拮抗抑制血管內(nèi)皮細胞生長因子與其受體結(jié)合的單克隆抗體及分泌它的雜交瘤細胞系與用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)-單克隆抗體領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種可拮抗抑制血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）與其受體（VEGF-R）結(jié)合的單克隆抗體及分泌它的雜交瘤細胞系，該雜交瘤細胞系的保藏編號為CGMCC?No.5889。本發(fā)明還公開了該單克隆抗體的制備方法及其用途,包括其在檢測VEGF蛋白的應(yīng)用以及在制備治療與血管增生有關(guān)疾病的藥物制劑中的應(yīng)用。
【專利說明】拮抗抑制血管內(nèi)皮細胞生長因子與其受體結(jié)合的單克隆抗體及分泌它的雜交瘤細胞系與用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)-單克隆抗體領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種可拮抗抑制血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)與其受體(VEGF-R)結(jié)合的單克隆抗體及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]血管新生或增生(angiogenesis)在生物學(xué)上是指體內(nèi)的已存在的血管(如毛細血管和微小動、靜脈)通過出芽或分裂的方式而產(chǎn)生新的血管的過程。血管新生在維持機體的許多正常的生理過程如組織胚胎發(fā)育、外傷傷口的癒合與修復(fù)等是有益的和必需的。但過度的血管新生或增生也與許多病理變化(如腫瘤的增生擴散、炎癥等)息息相關(guān)。體內(nèi)的血管能夠不斷地增生與增長的關(guān)鍵是其內(nèi)襯的血管內(nèi)皮細胞具有不斷分裂增生及定向遷移置入已有的血管管壁的能力。血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growthfactor, VEGF)則是已知的最重要及最強烈的促血管內(nèi)皮細胞分裂增生及血管增長的因子。VEGF在血管增生中的重要性已在VEGF基因剔除小鼠的研究中被充分證實:因為只要當VEGF基因中的一份被敲除后，小鼠胚胎在僅發(fā)育至11至12天時就會因血管增生受阻及異常而死亡(Carmeliet P 等 Nature 1996, 380:435;Ferrara N 等 Nature 1996,380:439)。
[0003]VEGF在多種惡性腫瘤組織中(如胃癌、肝癌、結(jié)、直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等)呈過度表達，且其表達水平高低與腫瘤生長與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)程度呈高度正相關(guān)(DvorakHF 等 J Exp Med 1991;174:1275-8 ；Brown LF 等 Cancer Res 1993;53:4727-35 ；ffeidnerN, Semple JP, Welch WR 及 Folkman J:N Engl J Med 1991 ;324:1-8.4-5)。近年來國內(nèi)外一系列動物試驗及臨床實踐已證明:如通過基因調(diào)控或給予藥物來阻斷體內(nèi)VEGF及其受體(VEGFR)介導(dǎo)的促血管增生，則可導(dǎo)致腫瘤組織因缺血而壞死，從而達到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移及延長患者生存期的良好療效。因此，以VEGF及其受體為靶點的抗腫瘤血管增生藥物已成為當今國內(nèi)外藥物研發(fā)競爭熱點。
[0004]在以VEGF及其受體為靶點的抗腫瘤血管增生藥物的開發(fā)上，目前主要有兩大模式:
