專利名稱：人肺泡ii型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞的體外培養(yǎng)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種人肺泡II型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
肺泡II 型上皮細(xì)胞(alveolar epithelial type II cells, ATII)作為一種組織干細(xì)胞，具有十分重要的功能，主要包括5個(gè)方面①作為滲透性屏障阻止組織間隙的大分子物質(zhì)流入肺泡腔；②具有一定組織干細(xì)胞功能，在肺損傷修復(fù)過(guò)程中，除可以自身增殖夕卜，還可分化成為肺泡I型上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞；③能分泌肺泡表面活性物質(zhì)能分泌抗炎、抗菌物質(zhì)，在免疫方面起作重要作用；⑤能進(jìn)行跨上皮細(xì)胞的鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)，有助于肺泡液體的清除。可見對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)研究是十分必要的。自Dobbs等首次報(bào)道對(duì)成年大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞提取方法以來(lái)，有許多學(xué)者進(jìn)行了這方面的研究，使得該分離培養(yǎng)技術(shù)也更加的完善，但體外培養(yǎng)的ATII細(xì)胞很快失去表達(dá)表面活性質(zhì)的情況仍然存在，并很快會(huì)分化為I型肺泡上皮細(xì)胞。盡管分離培養(yǎng)大鼠和人ATII細(xì)胞的方法，在十九世紀(jì)八十年代已有報(bào)道，且在后來(lái)的培養(yǎng)方法中也有所完善，然而在維持ATII細(xì)胞表型方面仍存在明顯不足，如體外培養(yǎng)的ATII細(xì)胞很快失去表面活性物質(zhì)表達(dá)特性。而肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549又不具有分化為肺泡I型上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的潛能，失去了 ATII細(xì)胞的絕大部分特征。同時(shí)也有研究表明人和動(dòng)物的ATII細(xì)胞的生物學(xué)特性是有差異的，如不同物種間水通道蛋白(AQPs)表達(dá)不同?，F(xiàn)有的人肺泡II型上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法是取適量手術(shù)后肺組織，剪碎成約Imm3大小后，進(jìn)入消化過(guò)濾步驟，然后進(jìn)行差速貼壁培養(yǎng)，密度梯度離心及磁珠分選純化獲得人肺泡II型上皮細(xì)胞?，F(xiàn)有的方法中，消化步驟采用的胰酶和彈性蛋白酶濃度過(guò)高，對(duì)ATII細(xì)胞損傷較大，而且成本較高昂。差速貼壁的時(shí)間較短，為1. 5h，還包括應(yīng)用磁珠分選去除成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的步 驟，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，至少需要12h工作；提取肺泡II型細(xì)胞的肺組織量仍較多，未予以充分利用；實(shí)驗(yàn)花費(fèi)成本高昂。由此可見，人的肺組織作為提取ATII細(xì)胞的組織來(lái)源，一方面組織來(lái)源有限，另一方面體外培養(yǎng)表型維持時(shí)間較短，這極大地限制了 ATII細(xì)胞的體外培養(yǎng)，以至于國(guó)內(nèi)尚未見這方面研究的報(bào)道。因此，為了研究人的ATII細(xì)胞的功能，分離純化、體外培養(yǎng)人ATII細(xì)胞是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，本發(fā)明提供了一種新的肺泡II型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。一種人肺泡II型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟(I)將手術(shù)切除邊緣肺組織剪碎，BSS洗漆，經(jīng)細(xì)胞篩過(guò)濾，留取篩網(wǎng)上組織；(2)加入25-35ml組織消化液，36_38°C消化35_55min，在后10-20分鐘加入l_2ml濃度為104U/mL的Dnase I ;每L所述組織消化液的組成為濃度為105U/mL的胰酶2_3ml，濃度為44. 