專利名稱：一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖酶的培養(yǎng)基及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地涉及一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖酶的培養(yǎng)基及方法。
背景技術(shù)：
海藻糖由兩個葡萄糖殘基通過半縮醛羥基通過糖苷鍵結(jié)合而成，所以它是一
種非常穩(wěn)定的非還原性雙糖。海藻糖酶是一種催化海藻糖水解的酶，在工業(yè)和醫(yī)學(xué)方面有重要作用。海藻糖是雙糖，其比葡萄糖的分子量大，擴散的速度就比葡萄糖慢，因此，在海藻糖通過細(xì)胞膜進入細(xì)胞前，在血淋巴中保持較高的濃度。與葡萄糖相比，相同濃度的海藻糖更利于通過擴散作用分布到昆蟲的所有細(xì)胞中。昆蟲選擇海藻糖而不是葡萄糖還有另外的一個原因是有利于釋放腸道從食物中吸收的葡萄糖。因為葡萄糖從腸道的吸收主要依 靠于被動運輸，如果血淋巴中葡萄糖的水平比較高，就會干擾葡萄糖的吸收。保持血淋巴中較低的葡萄糖濃度，有利于腸壁對葡萄糖的吸收。一旦血淋巴中的葡萄糖在脂肪體中被轉(zhuǎn)變成海藻糖，其他細(xì)胞就可以很快水解海藻糖成為葡萄糖用于氧化分解提供能量。由此可見，昆蟲選擇海藻糖作為其血糖較葡萄糖和蔗糖具有更大的生理優(yōu)勢。扁座殼抱(Aschersoniaplacenta)是子囊菌門(Ascomycota)幾菌綱{Sordaro-mycetes)肉座菌目 Qfypocreales)麥角菌科 ijOlsvicipitscGse)座殼抱屬(Aschersonia')的一個種，主要寄生在粉虱和介殼上，在南亞和東南亞等地方都有分布。扁座殼孢作為蟲生真菌具有安全性好、效費比高、能夠發(fā)揮持續(xù)控制效果種類多，代謝類型復(fù)雜，顯著的流行潛力，容易大量生產(chǎn)等優(yōu)點，而且沒有化學(xué)殺蟲劑的殘留毒害，也不像Bt類農(nóng)藥必須經(jīng)過口腔進入昆蟲的腸道才能夠發(fā)揮作用，是環(huán)境友好型生物農(nóng)藥發(fā)展的理想選擇之一。通過對扁座殼孢發(fā)酵產(chǎn)物的研究具有重要的價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖酶的培養(yǎng)基及方法。本發(fā)明首先提供了一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖酶的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的原料含有可溶性淀粉0.25-2w%，酸水解酪蛋白胨0.25-2 w%，K+ 0. 0002-0. 0016mol/L,VB2O. 005-0. 04 w %，培養(yǎng)基初始 pH=5. 0-6. 5。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基的原料按重量分?jǐn)?shù)計，含有可溶性淀粉0. 25w%,酸水解酪蛋白胨 0. 5 w%, K+ 0. 0004 mol/L, VB2O. 005 w %，培養(yǎng)基初始 pH=5. 5。其次，本發(fā)明還提供了一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖酶的方法，所述方法包含以下步驟
Ca)將扁座殼孢接種種子培養(yǎng)基，制得發(fā)酵種子液；
(b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液接種于所述的培養(yǎng)基中250mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量15mL，于26°C，轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)。所述種子培養(yǎng)基的原料含有200g/L 土豆,葡萄糖20g/L,自然pH。
本發(fā)明采用的座殼孢為扁座殼孢(何學(xué)友等，油茶黑膠粉虱及扁座殼孢對其自然控制作用，中國森林病蟲，2011年7月)。采用本發(fā)明優(yōu)化后的培養(yǎng)基，菌齡7d，發(fā)酵周期3d，發(fā)酵結(jié)果為扁座殼孢生產(chǎn)的海藻糖酶的酶活性在29U/mL以上。本發(fā)明的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖酶的培養(yǎng)基，具有海藻糖酶產(chǎn)率高，海藻糖酶活力高等優(yōu)點。