[0005]模式一是研制拮抗VEGF受體(VEGF-R)中位于細胞膜內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶活性的抑制劑，這類拮抗抑制劑一般都屬于小分子化學(xué)類藥，其中的代表性藥物為2006年由美國Pfizer(輝瑞)開發(fā)上市的Sutent (舒尼替尼);及由德國Bayer(拜耳)與美國OnyxPharmaceuticals 開發(fā)上市的 Nexavar0 [0006] 模式二是研制可直接阻斷VEGF與其受體(VEGF-R)中位于細胞膜外區(qū)域結(jié)合的抗體或抗體-Fe融合蛋白，這類拮抗抑制劑一般都屬于大分子蛋白類生物制劑，其中的代表性藥物為由Roche/Genentech公司研發(fā)生產(chǎn)并于2004年獲美國FDA批準上市的抗VEGF單克隆抗體藥物Bevacizumab(貝伐單抗)，商品名Avastin(阿瓦斯丁)。Bevacizumab是目前為止全球市場上唯一的一個以VEGF為靶點的人源化單克隆抗體藥物。Avastin通過與體內(nèi)VEGF的高度特異結(jié)合，從而阻止VEGF與其受體的結(jié)合，進而達到抗血管增生與抗腫瘤的療效(PrestaLG 等 Cancer Res, 1997, 57:4593; Hurwitz H等 N Engl J Med, 2004; 350:2335)?目前已獲美國FDA批準用于與化療藥合并治療結(jié)腸癌、肺癌、腦瘤、腎癌等多種實體瘤。
[0007]Avastin其前身可追溯到代號為A4.6.1的小鼠單克隆抗體。該小鼠單克隆抗體的來源及分泌它的雜交瘤細胞系與用途在專利號為US6，582，959的美國專利(發(fā)明人:Kim, Kyung Jin,專利授權(quán)日期:June 24，2003,專利名稱:Antibodies to vascularendothelial cell growth factor);及專利號為 US7, 227，004 的美國專利(發(fā)明人:Kim,Kyung Jin專利授權(quán)日期:June 5，2007,專利名稱:Antibodies to vascular endothelialcell growth factor)中都有所描述。該鼠源抗體及其人源化抗體rhuMab_VEGF (即Bevacizumab)的序列及其制備方法已在專利號為US6, 054, 297的美國專利(發(fā)明人:Carter;Paul J.及 Presta;Leonard G,專利 申請日期::May 9,1995,專利授權(quán)日期:April25，2000,專利名稱:Humanized antibodies and methods for making them)公開并在Cancer Res 雜志上發(fā)表(Presta LG 等 Cancer Res, 1997, 57:4593)。
[0008]但該抗體還存在如下不足:
[0009]I)與大多數(shù)的單克隆抗體一樣，小鼠單克隆抗體A4.6.1及其人源化抗體Bevacizumab也僅只是能結(jié)合VEGF抗原表位中的部分位點，無法結(jié)合或涵蓋VEGF抗原表位中眾多的其他位點。
[0010]2)先前在動物實驗中及近年來的臨床研究中發(fā)現(xiàn)僅單獨給予小鼠單克隆抗體A4.6.1或Bevacizumab抗體,無法達到完全中和抑制體內(nèi)VEGF及其介導(dǎo)的促血管新生。
[0011]因此，研制具有新的可拮抗抑制人VEGF蛋白與其受體(VEGF-R)結(jié)合的單克隆抗體或藥物制劑顯得很有意義與必要。
[0012]為獲得可拮抗抑制人VEGF蛋白與其受體(VEGF-R)結(jié)合的單克隆抗體及分泌它的雜交瘤細胞系，本發(fā)明選取由酵母表`達的重組人VEGF165蛋白為免疫抗原，通過反復(fù)多次小劑量的小鼠皮下免疫，獲得分泌高效價的抗VEGF多克隆抗體；再從中挑取小鼠，取其脾臟細胞，通過體外與小鼠骨髓瘤細胞融合、再經(jīng)藥物篩選及亞克隆等步驟而建立了多株穩(wěn)定分泌抗人VEGF抗體的雜交瘤單克隆細胞。其中一代號為PV19-5小鼠雜交瘤細胞株(以下又簡稱PV19)，經(jīng)ELISA、免疫印跡，免疫組化等多種方法鑒定，證實其所分泌的單克隆抗體能夠特異識別并高親合力結(jié)合人VEGF (包括VEGF121U65及VEGF189等)。體外測試表明該鼠源單克隆抗體可高效抑制VEGF與其受體(VEGF-R)的結(jié)合。在人類移植腫瘤裸鼠模型上的測試結(jié)果還表明該鼠源單克隆抗體能有效抑制包括如乳腺癌、橫紋肌肉瘤等多種腫瘤在體內(nèi)的生長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供拮抗抑制血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)與其受體(VEGF-R)結(jié)合的小鼠單克隆抗體。
[0014]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供分泌生產(chǎn)該單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞系；該雜交瘤細胞系代號為PV19-5 (以下又簡稱PV19)，已于2012年03月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏編號為CGMCC No 5889.保藏地點:中國，北京)。
