專(zhuān)利名稱(chēng)：老年性癡呆病變前期CD33基因mRNA水平原位雜交篩查試劑盒及篩查方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，是涉及與老年性癡呆(AD)病變前期mRNA表達(dá)改變(病理演變過(guò)程)的相關(guān)檢測(cè)技術(shù)。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease-, AD)是最常見(jiàn)的癡呆類(lèi)型，占所有癡呆的60% 80%，也是致殘率高和負(fù)擔(dān)大的疾病之一。到2006年，人類(lèi)第一殺手心臟病死亡率比2000年下降了 11. 5%，第二殺手卒中死亡率下降了 18. 1%，但阿爾茨海默病的死亡率卻上升了 47. 1%，成為老年人的第5位致死原因。隨著全球性人口規(guī)模和預(yù)期壽命的增加，阿爾茨海默病已成為世界衛(wèi)生問(wèn)題，根據(jù)未來(lái)的預(yù)測(cè)，癡呆患病率每二十年增加近一倍，至2030年將達(dá)到6570萬(wàn)，到2050年將達(dá)到I億1540萬(wàn)。各國(guó)阿爾茨海默病患者數(shù)增加不是均衡的。發(fā)達(dá)國(guó)家的癡呆人數(shù)預(yù)測(cè)以100%的比例增長(zhǎng)，而中國(guó)/印度及其南亞和西太平洋鄰國(guó)等發(fā)展中國(guó)家將以超過(guò)300%的比例增長(zhǎng)，中國(guó)的AD人數(shù)則將以336%的比例增長(zhǎng)。中國(guó)是世界上人口老化基數(shù)最大國(guó)家，截止2008年底，我國(guó)60歲以上老年人口已接近1. 69億，占總?cè)丝诘?2%。根據(jù)2005年北京協(xié)和醫(yī)院領(lǐng)導(dǎo)的一項(xiàng)跨省市(北京/上海/成都/西安)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果估計(jì)，65歲以上老年人AD患病率為4. 8%，且隨著年齡增長(zhǎng)而增加。因此，中國(guó)絕不是一個(gè)AD低發(fā)國(guó)家，恰恰相反，而是世界上AD人數(shù)最多且增長(zhǎng)速度最快的國(guó)家。因此迅猛增加的疾病負(fù)擔(dān)必將對(duì)我國(guó)的社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和家庭生活產(chǎn)生重要影響。AD是世界上致殘率高且負(fù)擔(dān)重的疾病。按照2003年度世界衛(wèi)生組織報(bào)導(dǎo)的關(guān)于全球疾病負(fù)擔(dān)的估計(jì)，60歲以上老年人中癡呆導(dǎo)致殘疾的占11. 2%，遠(yuǎn)高于卒中(9. 5%)、骨骼肌障礙(8. 9%)、心血管病(5%)及各種類(lèi)型的癌癥(2. 4%)。據(jù)美國(guó)一個(gè)跨學(xué)科專(zhuān)家組的共識(shí)估計(jì)，除脊髓損傷和晚期癌癥以外，AD致殘加權(quán)顯著高于任何其他健康狀況。在美國(guó)，AD人口已超過(guò) 500萬(wàn)，AD的花費(fèi)已超過(guò)1000億美元，估計(jì)到2050年AD患者人數(shù)將以幾何級(jí)數(shù)方式增長(zhǎng)到1300萬(wàn)人，經(jīng)過(guò)核算，每年將花費(fèi)1400億美元。AD已成為重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，并確定為未來(lái)幾年公共衛(wèi)生問(wèn)題的研究重點(diǎn)。AD是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能減退，典型病理改變?yōu)槔夏臧?sen ile plaque, SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurona I fibrillarytang les, NFT)及神經(jīng)元丟失，另外伴有顆?？张葑冃?granulov acuolardegeneration,⑶)，平野小體和腦血管的改變。經(jīng)過(guò)數(shù)十年有關(guān)AD的病因和發(fā)病機(jī)制的研究后，雖然對(duì)AD的病因還有許多不了解，但是對(duì)其病理和生理機(jī)制有了肯定和全面的認(rèn)識(shí)，并從中發(fā)現(xiàn)了一些重要的疾病標(biāo)志?，F(xiàn)代分子遺傳學(xué)在幫助人類(lèi)認(rèn)識(shí)AD的發(fā)病機(jī)制方面意義非凡，發(fā)現(xiàn)常染色體突變能導(dǎo)致A P 42肽的表達(dá)增多，參與的基因包括⑶33基因。⑶33基因是最近發(fā)現(xiàn)四個(gè)新基因與老年性癡呆發(fā)病有關(guān)其中之一。AD的生物標(biāo)志物能很好地幫助臨床診斷，與病理發(fā)現(xiàn)有良好的一致性。2010年美國(guó)國(guó)立老化研究院和阿爾茨海默病聯(lián)合會(huì)推薦新的診斷定義與標(biāo)準(zhǔn)，強(qiáng)調(diào)將記憶損害與生物標(biāo)志物結(jié)合。AD是疾病的整個(gè)臨床過(guò)程，包括了 AD癡呆前期和癡呆期AD。