診治模式。本發(fā)明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預(yù)防性治未病，達(dá)到重大疾病預(yù)防性診治目的，在理念和技術(shù)做出了創(chuàng)新性的突破，提供疾病變化mRNA水平篩查技術(shù)，使臨床上有了一項(xiàng)新的疾病變化前期mRNA水平篩查的技術(shù)，為臨床重大疾病的診治爭(zhēng)取時(shí)間和空間，實(shí)現(xiàn)重大的預(yù)防。綜上所述，本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，其包含原位雜交檢測(cè)探針和標(biāo)記物。其次，本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于與糖尿病前期篩查及早期預(yù)警相關(guān)的原位雜交檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，其包括雜交探針和標(biāo)記物，其中，所述的雜交探針序列為序列表SEQ ID NO. I所示序列，是SFRP4基因CDS中一段序列，420bp，SFRP4基因?yàn)樾蛄斜鞸EQ ID NO. 2所示序列，位于染色體7pl4. 1〃上。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括雜交液。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括增強(qiáng)劑。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括顯色劑。本發(fā)明的糖尿病病變前期SFRP4篩查試劑盒應(yīng)用價(jià)值在于，對(duì)糖尿病前期篩查及預(yù)警有非常重要臨床意義，進(jìn)一步配合臨床做預(yù)防性治療。本發(fā)明還提供一種SFRP4基因原位雜交的檢測(cè)方法，包括以下步驟
(1)在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測(cè)RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和
(2)檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時(shí)間為16 - 24小時(shí)。本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的血液細(xì)胞標(biāo)本或其它器官組織細(xì)胞標(biāo)本。更優(yōu)選地是，所述的血液標(biāo)本或其它器官組織細(xì)胞標(biāo)本來(lái)自糖尿病患者、高危人群、健康正常人群。
本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相結(jié)合，以SFRP4為檢測(cè)對(duì)象，合成探針是SFRP4基因CDS中一段序列，429bp，檢測(cè)的底物是人體血液標(biāo)本白細(xì)胞或組織細(xì)胞的RNA的表達(dá)量。原位雜交技術(shù)的顯示方法能提供SFRP4的半定量或定量表達(dá)程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上RNA的表達(dá)量，正常人SFRP4基因不表達(dá)，即無(wú)顯色，在糖尿病病人高度表達(dá)，大量染色，高危人群有輕度染色。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報(bào)告，其中雜交的具體步驟包括
1).將待測(cè)標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；
2).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)加消化液；
3).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)后固定；
4).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)預(yù)雜交(42°C);
5).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；
6).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)雜交(42°C);
7).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；
8).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；
9).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗,顯色；
10).取出封片鏡檢。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的方案是以SFRP4合成的核酸探針用地高辛標(biāo)記(地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)，還克服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過(guò)程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點(diǎn))，將該雜交探針與人體血液白細(xì)胞的待測(cè)RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察RNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的RNA的表達(dá)量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過(guò)檢測(cè)底物細(xì)胞中的SFRP4表達(dá)量，用來(lái)確定糖尿病病理演變前期的mRNA變化量，預(yù)警糖尿病基因病理生理學(xué)變化。因?yàn)镾FRP4在正常人中不表達(dá)，在糖尿病患者高表達(dá)，如果高危人群有表達(dá)表明有發(fā)生糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)進(jìn)行(介入)預(yù)防性治療。一個(gè)試劑盒可以多人份使用或一人份使用。本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測(cè)糖尿病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。在生化指標(biāo)未產(chǎn)生異常之前，及早做到以上基因mRNA表達(dá)異常的信息采集，給臨床醫(yī)生一個(gè)真正的早期預(yù)警和預(yù)防性治療參考和指導(dǎo)。此外，本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，同時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè)方法操作方便、簡(jiǎn)單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。


圖I是本發(fā)明SFRP4基因原位雜交技術(shù)流程圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例中糖尿病病人SFRP4表達(dá)圖片。圖3是本發(fā)明實(shí)施例中輕度血糖升高的高危人群圖片。
圖4是本發(fā)明實(shí)施例中正常人SFRP4表達(dá)圖片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)該理解，下面的實(shí)施例用于說(shuō)明而非限定本發(fā)明內(nèi)容，任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I
按照常規(guī)方法制備本實(shí)施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以SFRP4基因設(shè)計(jì)的雜交探針、標(biāo)記物、說(shuō)明書(shū)，其中 本實(shí)施例的探針標(biāo)記物選用地高辛。試劑盒雜交液組成___
消化液_100 μ L/管 I管/盒無(wú)色透明液體_
保護(hù)液ToouL/管 I管/盒無(wú)色透明液體
