專利名稱：用于檢測(cè)感染性眼病致病微生物的試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于感染性眼病致病微生物的快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)感染性眼病致病微生物的試劑盒及檢測(cè)方法，即通過(guò)直接PCR方法檢測(cè)感染性眼病常見致病細(xì)菌、真菌、I型單純皰疹病毒和棘阿米巴原蟲的特異性DNA的試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
感染性眼病是眼部最常見的多發(fā)病，包括角膜炎、結(jié)膜炎和眼內(nèi)炎等，引起眼部病變微生物主要有細(xì)菌、真菌、病毒和棘阿米巴原蟲。角膜炎和眼內(nèi)炎患者一旦診治不及時(shí)就有致盲的危險(xiǎn)，只有早期及時(shí)確診是由哪種病原微生物感染所致，才能更好的指導(dǎo)后續(xù)治療中的合理用藥以及選擇合適的手術(shù)時(shí)機(jī)。因此感染性眼病致病微生物的早期診斷對(duì)防
盲、治盲意義重大。由細(xì)菌感染引起的眼部炎癥是最廣泛的，其致病菌主要有葡萄球菌(表葡萄、金葡萄)、肺炎球菌和銅綠假單胞菌。真菌引起的眼部感染是目前我國(guó)最常見的致盲性眼病之一，調(diào)查發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬、曲霉菌屬和鏈格孢菌屬為最常見的真菌性角膜炎致病菌。引起角膜感染的常見病毒主要是I型單純皰疹病毒。棘阿米巴原蟲也主要引起角膜感染，隨著角膜接觸鏡的佩戴，其發(fā)病率也在上升。目前臨床上對(duì)以上病原微生物引起的眼部感染尚無(wú)快速有效的早期診斷方法。病毒性感染主要依賴于觀察病癥特點(diǎn)及詢問(wèn)有無(wú)反復(fù)發(fā)作史或免疫印記來(lái)進(jìn)行確診，前兩者依賴于主觀性后者則陽(yáng)性率較低。而對(duì)于細(xì)菌、真菌和棘阿米巴原蟲引發(fā)的感染則主要是先行病變組織涂片染色檢查，這種方法雖然較便捷，但是觀察依賴于有豐富經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員。從病變樣本中進(jìn)行病原微生物的培養(yǎng)是明確診斷的最可靠依據(jù)，但是這種培養(yǎng)方法耗時(shí)長(zhǎng)，不能提供早期診斷 結(jié)果，延誤治療；由于患者之前的用藥還可能會(huì)影響培養(yǎng)的陽(yáng)性；而且培養(yǎng)這些病原微生物也需要專業(yè)技術(shù)人員和硬件條件的完善。各種病原標(biāo)本的涂片和培養(yǎng)是目前比較常規(guī)的病原檢測(cè)方法，其缺點(diǎn)是顯而易見的，即鑒定無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化，且培養(yǎng)方法陽(yáng)性率不夠高，并需要較長(zhǎng)時(shí)間。因此臨床上亟需新的有效快速的感染性眼病致病微生物的診斷方法。利用分子生物學(xué)方法診斷病原微生物為眼部感染的快速診斷提供了新的思路。已有研究者將普通PCR的方法應(yīng)用于細(xì)菌、真菌和病毒引起的感染診斷，對(duì)細(xì)菌的16S rRNA、真菌rRNA基因的大、小亞基和病毒種特異性序列進(jìn)行擴(kuò)增和分析，可有效鑒定至種屬。普通PCR方法診斷病原雖然高效特異，但要先對(duì)樣本進(jìn)行模板DNA的提取，這個(gè)過(guò)程本身就會(huì)造成樣本的損失；加上臨床眼科病變樣本量本來(lái)就很少，即使采用高效便捷的試劑盒提取方法，不同病原微生物DNA提取也需要不同的試劑盒。所以考慮到要進(jìn)行DNA提取，那么普通PCR難以適應(yīng)臨床需要。直接PCR方法就可以避開DNA提取的步驟，將臨床樣本直接進(jìn)行各種病原微生物特異性DNA的擴(kuò)增，既大大縮短了檢測(cè)的時(shí)間，又高效特異，而且需要的話還可以進(jìn)一步進(jìn)行種屬鑒定
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)感染性眼病致病微生物的試劑盒及檢測(cè)方法，以便快速、高效、準(zhǔn)確地檢測(cè)引發(fā)感染性眼病的細(xì)菌、真菌、I型單皰病毒和棘阿米巴原蟲，省去臨床病變樣本DNA提取步驟，使得檢測(cè)更加便捷。本發(fā)明的試劑盒包括( I) DNA 擴(kuò)增試劑為2XPCR預(yù)混試劑及相應(yīng)的DNA聚合酶混合液；(2)引物混合液包括有用于細(xì)菌、真菌、I型單皰病毒和棘阿米巴原蟲檢測(cè)的引物對(duì)，其信息如下細(xì)菌正向引物(BPF): AGAGTTTGATCCTGGCTCAG SEQ ID NO:1`