[0015]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供本發(fā)明的單克隆抗體的制備方法。[0016]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之四是提供本發(fā)明的小鼠單克隆抗體在VEGF相關(guān)的研究和臨床檢測診斷與治療等領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明選取重組人VEGF蛋白為免疫原，通過反復(fù)多次小劑量的小鼠皮下免疫，獲得分泌高效價的抗VEGF多克隆抗體；再從中挑取小鼠，取其脾臟細胞，通過體外與小鼠骨髓瘤細胞融合、再經(jīng)藥物篩選及亞克隆等步驟而建立了多株穩(wěn)定分泌抗人VEGF抗體的雜交瘤單克隆細胞。其中一代號為PV19-5雜交瘤細胞株，經(jīng)ELISA、免疫印跡、免疫組化等多種方法鑒定，證實其所分泌的單克隆抗體能夠特異識別并結(jié)合人VEGF (包括VEGF121、VEGF165及VEGF189等)。體外研究還證明該單克隆抗體可競爭抑制VEGF與其受體(gpVEGF-R)的結(jié)合，體內(nèi)在人類移植腫瘤裸鼠模型上的測試結(jié)果還表明該鼠源單克隆抗體能有效抑制包括如乳腺癌、橫紋肌肉瘤等多種腫瘤在體內(nèi)的生長。
[0018]在本發(fā)明的一方面，提供一種可分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系，該雜交瘤細胞系代號為PV19-5，已于2012年03月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱為CGMCC)，保藏編號為CGMCC N0.5889，保藏地點:中國，北京。
[0019]在本發(fā)明的另一方面，提供一種可拮抗抑制人VEGF蛋白與其受體(即VEGF-R)結(jié)合的單克隆抗體，由上述保藏編號為CGMCC N0.5889的雜交瘤細胞系分泌產(chǎn)生。
[0020]本文所采用的術(shù)語“單克隆抗體(單抗)”指從一純系細胞得到的免疫球蛋白，具有相同的結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性，對單一抗原決定簇有特異性。單克隆抗體與常規(guī)多克隆抗體制劑(通常是具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的好處還在于它們是通過雜交瘤或重組工程細胞培養(yǎng)獲得，不會混雜有其它免疫球蛋白。修飾語“單克隆”表示了抗體的特性，是從均一的抗體群中獲得的，這不應(yīng)被解釋成需要用任何特殊方法來生產(chǎn)抗體。 [0021]本文所采用的術(shù)語“雜交瘤細胞系”(英文名稱:hybridoma cell line),指從雜交瘤細胞中篩選培養(yǎng)出的細胞系。
[0022]在本發(fā)明的另一方面，提供上述單克隆抗體蛋白的制備方法，包括如下步驟:
[0023]步驟1、制備重組人VEGF蛋白為免疫原，具體為:PCR擴增得到編碼人VEGF的基因片斷，將其克隆到酵母表達載體中，獲得表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化酵母菌，篩選出高效表達工程菌株，工程菌株經(jīng)發(fā)酵、誘導(dǎo)表達、分離純化后，獲得純度達95%以上的VEGF蛋白；
[0024]步驟2、動物免疫:通過反復(fù)多次小劑量的小鼠皮下免疫，獲得分泌高效價的抗人VEGF多克隆抗體；
[0025]步驟3、從中挑取小鼠，取其脾臟細胞，通過體外與小鼠骨髓瘤細胞融合；
[0026]步驟4、酶聯(lián)免疫吸附試驗篩選抗體分泌陽性的雜交瘤細胞；
[0027]步驟5、陽性雜交瘤細胞經(jīng)亞克隆鑒定得到多株穩(wěn)定分泌抗人VEGF抗體的雜交瘤單克隆細胞；經(jīng)再次亞克隆鑒定，篩選得到一株如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞；
[0028]步驟6、將該雜交瘤細胞擴增培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液，采用親合層析法分離純化抗人VEGF單克隆抗體。
[0029]步驟2所述小鼠皮下免疫的方法為:將所述純化的重組VEGF蛋白與弗氏完全佐劑混合，于皮下多點注射小鼠。
[0030]步驟6所述的親合層析法具體為:將含單克隆抗體的雜交瘤細胞擴增后，接種于無血清的1640培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)5天，隨后上清過濾液后上樣至含Protein G-SepharoseFast Flow親合層析；親合層析柱經(jīng)以PBS洗脫去除雜蛋白后，再以pH為2.7的甘氨酸液洗脫被吸附的抗體蛋白；洗脫液以lmol/L Tris (pH 9.0)調(diào)節(jié)pH至7.0,再對10倍的體積的Ix PBS透析12~16后，透析后的樣品再經(jīng)0.45 μ m濾膜過濾后即獲得純化的抗人VEGF單克隆抗體。