AD的臨床前驅(qū)期則指出現(xiàn)早期病理生理學(xué)改變至出現(xiàn)最早的認(rèn)知癥狀之間漫長(zhǎng)的階段。當(dāng)前，臨床使用的AD治療藥物不少，但均缺乏有臨床意義的療效。癡呆是嚴(yán)重的認(rèn)知功能損害，呈進(jìn)展性和不可逆性，要通過(guò)藥物干預(yù)實(shí)現(xiàn)病情穩(wěn)定或緩解是極其困難的。因此，對(duì)癡呆實(shí)施預(yù)防應(yīng)該是一個(gè)重要的臨床研究方向。最新AD研究報(bào)告表明，作為“嬰兒”這一代，到2050年在美國(guó)將有I千3百50萬(wàn)人成為AD癡呆患者。如果，假設(shè)有一種干預(yù)可以是AD癡呆的發(fā)病延遲5-10年或提早5-10預(yù)測(cè)和篩查，那么AD癡呆患者人數(shù)將減少80%，用于AD的預(yù)計(jì)醫(yī)療費(fèi)用將會(huì)大大減少。中國(guó)現(xiàn)有AD患者以超過(guò)800多萬(wàn)，而且，發(fā)病人數(shù)每年在上升。因此，尋找有效AD篩查工具，對(duì)臨床前期AD患者及未發(fā)生AD高危人群的早期篩查，在人群中盡早開(kāi)展干預(yù)治療，減少AD的最終發(fā)生率有重要的臨床和時(shí)代意義。盡早開(kāi)發(fā)出應(yīng)用于AD病變前期mRNA水平篩查試劑盒，這將改變目前臨床上的AD發(fā)生后的診治模式，將AD的診治提高、提前到病變前期，做到預(yù)防性(治未病)的早期介入和治療，并進(jìn)一步做到mRNA水平的調(diào)控及基因早期治療，將AD消滅在萌芽狀態(tài)。本發(fā)明人在長(zhǎng)期研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致老年性癡呆治療效果不佳的主要原因是不能做到真正的早期診斷和早期治療。本課題擬采用核酸原位雜交技術(shù)，尋找與AD發(fā)病密切相關(guān)的CD33基因一級(jí)轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物-mRNA，觀察其在AD病人、高危人群、正常對(duì)照人群表達(dá)變化，統(tǒng)計(jì)分析其臨床應(yīng)用意義和價(jià)值，并培養(yǎng)、開(kāi)發(fā)出可應(yīng)用于臨床的早期篩查試劑盒，用于臨床前期AD患者及高危人群的早期篩查，做到預(yù)防性診治，盡早開(kāi)展干預(yù)治療，減少AD的最終發(fā)生率。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，疾病基因組學(xué)等研究的深入展開(kāi)，為了尋求更早期的篩查和治療老年性癡呆、以及預(yù)防老年性癡呆，已取得長(zhǎng)足進(jìn)步。至今，我們已有可能在基因的一級(jí)轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物(mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷，在老年性癡呆癥的基 因生理病理學(xué)演變前期，就可以做到早期預(yù)測(cè)和篩查。本發(fā)明采用核酸原位雜交技術(shù)，選擇多組臨床標(biāo)本(老年性癡呆患者、高危人群、正常對(duì)照)，對(duì)⑶33基因與老年性癡呆癥的早期預(yù)警進(jìn)行檢測(cè)分析。CD33基因的mRNA作為早期篩查老年性癡呆病變前期有非常重要的臨床診斷意義。CD33基因的mRNA在老年性癡呆癥前期及病變過(guò)程中表達(dá)過(guò)度。它作于老年性癡呆病變前期篩查、及老年性癡呆癥早期預(yù)防的檢測(cè)指標(biāo)及治療后的復(fù)發(fā)預(yù)警也有非常重要的臨床意義。發(fā)明人在長(zhǎng)期的研究中，得出了一種新理念，臨床的重大疾病的臨床診治模式一定要改變，不能只停留現(xiàn)在治已病(發(fā)病后診治)，要做到預(yù)防性診治，做到治已病，只有這樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率，降低社會(huì)成本和醫(yī)療成本。因此,發(fā)明人在開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術(shù)上都做了大膽創(chuàng)新。特別是篩選臨床標(biāo)本(正常人群、高危人群、疾病患者)，突破了正常組織與疾病組織比較的一貫性研發(fā)思路，來(lái)尋找和開(kāi)發(fā)病變期前mRNA水平，與疾病早期基因病理生理學(xué)演變密切相關(guān)，而且臨床意義非常重要靶標(biāo)，將臨床上疾病形成后診治模式變成疾病的預(yù)防性診治，爭(zhēng)取了疾病診治的時(shí)間和空間，達(dá)到預(yù)防重大疾病。根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料⑶33基因mRNA水平的檢測(cè)技術(shù)及試劑盒未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明人在對(duì)(老年性癡呆患者、高危人群、正常對(duì)照人)例組，用原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明以上老年性癡呆癥⑶33基因都過(guò)度表達(dá)，高危人群有不同程度表達(dá)15-25%,正常人都是零表達(dá)。