細(xì)菌反向引物(BPR): ATTACCGCGGCTGCTGG SEQ ID NO:2真菌正向引物(FPF): TCCGTAGGTGAACCTGCGG SEQ ID NO:3真菌反向引物(FPR): TCCTCCGCTTATTGATATGC SEQ ID NO:4I 型單皰病毒正向引物(HPF) : GTGCCGTTGTTCCCATTA SEQ ID NO: 5I 型單皰病毒反向引物(HPR) : TTTGTCCTTCTCGTCATCC SEQ ID NO: 6棘阿米巴正向引物(APF): TTAGAGTGTTCAAAGCAGGCAG SEQ ID NO:7棘阿米巴反向引物(APR): TGGTCGGCATCGTTTATG SEQ ID NO:83)滅菌蒸餾水。上述的試劑盒還包括有陽(yáng)性對(duì)照核酸陽(yáng)性對(duì)照核酸分別為含有細(xì)菌、真菌、I型單純皰疹病毒和棘阿米巴正反向引物擴(kuò)增的目的序列的質(zhì)粒，其中細(xì)菌擴(kuò)增的目的片段的序列為SEQ ID N0:9 ;真菌擴(kuò)增的目的片段的序列為SEQ ID NO: 10 ;1型單純皰疹病毒擴(kuò)增的目的片段的序列為SEQ ID NO: 11;棘阿米巴擴(kuò)增的目的片段的序列為SEQ ID N0:12。利用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒對(duì)感染性眼病少量臨床樣本進(jìn)行致病微生物檢測(cè)的方法( I)臨床樣本的處理病變角膜刮片用20 μ L滅菌蒸餾水吹打重懸于小離心管；房水或玻璃體經(jīng)高速離心后吸棄上清，最終收集20 μ L (含沉淀)，然后用移液器吹打均勻；結(jié)膜囊棉拭子用500 μ L滅菌純水吹打數(shù)次后棄拭子，余液同房水處理方法。(2)致病微生物特異性DNA擴(kuò)增體系的配置分別在4個(gè)反應(yīng)管中加入下列組分
DNA擴(kuò)增試劑10,5 μ L 臨床樣木混懸液I 5 μ L 細(xì)菌/真菌/病毒/阿米巴:ιΚ反_引物組合(5 PM);2 μ L 火菌蒸餾水至20 μ L(3)致病微生物特異性DNA擴(kuò)增程序(TouchDown法)步驟1: 980C 5 分鐘，步驟2: 98 0C 3O 秒，
步驟3: 65 °C 30秒，每一個(gè)循環(huán)溫度降低0.5 °C，步驟4: 72 0C 30 秒，步驟5:重復(fù)2、3、4步驟9個(gè)循環(huán)，步驟6: 98 0C 30 秒，步驟7: 60 0C 30 秒，步驟8: 72 0C 30 秒，步驟9:重復(fù)6、7、8步驟25個(gè)循環(huán)，步驟10: 720C 10 分鐘，步驟11: 4 0C 保持。(4)致病微生物特異DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)各致病微生物特異性DNA，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物分子量是否與各致病微生物特異性DNA預(yù)定分子量相符確定有無(wú)陽(yáng)性擴(kuò)增，從而確定引發(fā)感染性眼病的致病微生物種類。本發(fā)明通過(guò)根據(jù)感染性眼病常見致病微生物基因組DNA的保守序列，設(shè)計(jì)并合成可以分別擴(kuò)增細(xì)菌、真菌、I型單皰病毒和棘阿米巴原蟲特異DNA的通用引物，利用特殊PCR擴(kuò)增試劑無(wú)需進(jìn)行樣本DNA提取而直接進(jìn)行PCR反應(yīng)的方法檢測(cè)病原體。本發(fā)明省去了模板DNA提取步驟，減少了樣本量損失的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，保證了有限臨床樣本的最大利用度；同時(shí)也使得檢測(cè)的時(shí)間大大縮短，2個(gè)小時(shí)即可出檢測(cè)結(jié)果，對(duì)臨床病變的早期診斷可以起到很好的輔助作用。本發(fā) 明所采用的引物組合分別對(duì)細(xì)菌、真菌、I型單皰病毒和棘阿米巴原蟲是特異的，但是對(duì)其中的每一類又是通用的，通過(guò)檢測(cè)可直接判定是哪一類病原引發(fā)的感染。本發(fā)明采用的直接PCR擴(kuò)增試劑擴(kuò)增效率很高，擴(kuò)增的雖然是未經(jīng)模板DNA提取的粗樣，但是特殊的聚合酶依然有很高的擴(kuò)增效率。本發(fā)明采用的TouchDown的擴(kuò)增程序，既避免了粗樣本中模板的復(fù)雜性可能帶來(lái)的非特異性擴(kuò)增，又保證了特異序列的高效擴(kuò)增。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明選擇根據(jù)細(xì)菌16s rRNA的不同菌種間保守區(qū)域所設(shè)計(jì)的可以擴(kuò)增各種細(xì)菌的正反向通用引物；同樣選擇根據(jù)真菌rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS的不同種間保守區(qū)域所設(shè)計(jì)的可以擴(kuò)增各種真菌的正反向通用引物。