專利名稱：一種運(yùn)用間接免疫熒光檢測技術(shù)進(jìn)行病毒敏感細(xì)胞克隆中篩選的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體的講是一種運(yùn)用間接免疫熒光檢測技術(shù)進(jìn)行病毒敏感細(xì)胞克隆株篩選的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上，對(duì)于敏感細(xì)胞株的篩選是通過測定病毒毒價(jià)的方式實(shí)現(xiàn)的。然而，對(duì)于非致病變性的病毒，毒價(jià)的測定只能利用動(dòng)物或其他方法進(jìn)行，例如豬瘟兔化弱毒效價(jià)的測定。此種方法，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作復(fù)雜，周期長，成本高，篩選效率低下。發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)以上不足，本發(fā)明提供了一種簡便、快捷的敏感細(xì)胞株的篩選方法，具體的說，通過間接免疫熒光(IFA)方法進(jìn)行細(xì)胞系純凈性的鑒定和不同單克隆細(xì)胞株敏感性鑒定，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的病毒毒價(jià)的測定方法，以達(dá)到快速、簡便、有效篩選單克隆細(xì)胞株的目的。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種運(yùn)用間接免疫熒光檢測技術(shù)進(jìn)行病毒敏感細(xì)胞克隆株篩選的方法，包括以下步驟(1)細(xì)胞系純凈性的鑒定細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)用方瓶培養(yǎng)從液氮中復(fù)蘇的細(xì)胞，培養(yǎng)條件包括pH7. O 7. 3，溫度 36 37°C，培養(yǎng)基為細(xì)胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)時(shí)間48 96h，細(xì)胞單層長至90% 100%，細(xì)胞密度在 3 6X 105cells/mL ； 細(xì)胞傳代培養(yǎng)將上述步驟中長滿單層的細(xì)胞用EDTA-胰酶消化分散，獲得細(xì)胞懸液， 按照1:3的比例分傳至方瓶；細(xì)胞接毒將_80°C保存的病毒抗原液4 8°C水中融化，取適量病毒液加入上述傳代細(xì)胞懸液中，并保證病毒終濃度在100TCID5(l/mL 1000TCID5(l/mL，混勻，置溫箱培養(yǎng)72 96h ；細(xì)胞帶毒傳代、鋪96孔細(xì)胞板將長滿單層的帶毒細(xì)胞用EDTA-胰酶消化分散，獲得細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取適量細(xì)胞懸液，按照有限稀釋法鋪96孔板，以獲得單克隆細(xì)胞，溫箱培養(yǎng)，直至單克隆細(xì)胞形成細(xì)胞島；細(xì)胞系純凈性的判定按照間接免疫熒光法，對(duì)上述孔板進(jìn)行IFA染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，通過IFA熒光和單克隆細(xì)胞島細(xì)胞形態(tài)觀察，判斷細(xì)胞系純凈性；細(xì)胞形態(tài)不同，單克隆株細(xì)胞感染熒光不同即具有不同的單克隆株，表明細(xì)胞系不純凈；(2)細(xì)胞系中單克隆細(xì)胞株的獲得復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇代次靠前的細(xì)胞，在3代內(nèi)調(diào)整細(xì)胞至狀態(tài)最佳；分散細(xì)胞待細(xì)胞長至90%時(shí)，用EDTA-胰酶消化分散，鏡下觀察細(xì)胞多數(shù)呈單個(gè)分散狀態(tài)；終點(diǎn)稀釋細(xì)胞取IOuL消化好的細(xì)胞入含ImL 10%血清的培養(yǎng)基的指形管內(nèi)，分散均勻后，依次10倍倍比稀釋，吸取10_4至10_5稀釋度的細(xì)胞懸液150uL入96孔板，觀察各梯度內(nèi)的細(xì)胞個(gè)數(shù)，并以一個(gè)細(xì)胞的稀釋度為基準(zhǔn)稀釋細(xì)胞，鋪入96孔板中，150uL/孔；
觀察記錄3天后，觀察板內(nèi)單個(gè)克隆的細(xì)胞島，作好標(biāo)記；
維持細(xì)胞生長及時(shí)更換細(xì)胞培養(yǎng)液，維持細(xì)胞生長，必要時(shí)將細(xì)胞克隆消化分散，重新在原孔貼附生長；
擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞待上述96孔板內(nèi)標(biāo)記的細(xì)胞孔長滿后，擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存保種；