5mg protein/mL的彈性蛋白酶200_500ul ；(3)加入與組織消化液相等體積的抑制液終止消化，滴管吹打，得到細(xì)胞懸液；力口入BSS稀釋細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞篩過(guò)濾，收取濾液，離心收集細(xì)胞；每L所述抑制液的組成為DMEM/F-1230-60ml，F(xiàn)BS10-20ml、濃度為 104U/ml 的 DNase Il_2ml ；(4)采用36-38°C預(yù)熱的粘附培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于36_38°C、3_5% CO2、相對(duì)溫度90-95%的環(huán)境下培養(yǎng)2-3h，輕柔收取未貼壁的細(xì)胞再次差速貼壁2-3h ;每L所述粘附培養(yǎng)基的組成為DMEM/F-1222. 5_45ml、SAGM22. 5-45ml、FBS5_10ml、濃度為 104U/ml 的 DNaseIl-2ml ；(5)離心收集未貼壁細(xì)胞，用DMEM/F-12重懸細(xì)胞，并吹打均勻，緩慢加入輕、重分離液的頂部，密度梯度離心；所述輕、重分離液的體積比為1:1 ;所述輕、重分離液的密度分別為1. 040g/ml 和1. 089g/ml ；(6)滴管吸出輕、重分離液界面處的細(xì)胞層，BSS洗滌；Ant1-CD14MicroBeads分選去除巨噬細(xì)胞，得到分選液；(7)離心分選液收集細(xì)胞，用36_38°C預(yù)熱的含I % FBS的SAGM重懸細(xì)胞，吹打均勻后加入SAGM完全培養(yǎng)基中，在36-38 °C、3-5 % CO2、相對(duì)溫度90-95 %的環(huán)境中培養(yǎng)55-75h后換SAGM完全培養(yǎng)基，去除未貼壁細(xì)胞，以后隔天換液一次，直到上層沒有懸浮細(xì)胞，即得人肺泡II型上皮細(xì)胞。在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟( 2)中，每L所述組織消化液的組成為濃度為105U/mL的胰酶2-3ml,濃度為44. 5mg protein/mL的彈性蛋白酶300ul。本發(fā)明采用胰酶加彈性蛋白酶聯(lián)合消化法，一方面減少高濃度胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷，另一方面降低彈性蛋白酶的用量，同時(shí)也可獲得較高的產(chǎn)量。在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(3)中，所述細(xì)胞篩為串聯(lián)的100目、200目和325目細(xì)胞篩。最上面設(shè)置為100目可以過(guò)濾大部分的肺組織。在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(4)中，所述再次差速貼壁的時(shí)間為2. 5h。每L所述粘附培養(yǎng)基的組成為DMEM/F-1222. 5ml、SAGM22. 5ml、FBS5ml、濃度為 104U/ml 的 DNase Ilml0在粘附培養(yǎng)基中加入了 10% FBS，同時(shí)將差速貼壁時(shí)間延長(zhǎng)至2. 5小時(shí)，成功去除了成維細(xì)胞、絕大部分巨噬細(xì)胞和大部分紅細(xì)胞，減少了磁珠分選去除成纖維細(xì)胞的成本。在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(5)中，在4°C下，300g密度梯度離心20min。在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(7)中，在37°C、5% CO2、相對(duì)濕度95%的環(huán)境中培養(yǎng)60h后換液。在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟⑴中，所述細(xì)胞篩為100目。本發(fā)明的人肺泡II型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法在已有方法上作了重要改進(jìn)，以人肺組織作為細(xì)胞提取的組織來(lái)源，采用胰酶加彈性蛋白酶聯(lián)合消化法，一方面減少高濃度胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷，另一方面降低彈性蛋白酶的用量，同時(shí)也可獲得較高的產(chǎn)量。僅應(yīng)用磁珠分選去除巨噬細(xì)胞，但在粘附培養(yǎng)基中加入了 10% FBS，同時(shí)將差速貼壁時(shí)間延長(zhǎng)至