表明⑶33基因是老年性癡呆病變前期篩查的重要標(biāo)志物。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測(cè)特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含有特異序列、經(jīng)過(guò)標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行探測(cè)，從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對(duì)何靶分子)，探針的種類(lèi)按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標(biāo)記，以利于以后的檢測(cè)。常用的標(biāo)記物包括放射性核素和非放射性標(biāo)記物兩大類(lèi)。常用的同位素標(biāo)記物有3H、35S、125I和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點(diǎn)，但是由于放射性同位素對(duì)人和環(huán)境均會(huì)造成傷害，近來(lái)有被非同位素取代的趨勢(shì)。非同位素標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測(cè)這些標(biāo)記物的方法都是極其靈敏的。根據(jù)所用探針及所要檢測(cè)核酸的不同又可分為DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA雜交。但不論哪一種形式的雜交，都必須經(jīng)過(guò)五大過(guò)程，即組織細(xì)胞的固定，預(yù)雜交、雜交、沖洗和顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針(mRNA)和檢測(cè)的靶mRNA是采用堿基互補(bǔ)(雜交互補(bǔ))的原理，同時(shí)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間研究和觀察，啟動(dòng)和中止處得殘基對(duì)檢測(cè)的結(jié)果沒(méi)有影響(因?yàn)椋l(fā)明人采用的mRNA序列都超過(guò)450bp以上，而對(duì)于較長(zhǎng)的堿基序列，超過(guò)IOOObp以上，我們會(huì)選擇該基因的⑶S來(lái)做探針，如果⑶S的堿基序列長(zhǎng)度也超過(guò)IOOObp以上，我們會(huì)選擇其中一段堿基序列來(lái)合成探針，但要經(jīng)過(guò)Blast分析機(jī)體中是否有相同堿基序列片段存在)。本發(fā)明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預(yù)防性治未病，達(dá)到預(yù)防性診治，將目前影像醫(yī)學(xué)手段和眾多生化標(biāo)記物無(wú)法檢測(cè)到老年性癡呆病理演變前期mRNA水平量化改變技術(shù)，做了創(chuàng)新性的技術(shù)突破，提供老年性癡呆前變mRNA水平篩查技術(shù)。使臨床上有了一項(xiàng)新的老年性癡呆病理演變前期mRNA水平真正早期篩查的技術(shù)，為臨床老年性癡呆癥的早期預(yù)防和治療爭(zhēng)取時(shí)間和空間。綜上所述，本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，其包含原位雜交檢測(cè)探針和標(biāo)記物。其次，本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于與老年性癡呆病理演變前期的⑶33基因的原位雜交檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，其包括雜交探針和標(biāo)記物，其中，所述的雜交探針序列為序列表SEQ ID NO.1所 示序列，是CD33基因CDS中(41...1135bp)，從121...540bp的一段，探針長(zhǎng)420bp，與體內(nèi)的靶片段進(jìn)行反向互補(bǔ)雜交)。⑶33基因?yàn)樾蛄斜鞸EQID NO. 2所示序列，全長(zhǎng)1466bp，位于染色體19ql3. 3上”。
本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括雜交液。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括增強(qiáng)劑。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括顯色劑。本發(fā)明的老年性癡呆病理演變前期基因篩查試劑盒應(yīng)用價(jià)值在于，能在mRNA水平，及早對(duì)老年性癡呆病理演變前期的篩查及老年性癡呆癥經(jīng)治療后療效的評(píng)判。CD33基因是一種老年性早衰基因，它的表達(dá)變化表明老年性癡呆癥前期病理演變的可能，提示臨床醫(yī)生及早介入預(yù)防和治療。本發(fā)明還提供一種⑶33基因原位雜交的檢測(cè)方法，包括以下步驟