(3)單克隆細(xì)胞株對(duì)病毒敏感性的鑒定
單克隆細(xì)胞株的接毒待細(xì)胞長至單層，將不同的單克隆細(xì)胞株用EDTA-胰酶消化分 散，獲得細(xì)胞懸液，按1:2比例分傳，鋪96孔板，每個(gè)細(xì)胞株鋪3 6個(gè)孔，IOOuL/孔，將預(yù)冷、無血清細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋好的病毒同步接上述96孔板細(xì)胞懸液中，IOOuL/孔，病毒接種劑量為10 100TCID5Q/mL，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，將細(xì)胞板置溫箱培養(yǎng)36 60h ；單克隆細(xì)胞株的敏感性鑒定將上述單克隆細(xì)胞株的接毒步驟中的96孔板取出，按照間接免疫熒光法進(jìn)行IFA染色，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)熒光斑數(shù)目，并利用SPSS軟件對(duì)不同克隆細(xì)胞株及正常細(xì)胞系熒光斑數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，判斷細(xì)胞敏感性差異。上述間接免疫熒光法的具體步驟為
a、將細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，棄去培養(yǎng)板孔內(nèi)液體，用O.lmol/L、PH7. 2的PBS洗滌3次，每次2 3min，并甩干；
b、加入_20°C預(yù)冷的甲醇100uL，4°C固定20 30min ；
C、棄去甲醇,室溫自然揮干5min, PBS洗漆3次,每次2 3min,并甩干；
d、加入第一抗體,37°C吸附50min;
e、棄去第一抗體,用PBS漆3次,每次2 3min,并甩干； f>加入第二抗體，37 吸附40min ;
g、棄去第二抗體，PBS漆3次,每次2 3min；
h、置于熒光顯微鏡下觀察熒光情況，觀察熒光染色情況。上述PBS 的濃度為 O. lmol/L、PH 為 7. 2。上述步驟(3)中陰性對(duì)照為不接毒正常未純化的細(xì)胞系。上述步驟(3)中陽性對(duì)照為接毒正常未純化的細(xì)胞系。上述步驟(3)中將細(xì)胞板置溫箱培養(yǎng)45h。上述第一抗體為PBS稀釋的豬瘟陽性血清。上述第二抗體為PBS稀釋的FITC標(biāo)記兔抗豬IgG。本發(fā)明的有益效果是1.本方法檢測時(shí)間短，只需3天即可對(duì)單細(xì)胞克隆對(duì)病毒敏感性進(jìn)行鑒定。2.操作相對(duì)簡單，方法易行，可用于非致病型病毒敏感細(xì)胞株的大量篩選。3.結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)，與測定毒價(jià)方法效果一致。


圖1為對(duì)克隆A、B、C檢測結(jié)果以及對(duì)照試驗(yàn)；
圖2為對(duì)克隆D、E、F、G檢測結(jié)果。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，以便本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更好的了解本發(fā)明，但并不因此限制本發(fā)明。
(I)細(xì)胞系純凈性的鑒定ST細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)用方瓶培養(yǎng)從液氮中復(fù)蘇的ST細(xì)胞，培養(yǎng)條件包括pH7. 2，溫度 370C，培養(yǎng)基為含有8%豬瘟專用血清的MEM ;培養(yǎng)時(shí)間72h，細(xì)胞單層長至100% ；ST細(xì)胞傳代培養(yǎng)將長滿單層的ST細(xì)胞用EDTA-胰酶消化分散，獲得細(xì)胞懸液，按照 1:3的培養(yǎng)面積比例分傳至方瓶；細(xì)胞接毒將-80°C保存的豬瘟兔化弱毒(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保藏，保藏號(hào)AV1412) 細(xì)胞毒(毒價(jià)為103_°TCID5(i/0. 11^)4 81水中融，取500此病毒液，加入到上述方瓶傳代細(xì)胞懸液(IOmL)中，病毒終濃度為500TCID5(l/mL，混勻，置溫箱培養(yǎng)72h。
ST細(xì)胞帶毒傳代、鋪96孔細(xì)胞板將長滿單層的帶毒ST細(xì)胞用EDTA-胰酶消化分散，獲 得細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取適量細(xì)胞懸液，按照有限稀釋法鋪96孔板，以獲得單克隆細(xì)胞，溫箱培養(yǎng)，直至單克隆細(xì)胞形成細(xì)胞島。