根據(jù)I型單純皰疹病毒基因組序列中保守的包膜糖蛋白G所對(duì)應(yīng)的US4區(qū)域設(shè)計(jì)檢測(cè)I型單純皰疹病毒的型特異性引物，根據(jù)棘阿米巴18s rRNA中保守的29區(qū)位設(shè)計(jì)檢測(cè)棘阿米巴的屬特異性引物，分別從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載9個(gè)不同株I型單純皰疹病毒編碼糖蛋白G的核酸序列和8株不同種屬棘阿米巴原蟲的18s rRNA核酸序列，利用序列分析軟件DNAMAN version 6進(jìn)行同源性比較，在同源性為100%的區(qū)位，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，利用DNAMAN軟件中的引物分析功能對(duì)所設(shè)計(jì)弓I物進(jìn)行各項(xiàng)參數(shù)的具體分析，最終確定本發(fā)明的擴(kuò)增單皰病毒和棘阿米巴的正反向引物組。下面對(duì)本發(fā)明的試劑盒和檢測(cè)方法進(jìn)行具體的描述。檢測(cè)感染性眼病致病微生物的試劑盒的制備(5樣次)(I)DNA擴(kuò)增試劑，I管，DNA擴(kuò)增試劑可以選用TaKaRa公司生產(chǎn)的、無(wú)需提取樣本的DNA而直接進(jìn)行擴(kuò)增的2XMightyAmp緩沖液和MightyAmp DNA聚合酶(產(chǎn)品編號(hào)DR071);內(nèi)裝60份擴(kuò)增反應(yīng)(每樣次需做4個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)，4個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品反應(yīng)，4個(gè)陰性反應(yīng))所需試劑，10. 5 μ L/ 份，每份含有 10 μ L 2 XMightyAmp 緩沖液、O. 5 μ L MightyAmp DNA 聚
合酶；(2)正反向引物組合，細(xì)菌、真菌、I型單皰病毒和棘阿米巴原蟲的引物組各I管，每管內(nèi)裝15份，2 μ L/份，每份含正向引物和反向引物的濃度均為5 μ Μ，引物具體序列如下細(xì)菌通用正向引物(BPF): AGAGTTTGATCCTGGCTCAG細(xì)菌通用反向引物(BPR): ATTACCGCGGCTGCTGG真菌通用正向引物(FPF): TCCGTAGGTGAACCTGCGG真菌通用反向引物(FPR): TCCTCCGCTTATTGATATGCI 型單皰病毒正向引物(HPF) : GTGCCGTTGTTCCCATTAI 型單皰病毒反向引物(HPR) : TTTGTCCTTCTCGTCATCC棘阿米巴正向引物(APF): TTAGAGTGTTCAAAGCAGGCAG
棘阿米巴反向引物(APR): TGGTCGGCATCGTTTATG
(3)陽(yáng)性對(duì)照核酸，為包含細(xì)菌、真菌、I型單皰病毒和棘阿米巴原蟲目的DNA片段的質(zhì)粒，分別為pUC-B，pUC-F，pUC-H和pUC_A，各I管，內(nèi)裝5 μ L。質(zhì)粒制備的具體操作是在PCR擴(kuò)增綠膿桿菌，白念珠菌，單皰病毒和棘阿米巴原蟲保守區(qū)基因組DNA后，用試劑盒回收目的片段，連接到克隆質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E. coli中，經(jīng)氨芐培養(yǎng)基平板篩選培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒即可作為陽(yáng)性核酸。其中細(xì)菌陽(yáng)性核酸的目的片段的序列為SEQ ID N0:9、真菌陽(yáng)性核酸的擴(kuò)增目的片段的序列為SEQ ID NO: 10、I型單皰病毒陽(yáng)性核酸PUC-H的擴(kuò)增序列為SEQ ID N0:11、棘阿米巴陽(yáng)性核酸擴(kuò)增目的片段序列為SEQ ID NO: 12。(4)滅菌蒸餾水，I管，內(nèi)裝ImL。檢測(cè)方法按照以下(1)-(4)程序進(jìn)行(I)臨床樣本的處理病變角膜刮取物用20 μ L滅菌蒸餾水吹打重懸于小離心管；房水或玻璃體經(jīng)高速離心后吸棄上清，最終收集20 μ L (含沉淀)，然后用移液器吹打均勻；結(jié)膜囊棉拭子用500 μ L滅菌純水吹打數(shù)次后棄拭子，余液同房水處理方法。(2)致病微生物特異性DNA擴(kuò)增體系的配置分別在4個(gè)反應(yīng)管中加入下列組分