(1)在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測(cè)RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和
(2)檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時(shí)間為16 - 24小時(shí)。本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的血液白細(xì)胞標(biāo)本或其它器官組織細(xì)胞、或腦脊液標(biāo)本。更優(yōu)選地是，所述的血液標(biāo)本或其它器官組織細(xì)胞標(biāo)本來(lái)自老年性癡呆患者、高危人群，正常人群。本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的高危人群、老年性癡呆癥好發(fā)家族、經(jīng)治療后老年性癡 呆癥病人。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相結(jié)合，以CD33基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象，合成探針是CD33基因的RNA序列，檢測(cè)的底物是人體血液標(biāo)本白細(xì)胞或組織細(xì)胞及腦脊液的RNA的表達(dá)量。原位雜交技術(shù)的顯示方法能提供CD33基因的半定量或定量表達(dá)程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上基因的表達(dá)量，正常人CD33基因表達(dá)低或不表達(dá)，即不顯色，CD33基因在老年性癡呆病人和正常人有顯著差異，該基因的表達(dá)量比正常人表達(dá)量都高，高度顯色。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報(bào)告，其中雜交的具體步驟包括
1).將待測(cè)標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；
2).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)加消化液；
3).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)后固定；
4).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)預(yù)雜交(42°C);
5).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；
6).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)雜交(42°C);
7).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；
8).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；
9).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗,顯色；
10).取出封片鏡檢。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的方案是以CD33基因?yàn)槟康幕蚝铣傻暮怂崽结樣玫馗咝翗?biāo)記(地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)，還克服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過(guò)程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點(diǎn))，將該雜交探針與人體血液白細(xì)胞的待測(cè)RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達(dá)量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過(guò)檢測(cè)底物細(xì)胞中的CD33基因表達(dá)量，用來(lái)確定老年性癡呆病理演變是否已發(fā)生，因?yàn)棰?3基因在正常人中低表達(dá)或不表達(dá)，如果⑶33基因表達(dá)高度，說(shuō)明老年性癡呆發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)非常高，以及治療后病人治療效果評(píng)判，從而獲得老年性癡呆前期的篩查和診斷信息，幫助臨床醫(yī)生及早介入。一個(gè)試劑盒可以多人份使用或一人份使用。如上所述，當(dāng)檢測(cè)到⑶33基因的表達(dá)高于正常對(duì)照時(shí)，則可預(yù)測(cè)受試者老年性癡呆病理演變已發(fā)生。本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測(cè)老年性癡呆病變發(fā)生和病理演變過(guò)程中老年性癡呆癥的發(fā)生、發(fā)展趨勢(shì)。本發(fā)明可以在基因水平上檢測(cè)CD33基因異常表達(dá)，亦未形成老年性癡呆之前，能及早做到以上基因表達(dá)異常的信息采集，給臨床老年性癡呆病理演變前期高風(fēng)險(xiǎn)人群，一個(gè)真正的早期篩查以及治療后療效判定。這樣才有可能實(shí)施老年性癡呆的早期篩查、早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治老年性癡呆這一惡疾。此外，本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，同時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè) 方法操作方便、簡(jiǎn)單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。