[0031 ] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種上述單克隆抗體在檢測VEGF蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明進一步確認了上述單克隆抗體用于檢測體液或病變組織中的VEGF蛋白的表達。例如用該單克隆抗體作為試劑用以體外定量檢測各種體液如血液、血漿、血清、尿、淋巴液或腦脊液中的VEGF的水平，或檢測各種生物材料如細胞培養(yǎng)上清液、組織細胞裂解物中的VEGF的水平；或該單克隆抗體作為試劑用于免疫組化(IHC)等方法來定性或定量檢測各種病變器官組織的VEGF蛋白的表達，或各種疾病下如腫瘤(腫瘤增生早期及擴散期等)、炎癥(如關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼蒼等)患者外周血液中VEGF的水平表達，以作為臨床診斷或輔助診斷的一個標志。
[0032]在本發(fā)明的另一方面，提供一種上述單克隆抗體在制備治療與血管增生有關(guān)疾病的藥物制劑中的應(yīng)用。所述與血管增生有關(guān)疾病包括橫紋肌移植瘤、乳腺腫瘤等。
[0033]本發(fā)明的抗VEGF單克隆抗體及其分泌它的雜交瘤細胞系的用途至少包括但不限于以下范疇:
[0034](I)該抗體作為試劑用于免疫組化方法檢測各種病變器官組織的VEGF蛋白的表達。
[0035](2)該抗體作為試劑用以體外定量測定各種體液(如血液、血漿、血清、尿、淋巴液)或各種生物材料(如細胞培養(yǎng)上清液、組織細胞裂解物)中的VEGF的水平。
[0036](3)利用該抗體`制備免疫親和層析柱，來分離純化VEGF蛋白。
[0037](4)標記的(生物素或熒光如FITC等標記)抗VEGF的單克隆抗體為探針顯影劑，用于免疫熒光實驗或其他顯影方法來定位或定量檢測各種疾病如腫瘤或炎癥患者的組織器官中的VEGF表達水平，以輔助臨床診斷。
[0038](5)該抗體還可作為VEGF的拮抗劑，用于藥理學(xué)研究。
[0039](6)從分泌該抗體的小鼠雜交瘤細胞系中分離純化mRNA，再以RT-PCR等方法從中克隆和擴增出編碼小鼠PV19抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的基因。擴增獲得的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因可用于制備單鏈抗體、Fab片斷、人-鼠嵌合抗體或者人源化抗體等各種基因工程抗體。
[0040](7)該抗體或其衍生體(如單鏈抗體、Fab片斷、人-鼠嵌合抗體、人源化抗體、放射藥物標記抗體、細胞毒性藥物標記抗體、納米材料-抗體復(fù)合體等)作為單獨成分，或與其他治療藥物或治療手段合并使用，用于制備與VEGF高表達有關(guān)的病變(如腫瘤，炎癥等)的治療藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明:
[0042]圖1為本發(fā)明實施例1中以重組人VEGF165蛋白包板，以ELISA法檢測PV19雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清液與重組人VEGF蛋白結(jié)合的實驗結(jié)果示意圖。其中，M23為已知分泌抗人VEGF單抗的雜交瘤細胞上清液，為陽性對照。P16為非相關(guān)雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液，為陰性對照；SP2/0代表未融合的骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清液。
[0043]圖2為本發(fā)明實施例2中以SDS-PAGE分析鑒定從PV19雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清液中經(jīng)親合層析純化獲得的PV19單克隆抗體蛋白的實驗結(jié)果示意圖。圖2中，泳道I為DTT還原的PV19抗體蛋白；泳道2為未還原的PV19抗體蛋白；Marker為蛋白質(zhì)分子量標志。
[0044]圖3為本發(fā)明實施例3中以免疫印跡法(Western blot)分析鑒定小鼠PV19單克隆抗體與還原及未還原的重組人VEGF165蛋白的結(jié)合特性。其中泳道I為未還原的VEGF165蛋白；泳道2為DTT還原的VEGF165蛋白。