細(xì)胞系純凈性的判定按照間接免疫熒光法，對(duì)上述孔板進(jìn)行IFA染色，分別在熒光顯微鏡和普通顯微鏡下觀察結(jié)果，通過IFA熒光和單克隆細(xì)胞島細(xì)胞形態(tài)觀察，判斷細(xì)胞系純凈性。細(xì)胞形態(tài)不同，單克隆株細(xì)胞感染熒光不同即表明細(xì)胞系不純凈。
ST細(xì)胞系純凈性鑒定結(jié)果將ST細(xì)胞接豬瘟兔化弱毒，并帶毒傳至96孔板，培養(yǎng)72h，進(jìn)行IFA染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， ST細(xì)胞不同單克隆細(xì)胞形成的單克隆島熒光染色效果不同，呈現(xiàn)不同的熒光亮度，表明該 ST細(xì)胞系種存在對(duì)豬瘟病毒敏感性不同的克隆株。結(jié)果如圖1所示，克隆A、B為豬瘟敏感型細(xì)胞株，而克隆C則不敏感。
表I ST單克隆細(xì)胞IFA染色熒光斑數(shù)目結(jié)果及比較 實(shí)驗(yàn)順序細(xì)胞株名稱熒光斑數(shù)目熒光斑平均數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較(P)
權(quán)利要求
1.一種運(yùn)用間接免疫熒光檢測技術(shù)進(jìn)行病毒敏感細(xì)胞克隆株篩選的方法，包括以下步驟(1)細(xì)胞系純凈性的鑒定細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)用方瓶培養(yǎng)從液氮中復(fù)蘇的細(xì)胞，培養(yǎng)條件包括pH7. O 7. 3，溫度 36 37°C，培養(yǎng)基為細(xì)胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)時(shí)間48 96h，細(xì)胞單層長至90% 100%，細(xì)胞密度在 3 6X 105cells/mL ；細(xì)胞傳代培養(yǎng)將上述步驟中長滿單層的細(xì)胞用EDTA-胰酶消化分散，獲得細(xì)胞懸液， 按照1:3的比例分傳至方瓶；細(xì)胞接毒將_80°C保存的病毒抗原液4 8°C水中融化，取適量病毒液加入上述傳代細(xì)胞懸液中，并保證病毒終濃度在100TCID5(l/mL 1000TCID5(l/mL，混勻，置溫箱培養(yǎng)72 96h ；細(xì)胞帶毒傳代、鋪96孔細(xì)胞板將長滿單層的帶毒細(xì)胞用EDTA-胰酶消化分散，獲得細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取適量細(xì)胞懸液，按照有限稀釋法鋪96孔板，以獲得單克隆細(xì)胞，溫箱培養(yǎng)，直至單克隆細(xì)胞形成細(xì)胞島；細(xì)胞系純凈性的判定按照間接免疫熒光法，對(duì)上述孔板進(jìn)行IFA染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，通過IFA熒光和單克隆細(xì)胞島細(xì)胞形態(tài)觀察，判斷細(xì)胞系純凈性；(2)細(xì)胞系中單克隆細(xì)胞株的獲得復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇代次靠前的細(xì)胞，在3代內(nèi)調(diào)整細(xì)胞至狀態(tài)最佳；分散細(xì)胞待細(xì)胞長至90%時(shí)，用EDTA-胰酶消化分散，鏡下觀察細(xì)胞多數(shù)呈單個(gè)分散狀態(tài)；終點(diǎn)稀釋細(xì)胞取IOuL消化好的細(xì)胞入含ImL 10%血清的培養(yǎng)基的指形管內(nèi)，分散均勻后，依次10倍倍比稀釋，吸取10_4至10_5稀釋度的細(xì)胞懸液150uL入96孔板，觀察各梯度內(nèi)的細(xì)胞個(gè)數(shù)，并以一個(gè)細(xì)胞的稀釋度為基準(zhǔn)稀釋細(xì)胞，鋪入96孔板中，150uL/孔；觀察記錄3天后，觀察板內(nèi)單個(gè)細(xì)胞島的克隆，作好標(biāo)記；維持細(xì)胞生長及時(shí)更換細(xì)胞培養(yǎng)液，維持細(xì)胞生長，必要時(shí)將細(xì)胞克隆消化分散，重新在原孔貼附生長；擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞待上述96孔板內(nèi)標(biāo)記的細(xì)胞孔長滿后，擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存保種；(3)單克隆細(xì)胞株對(duì)病毒敏感性的鑒定單克隆細(xì)胞株的接毒待細(xì)胞長至單層，將不同的單克隆細(xì)胞株用EDTA-胰酶消化分散，獲得細(xì)胞懸液，按1:2比例分傳，鋪96孔板，每個(gè)細(xì)胞株鋪3 