2.5小時(shí)，成功去除了成維細(xì)胞、絕大部分巨噬細(xì)胞和大部分紅細(xì)胞，省去了應(yīng)用磁珠分選去除成纖維細(xì)胞的步驟，可進(jìn)一步降低分離成本。成纖維細(xì)胞的去除是細(xì)胞純化的關(guān)鍵，如果沒能成功去除，在后面的培養(yǎng)過(guò)程中很容易形成優(yōu)勢(shì)細(xì)胞群，導(dǎo)致細(xì)胞分離培養(yǎng)失敗。經(jīng)密度梯度離心，Ant1-CDH磁珠分選以及培養(yǎng)60h之后進(jìn)一步去除上清中未貼壁的細(xì)胞，獲得的細(xì)胞純度在98%左右。本發(fā)明建立了一套分離、培養(yǎng)及鑒定人ATII細(xì)胞的方法，并對(duì)用該方法培養(yǎng)的細(xì)胞的生物學(xué)特性維持情況進(jìn)行了評(píng)估，證實(shí)該培養(yǎng)方法能夠獲得純度很高的人ATII細(xì)胞，并較持久地維持細(xì)胞生特學(xué)特性，從而為進(jìn)一步深入研究肺泡II型上皮細(xì)胞的增殖、分化、液體轉(zhuǎn)運(yùn)、合成分泌及其在肺損傷、修復(fù)等病理生理情況下的功能變化提供了可能。


圖1為采用pro-SP-C免疫熒光染色法在激光共聚焦顯微鏡(200 X)下觀察人肺泡II型上皮細(xì)胞圖；圖2為人肺泡II型上皮細(xì)胞與分子探針LySOTracker Green DND-26共培養(yǎng)后，在激光共聚焦顯微鏡(200X)下的觀察圖；圖3為透射電鏡(4000 X)鑒定人肺泡II型上皮細(xì)胞圖；圖4為倒置相差顯微鏡(100X ；200X)觀察原代培養(yǎng)的人肺泡II型上皮細(xì)胞
圖5為RT-PCR監(jiān)測(cè)人肺泡II型上皮細(xì)胞4種表面活性物質(zhì)表達(dá)情況圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例所使用的主要材料及來(lái)源分別如下手術(shù)切除邊緣肺組織(廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn))；膜酶(威佳)；彈性蛋白酶(44.5mg protein/mL, Worthington) ；DMEM/F-12(1:1, Invitrogen) ； SAGM (Lonza) ；FBS (HyClone) ；DNase I(鼎國(guó))；Percoll(Pharmacia) ;Anti_CD14MicroBeads(Miltenyi)；BSS (2L, NaCl 16. Og, KCL0. 8g, Na2HPO4 · 7H200. 28g, HEPES4. 76g,葡萄糖 2. Og,雙抗100X20ml, PH7. 4)組織消化液(1L，胰酶10萬(wàn)U/ml2_3ml，彈性蛋白酶300ul)；抑制液(1L，DMEM/F-1230ml，F(xiàn)BSlOml，DNaseIlOOOOU/mllml)；粘附培養(yǎng)基(1L，DMEM/F-1222.5ml，SAGM22. 5ml，F(xiàn)BS5ml，DNase IlOOOOU/ml, lml)輕、重分離液(輕1.040g/ml, IL 10XPBS4ml, Percol110. 88ml, ddH2025. 12ml ；重1. 089g/ml, IL 10XPBS4ml, Percol 125. 96ml, ddH2010. 04ml)pro-SP-C(Millipore) ；Cy3AffiniPure Goat ant1-Rabbit IgG(H+L)(EarthOx)；LysoTracker Green DND-26 (Invitrogen) ；TRIzol (Invitrogen)以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1人肺泡II型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法參照rEhhardt等(2005)編寫的方案,具體包括以下步驟(I)將5_8g手術(shù)切除邊緣肺組織在培養(yǎng)皿中剪碎成約Icm3大小，BSS反復(fù)沖洗至澄清；(2)將肺組織剪成0. 6mm大小，轉(zhuǎn)移至IOOml燒杯中，BSS洗滌至少3次，再經(jīng)100目細(xì)胞篩過(guò)濾，留取篩網(wǎng)上組織；(3)將其轉(zhuǎn)移至裝有15ml-20ml BSS的小三角瓶中，加入30_40ml組織消化液37°C消化 45min，在后 15 分鐘加入 DNase I (10000U/ml) lml_2ml ；