圖1為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖2為不同碳源對產(chǎn)酶活性的影響；
圖3為不同氮源對產(chǎn)酶活性的影響；
圖4為不同維生素對產(chǎn)酶活性的影響；
圖5為不同金屬離子對產(chǎn)酶活性的影響；
圖6為不同pH對產(chǎn)酶活性的影響。
具體實施例方式本發(fā)明用下列實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于下列實施例。實施例1
單因素實驗確定培養(yǎng)基最優(yōu)成分 (I)種子培養(yǎng)基配制
種子培養(yǎng)基土豆200g,葡萄糖20g,蒸懼水定容至IOOOmL,自然pH,分裝于250mL的三角瓶，每個三角瓶含150mL。1.011\0^，滅菌20111111。(2)發(fā)酵種子的制作將扁座殼孢接種于土豆瓊脂培養(yǎng)基上，于26°C下培養(yǎng)5d，待其產(chǎn)生孢子，即活化；將活化后的菌株用接種針將孢子粉接種至種子培養(yǎng)基上，26°C，轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)24h，即為發(fā)酵液。(3)酶液的制備取步驟(2)中的發(fā)酵液在4°C下，5000 r/min離心，15min，得上清液即為粗酶液，待用。按酶活性測定在波長550nm處測定吸光值。換算成酶活單位U/mL。(4)海藻糖酶酶活測定0. 4mL發(fā)酵上清液加入0. 4mL海藻糖，37°C水浴30min，加A ImL DNS (濃度為0. 025 mol/L，下同)試劑終止反應(yīng)，沸水浴5min后冷卻，定容至5mL，在波長550nm下測其紫外吸光度，計算出產(chǎn)生的葡萄糖的含量。對照組則取0. 4mL發(fā)酵上清液，加入ImL DNS試劑、0. 4mL海藻糖直接沸水浴5min。酶活力(U/g或U/mL)=AXKXVXn/(tXm) (A為樣品的吸光度；K為吸光常數(shù)；V為反應(yīng)試劑的總體積；n為酶液的稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時間；m為酶液質(zhì)量或體積，g或mL)。(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(Sigma) 10. 00mg/L ;吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.1 mL、0. 2 mL、0. 3 mL、0. 4 mL、0. 5 mL、0. 6 mL、0. 7 mL用蒸懼水定容至 10 mL,配成
0.1(T0. 70 mg/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；取不同溶度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 4 mL，加入0. 4 mL蒸餾水和I mLDNS試劑,振蕩,沸水浴加熱5min,冷卻至室溫,用蒸懼水定容至5 mL,于波長550nm下讀取OD值，蒸餾水做空白對照。以吸光值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。(6)不同碳源、氮源、維生素、金屬離子、pH對產(chǎn)海藻糖酶的影響
(a)碳源對酶產(chǎn)量的影響，為了確定不同碳源對扁座殼孢產(chǎn)生海藻糖酶的影響，在含有
Ig/L KC1,1 g/L KH2PO4,0.5 g/LMgS04，5g/L 蛋白胨，5g/L 酵母浸粉，pH6. 0 的培養(yǎng)基中分別添加1%葡萄糖、鹿糖、麥芽糖、果糖、L-阿拉伯糖、L-山梨糖、可溶性淀粉，0.1MPa^菌20min (下同),接入3mL的扁座殼孢菌液,在26°C、160r/min的搖床中培養(yǎng),第3天檢測發(fā)酵液中海藻糖酶活性，以不加碳源的為對照。結(jié)果見圖2。