6個(gè)孔，IOOuL/孔，將預(yù)冷、無血清細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋好的病毒同步接上述96孔板細(xì)胞懸液中，IOOuL/孔，病毒接種劑量為10 100TCID5Q/mL，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，將細(xì)胞板置溫箱培養(yǎng)36 60h ； 單克隆細(xì)胞株的敏感性鑒定將上述單克隆細(xì)胞株的接毒步驟中的96孔板取出，按照間接免疫熒光法進(jìn)行IFA染色，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)熒光斑數(shù)目，并利用SPSS軟件對(duì)不同克隆細(xì)胞株及正常細(xì)胞系熒光斑數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，判斷細(xì)胞敏感性差異。
2.根據(jù)權(quán)利要求所述的一種運(yùn)用間接免疫熒光檢測技術(shù)進(jìn)行病毒敏感細(xì)胞克隆株篩選的方法，其特征在于所述間接免疫熒光法的具體步驟為a、將細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，棄去培養(yǎng)板孔內(nèi)液體，用O. lmol/L、PH7. 2的PBS洗滌3次，每次2 3min，并甩干；b、加入_20°C預(yù)冷的甲醇100 uL，4°C固定20 30min ； C、棄去甲醇,室溫自然揮干5min, PBS洗漆3次,每次2 3min,并甩干； d、加入第一抗體,37°C吸附50min； e、棄去第一抗體,用PBS漆3次,每次2 3min,并甩干； f、加入第二抗體,37 吸附40min； g、棄去第二抗體，PBS漆3次,每次2 3min； h、置于熒光顯微鏡下觀察熒光情況，觀察熒光染色情況。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種運(yùn)用間接免疫熒光檢測技術(shù)進(jìn)行病毒敏感細(xì)胞克隆株篩選的方法，其特征在于所述PBS的濃度為O. lmol/L、PH為7. 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用間接免疫熒光檢測技術(shù)進(jìn)行病毒敏感細(xì)胞克隆株篩選的方法，其特征在于所述步驟(3)中陰性對(duì)照為不接毒正常未純化的細(xì)胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用間接免疫熒光檢測技術(shù)進(jìn)行病毒敏感細(xì)胞克隆株篩選的方法，其特征在于所述步驟(3)中陽性對(duì)照為接毒正常未純化的細(xì)胞系。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用間接免疫熒光檢測技術(shù)進(jìn)行病毒敏感細(xì)胞克隆株篩選的方法，其特征在于所述步驟(3)中將細(xì)胞板置溫箱培養(yǎng)45h。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種運(yùn)用間接免疫熒光檢測技術(shù)進(jìn)行病毒敏感細(xì)胞克隆株篩選的方法，其特征在于所述第一抗體為PBS稀釋的豬瘟陽性血清。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種運(yùn)用間接免疫熒光檢測技術(shù)進(jìn)行病毒敏感細(xì)胞克隆株篩選的方法，其特征在于所述第二抗體為PBS稀釋的FITC標(biāo)記兔抗豬IgG。
全文摘要
發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體的講是一種運(yùn)用間接免疫熒光檢測技術(shù)進(jìn)行病毒敏感細(xì)胞克隆株篩選的方法，包括以下步驟細(xì)胞系純凈性的鑒定；細(xì)胞系中單克隆細(xì)胞株的獲得；單克隆細(xì)胞株對(duì)病毒敏感性的鑒定，本發(fā)明的有益效果是本方法檢測時(shí)間短，只需3天即可對(duì)單細(xì)胞克隆對(duì)病毒敏感性進(jìn)行鑒定；.操作相對(duì)簡單，方法易行，可用于非致細(xì)胞病變型病毒敏感細(xì)胞株的大量篩選；結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)，與測定毒價(jià)方法效果一致。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102994445SQ20121054198
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者牛成明, 何洪波, 陳申秒 申請(qǐng)人:山東濱州沃華生物工程有限公司