(4)加入與組織液體積相等的抑制液終止消化，滴管吹打lOmin，得到細(xì)胞懸液；(5)加入 300ml BSS 稀釋細(xì)胞懸液，經(jīng)串聯(lián)的 100 目(150μπι)、200 目(75 μ m), 325目(40 μ m)細(xì)胞篩過(guò)濾，IOOml燒杯收取濾液；(6)將濾液轉(zhuǎn)移至6個(gè)50ml離心管中，離心(300g，IOmin)收集細(xì)胞；(7)每個(gè)離心管中各采用lml37°C預(yù)熱的粘附培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)入兩個(gè)IOOmm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37°C、5% CO2、相對(duì)溫度95 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2. 5h，輕柔收取未貼壁的細(xì)胞再次差速貼壁2. 5h ；(8)離心收集未貼壁細(xì)胞(300g，lOmin)，用6ml DMEM/F-12 (無(wú)血清)重懸細(xì)胞團(tuán)，并吹打均勻，沿離心管壁緩慢加入兩支裝有輕重分離液的離心管(15ml)頂部，每個(gè)離心管加入3ml，梯度離心(300g，4°C，20min，提前關(guān)閉電源(由于離心機(jī)在到達(dá)離心時(shí)間需要結(jié)束離心時(shí)候會(huì)有個(gè)剎車(brake)的步驟以達(dá)到較快停止離心程序，如果不提前關(guān)閉電源剎車步驟可能會(huì)打亂輕重分離液的界面，故提前關(guān)閉電源的目的是防止離心機(jī)結(jié)束時(shí)的制動(dòng)力打亂輕重分離液的界面，提高分離的肺泡II型細(xì)胞的純度)；(9)滴管吸出輕重分離液界面處的肺泡II型細(xì)胞層，并加入裝有13ml BSS的離心管(15ml)中洗細(xì)胞兩次；(10)磁珠分選用Ant1-Q)14MicroBeads按操作說(shuō)明分選去除巨卩遼細(xì)胞,得到分選液； (11)將分選液收集于I個(gè)15ml離心管中，離心(300g，IOmin)收集細(xì)胞，用37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基(SAGM+1 % FBS) 2ml重懸細(xì)胞，并吹打均勻后加入1_2個(gè)裝有3ml SAGM完全培養(yǎng)基(LONZA公司的SAGM培養(yǎng)基(LOT number :CC_3118))的細(xì)胞培養(yǎng)皿(60mm)中，在37°C,5% CO2、相對(duì)濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60h后換完全培養(yǎng)基，去除未貼壁細(xì)胞，以后隔天換液一次，直到上層沒有懸浮細(xì)胞，即得肺泡II型上皮細(xì)胞。實(shí)施例2實(shí)施例1的肺泡II型上皮細(xì)胞的細(xì)胞鑒定及純度與活力評(píng)估1、細(xì)胞鑒定①pro-SP-C免疫熒光染色鑒定SP-C是肺泡11型上皮細(xì)胞特異表達(dá)的肺泡表面活性蛋白，而其他3種表面活性蛋白SP-A、SP-B、SP-D在其它細(xì)胞中也有表達(dá)，故選用表面活性蛋白中的SP-C才能用來(lái)鑒定ATII細(xì)胞。主要參照Peter F等的方法,待ATII細(xì)胞在coverslips上爬片達(dá)理想密度,轉(zhuǎn)A 24孔板中，4%多聚甲醒固定樣本IOmin ；PBS洗5min, 0.1 % Triton X-100處理IOmin,增加細(xì)胞膜的通透性；山羊血清封閉Ih ;孵育一抗(pro-SP-C用含0. 1% Triton X-100的I3BSl 1000稀釋)稀釋，4°C過(guò)夜；另外用PBS代替一抗作陰性對(duì)照；PBS洗3遍，每次IOmin,孵育二抗(Cy3Aff iniPure Goat ant1-Rabbi11gG (H+L))(用含 0.1 % Triton X-100的PBSl 200稀釋)4°C過(guò)夜或37°C避光Ih ;PBS洗3次，lOmin/次?？勾銣鐒┓馄?。-20°C避光保存，直到激光共聚焦顯微鏡觀察成像。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色可見pro-SP-C經(jīng)Cy3連接的二抗顯色后，呈紅色顆粒狀分布于胞漿中(見圖1. pro-SP-C);同時(shí)在DIC(微分干涉相差顯微鏡)模式下觀察細(xì)胞的形態(tài)(見圖LDIOo②LysoTracker Green DND-26 探針染色鑒定