預(yù)雜交液_ 1300 μ L/管 2管/盒無(wú)色透明液體_
正義雜交液_10uL/管 ^ I管/盒免爸透明液體
反義雜交液_10 μ L/管_I管/盒無(wú)色透明液體_
封閉液_ 1000 μ L/管 I管/盒無(wú)色透明液體_
堿性磷酸酶抗體 Γμ L/管I管/盒無(wú)色透明液體
顯色劑A 75μ 7管_I管/盒黃色液體-
顯色劑Bj~20uL/管 I管/盒無(wú)色透明液體
緩沖液I_90mL/瓶I瓶/盒淺黃色或無(wú)色透明液體
緩沖液II_80mL/瓶I瓶/盒淺黃色或無(wú)色透明液體
緩沖液III^OmL/瓶 ^ 3瓶/盒孩黃色或無(wú)色透明液體
緩沖液IVbOmL/瓶 ^ I瓶/盒逐黃色或無(wú)色透明液體
固定液_90mL/瓶_I瓶/盒無(wú)色透明液體_
陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本|6片/盒
配制試劑使用濃度
1).將IOX緩沖液I用三蒸水按1:10稀釋成IX緩沖液I;
2).將20X緩沖液II用三蒸水按1:10稀釋成2X緩沖液II；
按1:100稀釋成O. 2 X緩沖液II ;按1:200稀釋成O. IX緩沖液II ；
3).將IOX緩沖液III用三蒸水按1:10稀釋成IX緩沖液III；
4).IOX緩沖液IV用三蒸水按1:10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各IOmL,加水至IOOmL既可)ο實(shí)施例2
應(yīng)用核酸原位雜交檢測(cè)方法對(duì)各組血液標(biāo)本SFRP4基因表達(dá)量的實(shí)施過(guò)程
1).取待測(cè)標(biāo)本兩張；
2).在玻璃缸里加入消化液(消化液100μL加IX緩沖液I 99. 9ml,即為使用濃度)50ml，37°C水浴預(yù)熱lOmin，放進(jìn)16張玻片，37°C處理12 min,再用IX緩沖液I洗5min ；
3).用0.2%的保護(hù)液(保護(hù)液Iml加I X緩沖液I，99ml即為使用濃度)洗lOmin，
三蒸水洗5min (以上過(guò)程都在玻璃缸進(jìn)行)，取出玻片，讓其自然干燥；
4).將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預(yù)雜交液25μ L/片(加在有細(xì)胞的地方)，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中3h以上；
5).取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%、90%、95%的乙醇各洗2min，取出，自然干燥；6).將玻片放入保濕盒內(nèi)，一張加正義雜交液25μ L/片，另一張加反義雜交液25 μ L/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；
7).取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)
在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min ；在42°C恒溫水浴箱中用O. 2X緩沖液II洗一次，每次15min ；
在42°C恒溫水浴箱中用O. IX緩沖液II洗兩次，每次15min ；
8).用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；
9)·將玻片放入保濕盒內(nèi)，加O. 5%封閉液(Iml封閉液加5ml I X緩沖液III) 100 μ L/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min。(此步驟不需加蓋玻片)；
10).取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；
11).將玻片放入保濕盒內(nèi)，加X(jué)-AP抗體(取一管堿性磷酸酶抗體，向其中加入I.8mlIX緩沖液III) 100 μ L/片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性(此步驟不需加蓋玻片)；
12).取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min；
13).用IX緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73.3 μ L，顯色劑B157. 5 μ L加到30mL IX緩沖液IV中，混勻)，室溫避光16h到18h以上；
14).用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。本發(fā)明的核酸原位雜交檢測(cè)方法將目的基因用地高辛標(biāo)記，成為RNA核酸探針，將探針與人體白細(xì)胞的待測(cè)RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，因此在光鏡下觀察RNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的RNA的表達(dá)量。糖尿病病人20名，高危人群(輕度血糖升高人)20名，正常對(duì)照組20名。抽所有待檢人的外周血3-5毫升(分離白細(xì)胞)做原位雜交。結(jié)果表示，所有糖尿病患者SFRP4基因mRNA表達(dá)量高，細(xì)胞染色深；高危人群表達(dá)稍降低，小數(shù)染色；正常對(duì)照組SFRP4基因不表達(dá)，細(xì)胞不染色，具體結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3、圖4。
權(quán)利要求
1.一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. I所示序列。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種SFRP4基因原位雜交檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)在權(quán)利要求I所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測(cè)RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和 (2)檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時(shí)間為16 - 24小時(shí)。
8.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液細(xì)胞標(biāo)本。
9.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的血液細(xì)胞標(biāo)本選自糖尿病患者、聞危人群、正常人標(biāo)本。
10.SFRP4基因在制備檢測(cè)糖尿病原位雜交試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物。還公開(kāi)使用本試劑盒原位雜交檢測(cè)與糖尿病病理演變前期密切相關(guān)的SFRP4基因mRNA的方法，包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測(cè)RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和(2)檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測(cè)方法可在mRNA水平上檢測(cè)SFRP4基因表達(dá)量，比現(xiàn)有的臨床生化檢測(cè)指標(biāo)更早期，能實(shí)現(xiàn)真正的糖尿病病理演變前期mRNA水平篩查，做到糖尿病的預(yù)防性診治，將糖尿病消滅在萌芽狀態(tài)。同時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單方便，成本低,便于醫(yī)院推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102965448SQ20121053415
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者張玉麗, 裘建英, 張?jiān)聘? 裘霖 申請(qǐng)人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司