專利名稱：一種高效篩選黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物細(xì)菌培養(yǎng)基，尤其涉及一種能夠高效篩選黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
黃嘌呤氧化酶是生化診斷試劑的重要用酶，常用于檢驗(yàn)血清中的腺苷脫氨酶和5-核苷酸酶等，其穩(wěn)定性、特異性、最適pH 、Km值等對試劑盒質(zhì)量均有著重要的影響。中國專利CN101402922 (—種節(jié)桿菌及其產(chǎn)生黃嘌呤氧化酶的應(yīng)用和制備方法)公開了一種利用節(jié)桿菌來制備黃嘌呤氧化酶的方法，為進(jìn)一步獲得適合于診斷用的性能更優(yōu)良的酶源，從土壤中篩選新的酶源菌種和酶很有必要。然而，土壤微生物多樣，在普通篩選板上，產(chǎn)酶菌和非產(chǎn)酶菌大量生長，篩選工作量太大，因此，設(shè)計(jì)高效篩選培養(yǎng)基，淘汰非產(chǎn)酶株，保留產(chǎn)酶株是提高工作效率，減小盲目性的前提。目前，這方面的研究很少。由于該酶催化次黃嘌呤生成過氧化氫，而過氧化氫可解除苯酚對菌體生長的抑制，由此，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種以苯酚作為篩選壓力的選擇性培養(yǎng)基，使得大量非目的菌株被抑制，并使篩選平板上出現(xiàn)的菌落中產(chǎn)酶菌株豐度提高，提高篩選效率。目前該方法未見文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案為在普通LB瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨1. 0%，酵母粉O. 5%，氯化鈉L 0%，pH7. O,瓊脂2. 0%)中添加O. 02%-10. 0%，優(yōu)選O. 5%的次黃嘌呤，同時(shí)添加O. 01-0. 3%，優(yōu)選O. 2%的苯酚。由于黃嘌呤氧化酶在有氧的條件下能夠催化次黃嘌呤形成黃嘌呤，并進(jìn)一步將后者氧化成尿酸，同時(shí)形成過氧化氫，因此，產(chǎn)黃嘌呤氧化酶的菌株可解除苯酚抑制，因此得以擴(kuò)增，不產(chǎn)生該酶的菌株生長的機(jī)率小。本發(fā)明的培養(yǎng)基的制備方法包含了 將蛋白胨，酵母粉和氯化鈉溶解于水中，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至7. 00 ±O. 05，再加入次黃嘌呤和瓊脂，滅菌，待溫度降到45度以下時(shí)，加入苯酚，混勻，倒平板，凝固得到培養(yǎng)基的步驟。其中，苯酚是在配成水溶液后，用膜(O. 45微米)過濾除菌，在倒平板之前加入培養(yǎng)基混合物中的。本發(fā)明還包括所述培養(yǎng)基在從土壤中定向篩選黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生菌中的用途。
具體實(shí)施例方式器材100毫升三角瓶、直徑45毫米培養(yǎng)皿、培養(yǎng)箱、搖床、超聲波破碎儀等。試劑蛋白胨、酵母粉、次黃嘌呤、苯酚、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉等。方法(I)樣品準(zhǔn)備方法取I克潮濕土壤，用1. 0%氯化鈉溶液20毫升稀釋(裝于100毫升三角瓶中)，在搖床上150轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)I小時(shí)，迅速取O.1毫升用于涂板(取樣之前先搖勻)。(2)復(fù)篩培養(yǎng)基配制方法
蛋白胨10克，酵母粉5克，氯化鈉10克，水1000毫升，攪拌使變清，用O.1摩爾/升的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至7. 0，用100毫升培養(yǎng)基每瓶裝20毫升，每瓶加40毫克次黃嘌呤，用玻璃纖維透氣膜封口。120度滅菌15分鐘。冷切待用。(3)復(fù)篩方法按潔凈操作要求，從篩選平板上挑出單菌落接于篩選培養(yǎng)基中，在30度，150轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)36小時(shí)，超聲(取I毫升在試驗(yàn)室小型超聲波破碎儀上超聲5分鐘)，取出按附錄檢驗(yàn)酶活。酶活在50u/l以上認(rèn)為陽性(u/1為單位/升，具體定義參考附錄)。(4)酶活檢驗(yàn)方法I)、酶活定義I個(gè)酶活單位等于在以下反應(yīng)條件下I分鐘生成I微摩爾過氧化氫(1/2微摩爾醌染料)的酶量。2)、檢測原理
權(quán)利要求
1.一種從土壤中定向篩選黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基除了含有普通LB平板培養(yǎng)基的組分外，還同時(shí)含有次黃嘌呤與苯酚。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從土壤中定向篩選黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)基，其特征在于，所述次黃嘌呤在培養(yǎng)基各組分中的所占的重量百分濃度為O. 02%-1. 0%，優(yōu)選重量百分濃度為O. 5%，所述苯酚在培養(yǎng)基各組分中所占的重量百分濃度為O. 01-0. 3%，優(yōu)選重量百分濃度為O. 2%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的從土壤中定向篩選黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)基，其特征在于，普通LB平板培養(yǎng)基含有蛋白胨、酵母粉、氯化鈉和瓊脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從土壤中定向篩選黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)基，其特征在于，所述蛋白胨的重量百分含量濃度為1.0%，酵母粉的重量百分含量濃度為O. 5%，氯化鈉的重量百分含量濃度為1. 0%,瓊脂的重量百分含量濃度為2. 0%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的從土壤中定向篩選黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，包含在普通LB瓊脂培養(yǎng)基或培養(yǎng)基組合物中添加次黃嘌呤和苯酚的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的從土壤中定向篩選黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，將蛋白胨，酵母粉和氯化鈉溶解于水中，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至7. 00±0. 05，再加入次黃嘌呤和瓊脂，滅菌，待溫度降到45度以下時(shí)，加入苯酚，混勻，倒平板，凝固得到培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的從土壤中定向篩選黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，將苯酚配成水溶液，通過膜過濾除菌，在倒平板之前加入。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基在從土壤中定向篩選黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生菌中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物細(xì)菌培養(yǎng)基，尤其涉及一種能夠高效篩選黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基在普通LB瓊脂培養(yǎng)基中添加次黃嘌呤和苯酚，能夠抑制不產(chǎn)生黃嘌呤氧化酶的菌株的生長，使得產(chǎn)黃嘌呤氧化酶的菌株得以選擇性生長，提高了對于生物菌的篩選效率。
文檔編號(hào)C12N1/00GK103013830SQ201210546438
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月16日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:北京利德曼生化股份有限公司