[0045]圖4為本發(fā)明實施例4中用競爭性ELISA法檢測單克隆抗體-生物素標記的重組人VEGF165蛋白混合物與固定在96-孔板上的VEGFRl受體蛋白結(jié)合的實驗結(jié)果示意圖。其中mPV19&Biotin-VEGF組代表不同溶度的小鼠PV19單克隆抗體與固定量的生物素標記的重組人VEGF165蛋白混合；W10&Biotin-VEGF組代表不同溶度的非相關(guān)單克隆抗體(代號為W10)與固定量的生物素標記的重組人VEGF165蛋白的混合。
[0046]圖5A為本發(fā)明實施例5中PV19單克隆抗體在裸鼠體內(nèi)抑制人A673橫紋肌瘤生長的實驗結(jié)果示意圖。 [0047]圖5B為本發(fā)明實施例5中PV19單克隆抗體在裸鼠體內(nèi)抑制人A673橫紋肌瘤生長實驗終末時與陰性對照組相比，各治療組平均腫瘤瘤重下降率(瘤重抑制率％)的條形圖。
[0048]圖5C為本發(fā)明實施例5中PV19單克隆抗體在裸鼠體內(nèi)抑制人A673橫紋肌瘤生長實驗終末時測定的各治療組動物重量均值條形圖。
[0049]圖6為本發(fā)明實施例6中PV19單克隆抗體在裸鼠體內(nèi)抑制人MD_MBA_321乳腺腫瘤生長的實驗結(jié)果示意圖。
[0050]圖7為本發(fā)明實施例7中以PV19單克隆抗體為第一抗體，以免疫組化方法檢測人腫瘤組織切片的結(jié)果示意圖，其中圖7A為人結(jié)腸癌組織切片；圖7B為人乳腺癌組織切片。
[0051]代號為PV19-5的小鼠雜交瘤細胞株(來源于小鼠Mus musculus)已于2012年03月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏編號為CGMCCN0.5889 ;保藏地點:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)。
【具體實施方式】
[0052]下面的實施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0053]實施例1:穩(wěn)定分泌抗VEGF單克隆抗體的雜交瘤細胞系的建立與篩選鑒定
[0054]步驟1.重組人VEGF165蛋白(免疫抗原)的制備
[0055]重組人VEGF165蛋白(免疫抗原)的制備(采用申請?zhí)枮?007100473522，發(fā)明名稱為“重組人血管內(nèi)皮細胞生長因子的分離純化、體外化學(xué)標記及其應(yīng)用”的中國發(fā)明專利申請所記載的方法制備):
[0056]利用PCR技術(shù)從人肺組織細胞cDNA文庫中擴增得到編碼人VEGF165完整開放讀碼框架序列(open-reading frame, ORF)的基因片斷,經(jīng)序列測定鑒定正確，用限制性內(nèi)切酶處理后，將其克隆到酵母表達載體pPic9K(Invitrogen公司)載體中。獲得表達質(zhì)粒pPic9K-VEGF165，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌，篩選出高效表達工程菌株。工程菌經(jīng)發(fā)酵、誘導(dǎo)表達，分離純化后，獲得純度95%以上的VEGF165蛋白。[0057]步驟2、動物免疫
[0058]將上述純化的重組人VEGF165蛋白與弗氏完全佐劑混合，于皮下多點注射Balb/c小鼠(100 μ I/只，共IOyg VEGF165蛋白)。首次免疫2-3周后，小鼠再給予皮下多點注射VEGF165蛋白與不完全佐劑混合加強免疫。加強免疫2-3次后，取少量小鼠血清，用包被VEGF165蛋白的96-孔酶標板以ELISA法檢測小鼠血清中抗VEGF蛋白抗體的效價，取效價高者小鼠的脾細胞用于下一步的細胞融合。
[0059]步驟3、細胞融合
[0060]在VEGF165蛋白末次免疫后3天，無菌制備小鼠脾細胞懸液，與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0 (購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細胞保藏中心)，以5:1的比例在50%PEG-1000(Sigma公司產(chǎn)品)作用下融合。融合按常規(guī)法(Kohler G.and Milstein C:Nature1975; 256:495-497), PEG用量lml，I分鐘內(nèi)緩慢加完。反應(yīng)90秒后，以無血清的RPM1-1640培養(yǎng)基終止反應(yīng)，1000rpm離心10min，去除上清液，再將離心沉淀下的細胞以含10%HAT(H為次黃嘌呤、A氨基碟呤、T胸腺嘧啶核苷，為Sigma公司產(chǎn)品)的RPMI 1640_10%FCS培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)節(jié)至lX106/ml，加入96孔平底細胞培養(yǎng)板(每孔200 μ I )，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周。