(b)氮源對產(chǎn)酶的影響，為了確定不同氮源對扁座殼孢產(chǎn)生海藻糖酶的影響，在含有I g/L KC1,1 g/L KH2PO4,0.5 g/LMgS04，10g/L可溶性淀粉，pH6. 0的培養(yǎng)基中分別添加1%酵母浸膏、酵母浸粉、胰蛋白胨、NaN03、(NH4)2HPO4, (NH4)2SO4、酸水解酪蛋白胨、KNO3,滅菌，接入3mL的扁座殼孢菌液，在26°C、160r/min的搖床中培養(yǎng)，第3天檢測發(fā)酵液中海藻糖酶活，不加氮源的為對照。結(jié)果見圖3。(C)維生素對酶產(chǎn)量的影響，為了確定不同維生素對扁座殼孢產(chǎn)生海藻糖酶的影響，在含有 I g/L KC1,1 g/L KH2PO4,0.5 g/LMgS04，5g/L 蛋白胨，5g/L 酵母浸粉，10g/L可溶性淀粉，pH6. 0的培養(yǎng)基中分別添加0. 01% VB1JB2JBpVe，滅菌，接入3mL的扁座殼孢菌液，在26°C、160r/min的搖床中培養(yǎng)，第3天檢測發(fā)酵液中海藻糖酶活性，不加維生素的為對照。結(jié)果見圖4。(d)金屬離子對酶產(chǎn)量的影響，為了確定不同金屬離子對扁座殼孢產(chǎn)生海藻糖酶的影響，在含有5g/L蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L可溶性淀粉，pH6.0的培養(yǎng)基中分別添加 0.05 mol/L NaCl、KCl、BaCl2、CuCl2、MgS04、ZnCl2, FeCl2、CaCl2、MnCl2、FeCl3,接A 3mL的扁座殼孢菌液，在26°C、160r/min的搖床中培養(yǎng)，第3天檢測發(fā)酵液中海藻糖酶的活性，不加金屬離子的為對照。結(jié)果見圖5。(e) pH對產(chǎn)酶的影響，為了確定不同pH對扁座殼孢產(chǎn)生海藻糖酶的影響，在含有
Ig/L KC1,1 g/L KH2PO4,0.5 g/LMgS04，5g/L 蛋白胨，5g/L 酵母浸粉，10g/L 可溶性淀粉的培養(yǎng)基的PH值分別調(diào)節(jié)為5. 0,6. 0,7. 0,8. 0，接入3mL的扁座殼孢菌液，在26°C、160r/min的搖床中培養(yǎng)，第3天檢測發(fā)酵液中海藻糖酶活性。結(jié)果見圖6。結(jié)果1、碳源對產(chǎn)海藻糖酶的影響實驗結(jié)果為了確定不同碳源培養(yǎng)基對扁座殼孢產(chǎn)生海藻糖酶的影響，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，扁座殼孢在以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、L-阿拉伯糖、L-山梨糖、可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基中都能產(chǎn)生海藻糖酶。其中，以可溶性淀粉、L-山梨糖、L-阿拉伯糖為唯一碳源時，扁座殼孢在培養(yǎng)72h時產(chǎn)生的海藻糖酶活力較高。在培養(yǎng)72h時，扁座殼孢以可溶性淀粉為碳源時產(chǎn)生的海藻糖酶的酶活力極顯著高于其他碳源，酶活為16. 50 U/mL，其次是L-山梨糖，第三天酶活為9. 23 U/mL，葡萄糖6. 31 U/mL,L-阿拉伯糖8. 11 U/mL，蔗糖5. 21 U/mL，麥芽糖7. 44 U/mL，果糖3. 00 U/mL，因此，不同碳源對扁座殼孢產(chǎn)生海藻糖酶的影響是不同的，在這些碳源中，可溶性淀粉誘導(dǎo)海藻糖酶的效果最好。
、氮源對產(chǎn)海藻糖酶的影響實驗結(jié)果分別以硝態(tài)氮、銨態(tài)氮以及有機氮為唯一氮源，比較了不同類型氮源對扁座殼孢的影響，如圖3所示。結(jié)果表明，以硝態(tài)氮(NaNO3)作為唯一氮源時，在淀粉培養(yǎng)基中檢測出的海藻糖酶活性很低，而以有機氮(蛋白胨和酵母浸膏)或銨態(tài)氮(NH4)2SO4做為氮源時，海藻糖酶活性很高。在培養(yǎng)第3天時，扁座殼孢在有機氮和銨態(tài)氮培養(yǎng)基中產(chǎn)生的海藻糖酶活力分別為14.05 U/mL和7.88 U/mL，有機氮提升海藻糖酶的活性優(yōu)于無機氮。為了詳細(xì)的了解各種有機氮對扁座殼孢產(chǎn)生海藻糖酶的影響，在淀粉培養(yǎng)基中分別添加了 1%酵母浸膏、酵母浸粉、胰蛋白胨、NaN03、(NH4)2HPO4, (NH4)2S04、酸水解酪蛋白胨、KNO3。第3天檢測海藻糖酶的活性，結(jié)果如圖3，酸水解酪蛋白胨是提高海藻糖酶的最佳氮源。、維生素源對產(chǎn)海藻糖酶的影響實驗結(jié) 果在添加的不同維生素處理中，與對照(CK)相比，維生素VB2最有助于扁座殼孢提高產(chǎn)酶水平(圖4)，酶活達(dá)到14.67 U/mL，添加VB6vVe幾乎對扁座殼孢產(chǎn)生海藻糖酶沒有影響，VB1抑制海藻糖酶的產(chǎn)生。、金屬離子對產(chǎn)海藻糖酶的影響實驗結(jié)果在所添加的不同金屬離子中，添加K+的處理最有助于提高產(chǎn)酶水平，在接種后的第3d就出現(xiàn)產(chǎn)海藻糖酶高峰，其酶活性達(dá)到17. 10U/mL(圖5)，而添加Na+、Mg2+都在第4d出現(xiàn)產(chǎn)酶高峰，但較K+處理的酶活低。據(jù)此，K+是提高扁座殼孢產(chǎn)海藻糖酶的最佳金屬離子。、pH對產(chǎn)海藻糖酶的影響實驗結(jié)果在所調(diào)節(jié)的不同pH中，pH6處理最有助于提高產(chǎn)酶水平，在接種后的第3d就出現(xiàn)產(chǎn)海藻糖酶高峰，其酶活性達(dá)到15. 88U/mL(圖6)，其他pH值不利于提升扁座殼孢酶活力。據(jù)此，pH6是提高扁座殼孢產(chǎn)海藻糖酶的最佳pH。