板層小體是ATII細(xì)胞特有的結(jié)構(gòu)，LysoTracker Green DND-26是一種對(duì)ATII細(xì)胞中板層小體特異性著色的熒光染料，能夠自由滲透進(jìn)入活細(xì)胞，并在板層小體中聚集。采用它針對(duì)板層小體進(jìn)行特異性的染色來(lái)鑒定該細(xì)胞，并運(yùn)用它們來(lái)評(píng)估細(xì)胞的純度。純化后的細(xì)胞在24孔板上爬片達(dá)理想密度，轉(zhuǎn)入中，將原培養(yǎng)基(即完全培養(yǎng)基)換成37°C預(yù)溫的含LysoTracker Green DND-26(150nmol/L)的熒光探針培養(yǎng)基(即含熒光探針的完全培養(yǎng)基)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后，用預(yù)溫至25°C的BSS清洗3次。加入DAPI (4'，6- 二脒基-2-苯基吲哚)室溫3min-5min染核；用25°C的BSS洗滌2-3次，每次3min-5min,換成完全培養(yǎng)基。激光共聚焦顯微鏡下觀察拍片。LysoTracker Green DND-26熒光探針染色可見板層小體呈顆粒狀的綠色熒光，定位于胞漿，細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色(見圖2)。③透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)鑒定電鏡仍然是鑒定ATII細(xì)胞的最可靠的方法，因?yàn)樗梢郧逦庇^地觀察到特征性的板層小體。在IOOmm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的ATII細(xì)胞，長(zhǎng)滿80% 90% (21天)后，用細(xì)胞刮刀將其輕輕刮下，置于1. 5mlEP管中800rpm離心5min ;去除上清,沿壁緩慢加入3%戍二醒固定20min,再次2000rpm離心lOmin。再經(jīng)2%四氧化鋨后固定、丙酮梯度脫水、環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片、鋨酸染色后在透射電鏡(飛利浦CM-10)下，80KV觀察拍片。透射電 鏡能夠清晰地觀察到肺胞II型上皮細(xì)胞特有的板層小體結(jié)構(gòu)(呈同心圓、片層狀分布)，同時(shí)也能觀察到與表面活性物質(zhì)分泌有關(guān)的絨毛結(jié)構(gòu)，該方法是鑒定ATII細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)。透射電鏡下見到了呈同心圓排列的板層小體(矩形框所示為部分板層小體所在位置)和微絨毛(箭頭所示)，右側(cè)為對(duì)部分板層小體進(jìn)行2倍放大(見圖3) (η = 3)。2、ATII細(xì)胞純度與活力評(píng)估用pro-SP-C免疫熒光法和Green DND-26熒光分子探針染色法，隨機(jī)多次計(jì)數(shù)五個(gè)不同視野中陽(yáng)性著色細(xì)胞數(shù)評(píng)估細(xì)胞的純度；臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估細(xì)胞的活力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為104/mL.接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180 μ L，培養(yǎng)24h后加0. 4%臺(tái)盼藍(lán)，每孔20 μ L。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在光鏡下計(jì)活細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，拒染的為活細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞的百分比，以判斷細(xì)胞存活狀況。AT II 細(xì)胞產(chǎn)量為 3X IO5 7X IO5/ 克肺組織(n = 25)，pro-SP-C,LySOtrack GreenDND-26染色評(píng)估細(xì)胞純度可達(dá)(97±2) % (η = 15)，評(píng)估結(jié)果的一致性較好。0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估細(xì)胞的活力為(93±2) % (η = 25)。剛分離純化得到的ATII細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，在接種后48h才開始延展，60h能初步判斷出呈圓形或立方形(ATII上皮細(xì)胞形態(tài)特征)，胞漿中可見大量顆粒狀物質(zhì)，且具有呈小島狀生長(zhǎng)的特點(diǎn)(見圖4)。