[0061]步驟4、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)篩選抗體分泌陽性的雜交瘤細胞
[0062]以重組人VEGF165 蛋白(2μ g/ml，pH 9.6,0.1M NaHCO3 液)包被酶標板，37°C包被2小時或4°C過夜；2%牛血清白蛋白(BSA)封閉，4°C過夜。經(jīng)PBS-0.l%Tween20液洗滌后加入待檢雜交瘤細胞培養(yǎng)上清(以未融合的SP2/0小鼠骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清為陰性對照)37°C孵育2小時j5PBS-0.l%Tween20液洗滌后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠18(3丨8111&公司產(chǎn)品)，371:孵育I小時；再經(jīng)PBS-0.l%TWeen20液充分洗滌后，加入鄰苯二胺(OPD)-0.1%H202 底物液顯色 10-15min,以 0.1M HCl 終止反應(yīng)。在 MK3Multiskan 酶標儀(Thermo Scientific公司 產(chǎn)品)中讀取492nm處OD值。測得的OD 492值比陰性對照高5-10倍的雜交瘤細胞再克隆化，并進行擴增凍存。
[0063]步驟5、陽性雜交瘤細胞的克隆化-有限稀釋法
[0064]將上述初篩得到的陽性細胞以RPM1-1640_10%FCS培養(yǎng)基稀釋至每孔1_10個細胞，鋪于96-孔細胞培養(yǎng)板，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2_3周。待克隆長成，取上清液以ELISA再次檢測鑒定抗VEGF抗體的分泌。經(jīng)檢測鑒定，獲得多個抗體分泌陽性細胞株。其中，經(jīng)再次亞克隆鑒定，獲得了一株代號為PV19-5(以下簡稱PV19)的穩(wěn)定分泌抗VEGF單克隆抗體的雜交瘤細胞株。圖1為以ELISA法檢測鑒定PV19雜交瘤細胞上清液與重組VEGF165蛋白結(jié)合，結(jié)果證明該雜交瘤細胞上清液含高效價抗VEGF165蛋白的抗體。該抗體經(jīng)鑒定為IgG類。該雜交瘤細胞株再經(jīng)大量擴增，長期傳代培養(yǎng)并凍存，于2012年03月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏編號為CGMCC No 5889)。
[0065]實施例2.抗VEGF單克隆抗體的體外制備及純化
[0066]本實施例中，抗VEGF單克隆抗體(PV19)的分離純化采用親合層析法。其純化步驟為:將PV19雜交瘤細胞擴增后，接種于200ml無血清的1640培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)5天，隨后上清過濾液后上樣至含Protein G-Sepharose Fast Flow (購自通用電氣公司)親合層析；親合層析柱經(jīng)以PBS洗脫去除雜蛋白后，再以低pH(2.7)甘氨酸(0.1M)液洗脫被吸附的抗體蛋白。洗脫液以lmol/L Tris (pH 9.0)調(diào)節(jié)pH至7.0,再對10倍的體積的Ix PBS透析12~16后(期間換液2-3次)，透析后的樣品再經(jīng)0.45 μ m濾膜過濾后即獲得純化的PV19單克隆抗體。
[0067]將純化的PV19抗體按常規(guī)方法在DTT還原及未還原條件下進行SDSPAGE電泳(分離膠為10%，濃縮膠5%)鑒定分析。圖2為該電泳分析結(jié)果圖譜，其中泳道I為DTT-還原的PV19抗體，泳道2為未還原的PV19抗體。如圖2所示:與未還原的PV19抗體樣品相比后，DTT-還原的PV19抗體分離為2條主帶，其中處于上面的條帶為PV19抗體重鏈，處于下面的條帶為PV19抗體輕鏈。
[0068]實施例3.免疫印跡法(Western blot)分析鑒定PV19單克隆抗體與人VEGF蛋白及其他相關(guān)蛋白的結(jié)合
[0069]圖3為免疫印跡法(Western blot)分析鑒定PV19單克隆抗體與人VEGF165蛋白特異結(jié)合的實驗結(jié)果圖譜。實驗中的VEGF蛋白來源于大腸桿菌表達的重組人VEGF165蛋白(美國R&D System公司產(chǎn)品)。該VEGF165蛋白先溶于PBS-1%BSA液中(50μg/ml)，每道上樣10 μ I進行15%SDS-PAGA電泳，按常規(guī)方法將凝膠蛋白帶轉(zhuǎn)移到PVDF纖維膜上(Millipore公司產(chǎn)品)，用5%脫脂奶粉在4°C封閉過夜，加入由實施例2制備獲得的PV19單抗，室溫反應(yīng) 2 小時，用 TBS-T (pH7.5,0.05mol/l Tris-Hcl, 0.15mol/l NaCl, 0.05%Tween_20)洗滌3次，隨后加入辣根過氧化物酶-(HRP)標記的羊抗小鼠IgG或羊抗兔IgG (Sigma公司產(chǎn)品)，室溫反應(yīng)lh，用TBS-T洗滌三次。最后加DAB-0.1%H202底物液顯色10_15min。結(jié)果如圖3所示，PV19抗體可與未還原的(泳道I)及還原的重組VEGF165蛋白(泳道2)特異結(jié)合；而與泳道中的BSA等其他蛋白無交叉反應(yīng)。