實施例2
正交實驗確定最優(yōu)發(fā)酵條件 (I)正交實驗確定最佳培養(yǎng)基
在前期單因素實驗的基礎(chǔ)上，分別選取最適合該菌生產(chǎn)海藻糖酶的可溶性淀粉、酸水解酪蛋白胨、K+、VB2、pH值進行5因素4水平的正交實驗設(shè)計以篩選出最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基。不同組合的培養(yǎng)基接種后置于26°C、160r/min的搖床中培養(yǎng)，第2飛天連續(xù)測定其酶活力。為了避免累贅實施例中的培養(yǎng)基配法、粗酶液的制作、酶活測定方法均與實施例1的方法相同。表I扁座殼孢海藻糖酶五因子四水平(45)正交實驗設(shè)計
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表2扁座殼孢海藻糖酶五因子四水平(45)正交實驗設(shè)計實驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的原料含有可溶性淀粉 O. 25-2w%，酸水解酪蛋白胨 O. 25-2 w%, K. O. 0002-0. 0016mol/L, VB2O. 005-0. 04 w %，培養(yǎng)基初始pH=5. 0-6. 5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖酶的培養(yǎng)基，其特征在于， 所述培養(yǎng)基的原料按重量分?jǐn)?shù)計，含有可溶性淀粉O. 25w%,酸水解酪蛋白胨O. 5 w%, K+O.0004 mol/L, VB2O. 005 w %，培養(yǎng)基初始 ρΗ=5· 5。
3.一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步驟Ca)將扁座殼孢接種種子培養(yǎng)基，制得發(fā)酵種子液；(b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液接種于如權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量15mL，于26°C，轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖酶的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基的原料含有200g/L 土豆，葡萄糖20g/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種真菌發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖酶的培養(yǎng)基及方法。所述培養(yǎng)基的原料含有可溶性淀粉0.25-2w%，酸水解酪蛋白胨0.25-2w%，K+0.0002-0.0016mol/L，VB20.005-0.04w%，培養(yǎng)基初始pH=5.0-6.5。該方法通過將發(fā)酵種子液接種于所述培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量15mL，于26℃，轉(zhuǎn)速160r/min下培養(yǎng)。本發(fā)明的發(fā)酵方法具有發(fā)酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖酶的培養(yǎng)基，具有海藻糖酶產(chǎn)率高，海藻糖酶活力高等優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
文檔編號C12R1/645GK103013955SQ201210544750
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者邱君志, 蘇禮超, 李小霞, 涂潔, 宋飛飛, 邱云鋒, 郭慶豐, 何肖云, 毛麗慧, 張偉 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)