細(xì)胞在培養(yǎng)到5天 6天時(shí)達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，平均傳代周期為7天 10天(η = 25)。按1: 2進(jìn)行傳代，可傳3代 4代(約35天)，第4代時(shí)細(xì)胞活力下降至(60±8)% (η = 25)，逐漸表現(xiàn)為生長(zhǎng)停滯、失培養(yǎng)的狀態(tài)。3、RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中表面活性物質(zhì)表達(dá)細(xì)胞原代培養(yǎng)生物學(xué)特性維持的好壞是決定該方法培養(yǎng)的細(xì)胞是否可用的關(guān)鍵。細(xì)胞生物學(xué)特性的維持取決于細(xì)胞的組織來(lái)源、分離純化方法、培養(yǎng)基及輔助添加的細(xì)胞因子的選擇。目前，有一些研究如何維持ATII細(xì)胞表型報(bào)道，但是其結(jié)果也不理想，這也反映出體外培養(yǎng)的肺泡II型上皮細(xì)胞表達(dá)表面活性質(zhì)的特征容易很快喪失的特點(diǎn)。鑒于此，本實(shí)施例以正常肺組織提取的RNA為對(duì)照、以GAPDH為內(nèi)參，對(duì)實(shí)施例1培養(yǎng)得到的肺泡II型上皮細(xì)胞的表面活性物質(zhì)表達(dá)(SP-A、SP-B、SP-C、SP-D)情況進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。具體方法如下TRIzol試劑收集裂解不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞樣品，并提取細(xì)胞總RNA。經(jīng)紫外分光光度儀(DU-800)測(cè)定計(jì)算其純度和濃度后，取I μ g mRNA按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR037A)操作說(shuō)明配成20 μ L反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后取20 μ L體系，以GAPDH為內(nèi)參，分別以I μ L cDNA模板，分別加入SP-A、SP-B、SP-C、SP-D、GAPDH引物(見表I)、寡核苷酸(dNTP)、Taq酶等進(jìn)行產(chǎn)物擴(kuò)增，反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C 2min，94°C 30s，55°C 30s，72°〇30 40個(gè)循環(huán)，721延伸21^11。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度詳見表I。按收取細(xì)胞時(shí)間先后順序，對(duì)各基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳、掃描成像并分析其表達(dá)的趨勢(shì)。表I人肺泡II型上皮細(xì)胞表面活性物質(zhì)引物設(shè)計(jì)
權(quán)利要求
1.一種人肺泡II型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將手術(shù)切除邊緣肺組織剪碎，BSS洗滌，經(jīng)細(xì)胞篩過(guò)濾，留取篩網(wǎng)上組織； (2)加入25-35ml組織消化液，36_38°C消化35_55min，在后10-20分鐘加入l_2ml濃度為104U/mL的Dnase I ;每L所述組織消化液的組成為濃度為105U/mL的胰酶2_3ml，濃度為 44. 5mg protein/mL 的彈性蛋白酶 200_500ul ； (3)加入與組織消化液相等體積的抑制液終止消化，滴管吹打，得到細(xì)胞懸液；加入BSS稀釋細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞篩過(guò)濾，收取濾液，離心收集細(xì)胞；每L所述抑制液的組成為DMEM/F-1230-60ml，F(xiàn)BS10-20ml、濃度為 104U/ml 的 DNase Il_2ml ； (4)采用36-38°C預(yù)熱的粘附培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于36-38 °C、3-5% CO2、相對(duì)溫度90-95%的環(huán)境下培養(yǎng)2-3h，輕柔收取未貼壁的細(xì)胞再次差速貼壁2-3h ;每L所述粘附培養(yǎng)基的組成為DMEM/F-1222. 5_45ml、SAGM22. 