專利名稱：一種wfdc-2基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說關(guān)于一種WFDC-2基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位。但因卵巢癌致死者，卻占各類婦科腫瘤的首位，對(duì)婦女生命造成嚴(yán)重威脅。由于卵巢的胚胎發(fā)育，組織解剖及內(nèi)分泌功能較復(fù)雜它所患的腫瘤可能是良性或惡性。因卵巢癌臨床早期無癥狀，鑒別其組織類型及良惡性相當(dāng)困難，其發(fā)病隱匿，約75%的患者就診時(shí)已為中晚期，預(yù)后較差，其病死率居?jì)D科惡性腫瘤之首。由于缺乏特異性臨床癥狀，僅有19%的卵巢癌患者是在腫瘤外侵前得到診斷及有效治療。在過去20年間,雖然卵巢癌的治療手段取得了進(jìn)步，卻未明顯提高卵巢癌的治愈率，卵巢癌行剖腹探查術(shù)中發(fā)現(xiàn)腫瘤局限于卵巢的僅占30%，大多數(shù)已擴(kuò)散到子宮雙側(cè)附件，大網(wǎng)膜及盆腔各器官，所以卵巢癌無論在診斷和治療上確是一大難題，多年來專家們對(duì)卵巢惡性腫瘤的病理形態(tài)，臨床發(fā)生發(fā)展規(guī)律及治療方案進(jìn)行了許多的探討，積累了大量的經(jīng)驗(yàn)到目前為止，就國內(nèi)外臨床資料統(tǒng)計(jì)，其五年生存率僅25% 30%，主要原因是晚期發(fā)現(xiàn)，晚期治療。考慮到卵巢癌早期與晚期治療預(yù)后的差異，尋找一個(gè)能夠在早期發(fā)現(xiàn)卵巢癌的診斷方法具有重要的臨床意義，特別是癌變前期的篩查標(biāo)志物臨床意義更大，這樣就可能做到預(yù)防性早期篩查和治療，降低卵巢癌的發(fā)病率和死亡率。目前實(shí)驗(yàn)室診斷卵巢癌的常用標(biāo)志物為CA125，其在卵巢癌診斷中有較好臨床意義，但同時(shí)也存在一些不足，一旦發(fā)現(xiàn)CA125升高，腫瘤已經(jīng)形成了，而且大部分都轉(zhuǎn)移了。近年來學(xué)者們還發(fā)現(xiàn)了其他卵巢癌標(biāo)志物，其中WFDC-2 (人附睪蛋白4)，由柯克霍弗(Kirchhoff)等于1990年通過cDNA篩檢在附睪組織中發(fā)現(xiàn)，包含2個(gè)保守的乳酸蛋白基團(tuán)。對(duì)該基因的氨基酸序列分析后發(fā)現(xiàn)，其具有大序列的奇數(shù)半胱氨酸片段，這也預(yù)示該基因可能與蛋白間的相互作用有重要聯(lián)系，基因位于人基因組染色體20ql2_13. I。通過微陣列及基因表達(dá)水平證實(shí)，WFDC-2基因在卵巢癌組織中過表達(dá)，在正常組織中表達(dá)正常，因此，該基因可能為診斷卵巢癌的潛在標(biāo)志物。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)癌癥的臨床診斷和治療都太晚了，這是導(dǎo)致癌癥死亡率高的關(guān)鍵原因，要改變這種狀況，必須做到癌變前期的篩查和治療，不要等到腫瘤形成后或轉(zhuǎn)移后再檢查和治療，做到預(yù)防性診治-基因水平治未病。為了驗(yàn)證WFDC-2篩查早期卵巢癌的價(jià)值，本發(fā)明特別設(shè)計(jì)了卵巢癌患者、卵巢良性腫瘤、正常對(duì)照組，觀察WFDC-2基因mRNA表達(dá)情況，見圖2、3、4。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，WFDC-2基因mRNA不僅可用于卵巢癌的早期診斷與鑒別，也可作為卵巢癌患者預(yù)后標(biāo)志物，這對(duì)卵巢癌患者術(shù)后選擇積極的治療方式，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療，最終提高卵巢癌患者生存率具有重要價(jià)值。
隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開，至今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或癌細(xì)胞形成(單克隆時(shí))就能做到早期預(yù)測(cè)診斷。WFDC-2基因的mRNA篩查技術(shù)比檢查WFDC-2蛋白要準(zhǔn)確的多，發(fā)明人在研究中用雙標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)mRNA和蛋白的表達(dá)有時(shí)候不同步，有的蛋白就不表達(dá)，所以，采用mRNA技術(shù)比較可靠。本發(fā)明人查閱相關(guān)文獻(xiàn)至今沒有WFDC-2基因的mRNA水平癌變前期篩查試劑盒報(bào)道，也沒有采用原位雜交技術(shù)的檢測(cè)方法。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測(cè)特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行探測(cè)，從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種WFDC-2基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒的用途。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種WFDC-2基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種WFDC-2基因的原位雜交檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
一種原位雜交檢測(cè)試劑盒,包括雜交探針和標(biāo)記物,所述的雜交探針為序列表SEQ IDNO. I所示序列，是WFDC-2基因CDS中(38 "412bp)，探針長(zhǎng)375bp，與體內(nèi)的靶片段進(jìn)行反向互補(bǔ)雜交。WFDC-2基因?yàn)樾蛄斜鞸EQ ID NO. 2所示序列，全長(zhǎng)486bp，位于染色體20ql2_ql3” 上。所述的雜交探針序列所示的RNA序列。所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P中的一種。所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
一種WFDC-2基因的原位雜交檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟
a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測(cè)RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；
b、檢測(cè)a步驟得到的雜交復(fù)合體。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報(bào)告，其中雜交的具體步驟包括
儀器操作
1).將待測(cè)標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；
2).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)加消化液；3).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)后固定；
4).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)預(yù)雜交(42°C);
5).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；
6).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)雜交(42°C);
7).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；
8).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；
9).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗,顯色；
10).取出封片鏡檢。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于
I、本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。2、本發(fā)明的檢測(cè)方法操作方便、簡(jiǎn)單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。3、本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測(cè)卵巢癌發(fā)生動(dòng)態(tài)過程，以及用于卵巢癌預(yù)防醫(yī)學(xué)的檢測(cè)和篩選工具。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測(cè)癌胚蛋白標(biāo)志物，以及影像醫(yī)學(xué)檢查有顯著不同。本發(fā)明是用于癌變前期的mRNA水平上檢測(cè)WFDC-2異常表達(dá)，在影像醫(yī)學(xué)檢查及其它檢查未發(fā)現(xiàn)占位性卵巢癌病灶之前，癌癥生化指標(biāo)未產(chǎn)生異常之前，亦未形成腫塊之前，能及早做到以上基因表達(dá)異常的信息采集，給臨床卵巢癌病患一個(gè)真正的預(yù)后早期診斷。這樣才有可能實(shí)施卵巢癌的早期診斷、早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治卵巢癌惡疾。


圖I是核酸原位雜交技術(shù)流程圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例中卵巢癌病人WFDC-2基因表達(dá)圖片。圖3是本發(fā)明實(shí)施例中卵巢良性腫瘤病人的WFDC-2基因表達(dá)圖片。圖4是本發(fā)明實(shí)施例中正常人WFDC-2基因表達(dá)圖片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。實(shí)施例I
一種WFDC-2基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物、增效劑，其中，所述的雜交探針序列所示。雜交探針用地高辛標(biāo)記。試劑盒中的其它液體和標(biāo)本組成如下:
權(quán)利要求
1.一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. I所示序列。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種WFDC-2基因原位雜交檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)在權(quán)利要求I所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測(cè)RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和 (2)檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時(shí)間為16 - 24小時(shí)。
8.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液細(xì)胞標(biāo)本。
9.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的血液細(xì)胞標(biāo)本選自卵巢癌患者、卵巢癌高危人群、正常對(duì)照女性。
10.WFDC-2基因在制備檢測(cè)卵巢癌原位雜交試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種WFDC-2基因(附睪蛋白4-HE4)的mRNA原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列是WFDC-2基因的一段堿基。本發(fā)明還提供了一種WFDC-2基因mRNA原位雜交檢測(cè)方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒在制備檢測(cè)卵巢癌疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于卵巢癌變前期篩查WFDC-2基因的mRNA表達(dá)量，做到早期的預(yù)防性篩查。本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。本發(fā)明的檢測(cè)方法操作方便、簡(jiǎn)單，能在醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102965449SQ20121053415
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者張玉麗, 裘建英, 張?jiān)聘? 裘霖 申請(qǐng)人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司