專利名稱：食品和飼料中安康魚及其制品實(shí)時(shí)熒光pcr鑒偽方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品質(zhì)量控制領(lǐng)域，具體涉及一種食品和詞料中安康魚及其制品實(shí)時(shí)熒光PCR鑒偽方法、其建立方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國山東遼寧等沿海城市，安康魚資源比較豐富，每年的加工出口量可以達(dá)到10萬噸，出口方向主要是日本、韓國和歐洲。近年，受美國對(duì)中國產(chǎn)品實(shí)施嚴(yán)格檢驗(yàn)的影響，特別是由于我國福建寧德地區(qū)出口美國的安康魚混雜河豚魚導(dǎo)致消費(fèi)者中毒死亡后，我國出口日本的產(chǎn)品又一次遭受壁壘。為了盡量減輕安康魚產(chǎn)品國際貿(mào)易的不良影響，我國各有關(guān)企業(yè)，一方面更加嚴(yán)格的要求對(duì)原料進(jìn)一步加強(qiáng)驗(yàn)收措施，避免有毒魚種混入原料中。另夕卜，對(duì)員工進(jìn)行嚴(yán)格培訓(xùn)，掌握鑒別河豚魚等有毒魚種的方法、技巧，一旦發(fā)現(xiàn)異常立即采取適當(dāng)措施處理并報(bào)告。力求避免國外采取更加嚴(yán)厲的措施，對(duì)貿(mào)易造成更加不利的影響。由此，急需安康魚類品種鑒定的簡便、快速的方法。目前我國在食品和飼料中安康魚及其制品的鑒偽方法仍是個(gè)空白，關(guān)鍵在于保證方法穩(wěn)定性、特異性等方面存在很多困難,這也是制約方法建立的瓶頸。為開展食品質(zhì)量控制，為使分析測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、保證數(shù)據(jù)的質(zhì)量，熒光PCR法是一個(gè)簡便、有效的方法，具有切實(shí)可行的實(shí)用價(jià)值。但目前國內(nèi)外，尚未有高可信度的食品和飼料中安康魚及其制品的檢測(cè)方法，檢驗(yàn)間的結(jié)果差別較大，這就造成食品和飼料中安康魚及其制品檢驗(yàn)的隨意性和不確定性。但由于人們對(duì)食品的安全衛(wèi)生特別重視，食品衛(wèi)生指標(biāo)尤其是食品和飼料中安康魚及其制品的真?zhèn)舞b定就顯得特別重要。食品和飼料中安康魚及其制品實(shí)時(shí)熒光PCR鑒偽方法，對(duì)于食品貿(mào)易的要求等方面均具有特殊重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述實(shí)際問題，本發(fā)明建立了一種食品和飼料中安康魚及其制品實(shí)時(shí)熒光PCR鑒偽方法，采用TaqMan探針技術(shù)，對(duì)食品中安康魚源性成份進(jìn)行鑒定。該標(biāo)準(zhǔn)的研制成功及推廣應(yīng)用對(duì)提高食品中安康魚源性成份的檢測(cè)效率及靈敏度，降低檢測(cè)成本，檢測(cè)市場(chǎng)上相關(guān)假冒產(chǎn)品，進(jìn)行食品安全監(jiān)測(cè)和提高檢驗(yàn)檢疫技術(shù)具有重要意義。本發(fā)明從以下幾個(gè)方面研究提取樣品DNA，以DNA為模板，分別采用安康魚品種的特異性檢測(cè)引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，直接讀取實(shí)時(shí)熒光PCR的增幅現(xiàn)象，進(jìn)行食品和原料中安康魚及其制品的鑒偽檢測(cè)等，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了特異性和穩(wěn)定性檢測(cè)；本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下本發(fā)明所述的安康魚，俗名蛤蟆魚、老頭魚、結(jié)巴魚、丑婆、海鬼魚等，屬于魚綱，安康目，安康科。體柔軟，無鱗，頭和體的邊緣有許多皮質(zhì)突起。本發(fā)明的一方面在于 公開一種安康魚成分檢測(cè)用引物與探針，其包括以下堿基序列
針對(duì)安康魚線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶I (Cytochrome oxidase subunit I, COI)基因序列設(shè)計(jì)安康魚檢測(cè)用引物與探針。COI基因序列對(duì)應(yīng)Genebank的登陸號(hào)EU660706.1。
權(quán)利要求
1.一種安康魚成分檢測(cè)用引物與探針，其特征在于，包括以下堿基序列 上游引物SEQ ID NO.1 下游引物SEQ ID NO. 2 探針 SEQ ID NO. 3。
2.一種安康魚成分檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求1所述安康魚成分檢測(cè)用引物與探針。
3.一種安康魚及其制品的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒偽方法，其特征在于利用權(quán)利要求1所述的引物與探針，對(duì)樣品DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的安康魚及其制品的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒偽方法，其特征在于所述的實(shí)時(shí)熒光PCR方法如下 ①實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系 反應(yīng)體系總體積為25ii L，其中
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的安康魚及其制品的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒偽方法，其特征在于所述的樣品DNA的制備方法如下 ①稱取300mg已制備好的樣品于2mL離心管中，加入1.5mL CTAB緩沖液和IOyL濃度為20mg/ iiL蛋白酶K,65°C 30min振蕩混勻；12000r/min離心5min,吸取上清液至一新離心管中，加400y L的體積比為24 I的三氯甲烷異戊醇，充分混勻； ②12000r/min離心5min，吸取上清液至一新離心管中，加入0.8倍體積異丙醇，室溫下沉淀I 2h ; ③12000r/min離心lOmin，棄上清液；70%乙醇洗滌一次，晾干；加入50y L TE，溶解DNA沉淀； ④DNA濃度和純度的測(cè)定取步驟③獲得的DNA溶液加水稀釋，至濃度為IOiig/mL 100 ii g/mL，A260/A280 比值在1. 7 1. 9 之間，備用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種安康魚源性成分檢測(cè)用引物與探針、其使用方法及應(yīng)用。該方法針對(duì)安康魚細(xì)胞色素氧化酶I基因，設(shè)計(jì)了檢測(cè)安康魚源性成份用的引物和探針，采用實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)食品及飼料中安康魚成分的定性檢測(cè)。本發(fā)明所研制的食品及飼料中安康魚成分的實(shí)時(shí)熒光PCR法定性檢測(cè)方法、對(duì)提高食品中安康魚源性成份的檢測(cè)效率及靈敏度，降低檢測(cè)成本，檢測(cè)市場(chǎng)上相關(guān)假冒產(chǎn)品，進(jìn)行食品安全監(jiān)測(cè)和提高檢驗(yàn)檢疫技術(shù)具有重要意義。具有廣闊發(fā)展前景。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103031378SQ20121054470
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者曹際娟, 鄭秋月, 徐靜, 于靈 申請(qǐng)人:曹際娟, 鄭秋月, 徐靜, 于靈