[0070]該免疫印跡實驗結(jié)果證明PV19細胞株產(chǎn)生的單克隆抗體也能與還原及未還原的大腸桿菌表達的重組人VEGF165 蛋白特異結(jié)合。
[0071]在本實施例中，還以免疫印跡法、免疫組織化學(xué)(IHC)、ELISA、dot-blot等方法還檢測分析了 PV19單克隆抗體與不同類型的VEGF蛋白及相關(guān)蛋白的結(jié)合反應(yīng)。檢測結(jié)果小結(jié)如表1。
[0072]表1免疫分析檢測PV19抗體與VEGF及其他相關(guān)蛋白的結(jié)合
[0073]
【權(quán)利要求】
1.一種分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系，該雜交瘤細胞系的保藏編號為CGMCCN0.5889。
2.一種拮抗抑制血管內(nèi)皮細胞生長因子與其受體結(jié)合的單克隆抗體，由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞系分泌產(chǎn)生。
3.—種如權(quán)利要求2所述單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟: 步驟1、制備重組人VEGF蛋白為免疫原，具體為:PCR擴增得到編碼人VEGF的基因片斷，將其克隆到酵母表達載體中，獲得表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化酵母菌，篩選出高效表達工程菌株，工程菌株經(jīng)發(fā)酵、誘導(dǎo)表達、分離純化后，獲得純度達95%以上的VEGF蛋白； 步驟2、動物免疫:通過反復(fù)多次小劑量的小鼠皮下免疫，獲得分泌高效價的抗人VEGF多克隆抗體； 步驟3、從中挑取小鼠，取其脾臟細胞，通過體外與小鼠骨髓瘤細胞融合； 步驟4、酶聯(lián)免疫吸附試驗篩選抗體分泌陽性的雜交瘤細胞； 步驟5、陽性雜交瘤細胞經(jīng)亞克隆鑒定得到多株穩(wěn)定分泌抗人VEGF抗體的雜交瘤單克隆細胞；經(jīng)再次亞克隆鑒定，篩選得到一株如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞； 步驟6、將該雜交瘤細胞擴增培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液，采用親合層析法分離純化抗人VEGF單克隆抗體。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟2所述小鼠皮下免疫的方法為:將所述純化的重組VEGF蛋白與弗氏完全佐劑混合，于皮下多點注射小鼠。
5.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟6所述的親合層析法具體為:將含單克隆抗體的雜交瘤細胞擴增后，接種于無血清的1640培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)5天，隨后上清過濾液后上樣至含Protein G-Sepharose Fast Flow親合層析；親合層析柱經(jīng)以PBS洗脫去除雜蛋白后，再以pH為2.7的甘氨酸液洗脫被吸附的抗體蛋白；洗脫液以lmol/LTris (pH9.0)調(diào)節(jié)pH至7.0,再對10倍的體積的Ix PBS透析12~16后，透析后的樣品再經(jīng)0.45 μ m濾膜過濾后即獲得純化的抗人VEGF單克隆抗體。
6.權(quán)利要求2所述的抗體在檢測VEGF蛋白的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2所述的抗體在制備治療與血管增生有關(guān)疾病的藥物制劑中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述與血管增生有關(guān)疾病包括橫紋肌移植瘤、乳腺腫瘤。
【文檔編號】C12R1/91GK103865878SQ201210540692
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月14日
【發(fā)明者】胡紅群, 羅師平, 孫亞男, 宋曉琦, 蔡明文, 徐一清, 周群敏 申請人:蘇州思坦維生物技術(shù)有限責任公司