5-45ml、FBS5_10ml、濃度為 104U/ml 的 DNaseIl-2ml ； (5)離心收集未貼壁細(xì)胞，用DMEM/F-12重懸細(xì)胞，并吹打均勻，緩慢加入輕、重分離液的頂部，密度梯度離心；所述輕、重分離液的體積比為1:1 ;所述輕、重分離液的密度分別為1. 040g/ml 和1. 089g/ml ； (6)滴管吸出輕、重分離液界面處的細(xì)胞層，BSS洗滌；Ant1-CD14MiCr0BeadS分選去除巨噬細(xì)胞，得到分選液； (7)離心分選液收集細(xì)胞，用36-38°C預(yù)熱的含1%FBS的SAGM重懸細(xì)胞，吹打均勻后加入SAGM完全培養(yǎng)基中，在36-38 °C、3-5% CO2、相對(duì)溫度90-95%的環(huán)境中培養(yǎng)55_75h后換SAGM完全培養(yǎng)基，去除未貼壁細(xì)胞，以后隔天換液一次，直到上層沒有懸浮細(xì)胞，即得人肺泡II型上皮細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人肺泡II型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中，每L所述組織消化液的組成為濃度為105U/mL的胰酶2-3ml，濃度為44. 5mgprotein/mL的彈性蛋白酶300ul。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人肺泡II型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)中，所述細(xì)胞篩為串聯(lián)的100目、200目和325目細(xì)胞篩。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人肺泡II型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4)中，所述再次差速貼壁的時(shí)間為2.5h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人肺泡II型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4)中，每L所述粘附培養(yǎng)基的組成為DMEM/F-1222.5ml、SAGM22. 5ml、FBS5ml、濃度為104U/ml 的 DNase Ilml0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人肺泡II型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(5)中，在4°C下，300g密度梯度離心20min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人肺泡II型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(7)中，在37°C、5% CO2、相對(duì)濕度95%的環(huán)境中培養(yǎng)60h后換SAGM完全培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的人肺泡II型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(I)中，所述細(xì)胞篩為100目。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人肺泡II型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，采用胰酶聯(lián)合彈性蛋白酶消化分離，經(jīng)過(guò)濾、差速貼壁、密度梯度離心及Anti-CD14磁珠分選純化獲得人肺泡II型上皮細(xì)胞。本發(fā)明建立了一套分離、培養(yǎng)及鑒定人肺泡II型上皮細(xì)胞的方法，并對(duì)用該方法培養(yǎng)的細(xì)胞的生物學(xué)特性維持情況進(jìn)行了評(píng)估，證實(shí)該培養(yǎng)方法能夠獲得純度很高的人肺泡II型上皮細(xì)胞，并較持久地維持細(xì)胞生特學(xué)特性，從而為進(jìn)一步深入研究肺泡II型上皮細(xì)胞的增殖、分化、液體轉(zhuǎn)運(yùn)、合成分泌及其在肺損傷、修復(fù)等病理生理情況下的功能變化提供了可能。
文檔編號(hào)C12N5/074GK103060266SQ20121054448
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者黎毅敏, 毛璞, 傅威, 吳松林, 龐曉青, 張容, 何為群, 劉曉青 申請(qǐng)人:廣州呼吸疾病研究所