圖1是本發(fā)明⑶33基因原位雜交實(shí)施流程圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例老年性癡呆病人⑶33過(guò)量表達(dá)圖片。圖3是本發(fā)明實(shí)施例中正常人⑶33表達(dá)圖片。圖4是本發(fā)明實(shí)施例中高危人群⑶33表達(dá)圖片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)該理解，下面的實(shí)施例用于說(shuō)明而非限定本發(fā)明內(nèi)容，任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1
按照常規(guī)方法制備本實(shí)施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以CD33基因?yàn)闄z測(cè)目的基因設(shè)計(jì)的雜交探針、標(biāo)記物、說(shuō)明書(shū)，其中
本實(shí)施例的探針標(biāo)記物選用地高辛。試劑盒雜交液組成___
消化液_IOOu L/管 I管/盒無(wú)色透明液體_
保護(hù)液 〗00 u L/管_1管/盒無(wú)色透明液體
預(yù)雜交液_ 1300 u L/管 2管/盒無(wú)色透明液體_
雜交液u L/管、管/盒■透明液體
反義雜交液_IOu L/管 I管/盒無(wú)色透明液體_
封閉液_IOOOu L/管 I管/盒無(wú)色透明液體_
MS擒酸酶抗體 |l U L/管|l管/盒I無(wú)色透明液體
權(quán)利要求
1.一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO.1所示序列。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種CD33基因原位雜交檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)在權(quán)利要求1所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測(cè)RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和 (2)檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時(shí)間為16 - 24小時(shí)。
8.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液白細(xì)胞和腦脊液細(xì)胞標(biāo)本。
9.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的標(biāo)本是老年性癡呆患者、55歲以上高危人群、正常對(duì)照人群，包括臨床上的高危人群病變前期病理演變，以及老年性癡呆患者治療后的復(fù)發(fā)病理演變過(guò)程中⑶33基因mRNA表達(dá)變化。
10.CD33基因在制備檢測(cè)老年性癡呆原位雜交試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物。還公開(kāi)使用本試劑盒原位雜交檢測(cè)與老年性癡呆(Alzheimer’sDisease-AD)前期病理演變有密切相關(guān)的CD33基因mRNA的方法，包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測(cè)RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和(2)檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測(cè)方法可以在，mRNA水平上檢測(cè)CD33基因的表達(dá)功能，比現(xiàn)有的臨床生化檢測(cè)指標(biāo)和影像醫(yī)學(xué)檢查更早期，能實(shí)現(xiàn)真正的老年性癡呆(AD)病變前期mRNA水平的篩查，做到預(yù)防性診治的目的。同時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單方便，成本低，便于醫(yī)院推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103045730SQ20121053421
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者張玉麗, 裘建英, 張?jiān)聘? 裘霖 申請(qǐng)人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司