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)感染性眼病致病微生物的試劑盒，所述的試劑盒包括如下的組分 1)DNA擴(kuò)增試劑 為2XPCR預(yù)混試劑及DNA聚合酶混合液； 2)引物混合液: 包括有用于細(xì)菌、真菌、I型單皰病毒和棘阿米巴原蟲檢測(cè)的引物對(duì)，其信息如下 細(xì)菌正向引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:1、 細(xì)菌反向引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:2、 真菌正向引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:3、 真菌反向引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:4, I型單皰病毒正向引物的核苷酸序列為SEQ ID N0:5、 I型單皰病毒反向引物的核苷酸序列為SEQ ID N0:6、 棘阿米巴正向引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:7、 棘阿米巴反向引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:8 ； 3)滅菌蒸餾水。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，還包括有陽(yáng)性對(duì)照核酸 陽(yáng)性對(duì)照核酸分別為含有細(xì)菌、真菌、I型單純皰疹病毒和棘阿米巴正反向引物擴(kuò)增的目的片段的質(zhì)粒，其中細(xì)菌擴(kuò)增的目的片段的序列為SEQ ID N0:9 ;真菌擴(kuò)增的目的片段的序列為SEQ ID NO: 10 ;1型單純皰疹病毒擴(kuò)增的目的片段的序列為SEQ ID NO: 11;棘阿米巴擴(kuò)增的目的片段的序列為SEQ ID NO: 12。
3.權(quán)利要求1或2所述的試劑盒的使用方法，包括如下步驟 (1)臨床樣本的處理病變角膜刮片用20μ L滅菌蒸餾水吹打重懸于小離心管；房水或玻璃體經(jīng)高速離心后吸棄上清，最終收集20 μ L (含沉淀)，然后用移液器吹打均勻；結(jié)膜囊棉拭子用500 μ L滅菌純水吹打數(shù)次后棄拭子，余液同房水處理方法； (2)致病微生物特異性DNA擴(kuò)增體系的配置 分別在4個(gè)反應(yīng)管中加入下列組分DNA擴(kuò)增試劑10.5HL臨床樣木混懸液I 5 ML 細(xì)菌/真菌編毒/阿米巴:十:反_引物組合(5 μM):2 μ L火菌蒸餾水至20 μ L (3)致病微生物特異性DNA擴(kuò)增程序(TouchDown法) 步驟1: 980C 5分鐘， 步驟2: 98 0C 30秒， 步驟3: 65 0C 30秒，每一個(gè)循環(huán)溫度降低O. 5 °C， 步驟4: 72 0C 30秒， 步驟5:重復(fù)2、3、4步驟9個(gè)循環(huán)， 步驟6: 98 0C 30秒， 步驟7: 60 0C 30秒， 步驟8: 72 0C 30秒，步驟9:重復(fù)6、7、8步驟25個(gè)循環(huán)， 步驟·10: 72 0C 10分鐘， 步驟11: 4 0C保持； (4)致病微生物特異DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)各致病微生物特異性DNA，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物分子量是否與各致病微生物特異性DNA預(yù)定分子量相符確定有無(wú)陽(yáng)性擴(kuò)增，從而確定引發(fā)感染性眼病的致病微生物種類。
全文摘要
一種感染性眼病常見致病微生物的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。試劑盒由DNA擴(kuò)增試劑、通用引物組合、陽(yáng)性對(duì)照核酸和滅菌蒸餾水組成；其中DNA擴(kuò)增試劑是一種無(wú)需提取樣本的DNA而直接進(jìn)行擴(kuò)增的預(yù)混試劑及相應(yīng)DNA聚合酶混合液；通用引物組合是針對(duì)感染性眼病幾種常見致病微生物細(xì)菌、真菌、I型單純皰疹病毒和棘阿米巴原蟲各自的保守序列設(shè)計(jì)并合成的通用正向及反向引物等量混合液。本發(fā)明所采用的引物在各致病原種類內(nèi)是通用的，針對(duì)其他病原又是特異的，直接的PCR反應(yīng)體系和程序也很高效；本發(fā)明省去了模板DNA提取步驟，保證了有限臨床樣本的最大利用度；同時(shí)也使得檢測(cè)的時(shí)間大大縮短，對(duì)臨床病變的早期診斷可以起到很好的輔助作用。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK103045761SQ201210546110
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者趙格, 孫士營(yíng), 翟華蕾, 袁青, 謝立信 申請(qǐng)人:山東省眼科研究所