專利名稱：一種pax6基因檢測(cè)牛生長(zhǎng)性狀的方法及其診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)，特別涉及一種PAX6基因檢測(cè)牛生長(zhǎng)性狀的方法及其診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
遺傳標(biāo)記指可追蹤染色體、染色體某一節(jié)段、某個(gè)位點(diǎn)在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。它具有兩個(gè)基本特征，即可遺傳性和可識(shí)別性，因此生物的任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標(biāo)記。遺傳標(biāo)記大致經(jīng)歷了形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記四個(gè)發(fā)展階段。1974年,Grodzicker等首次提出用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)作為遺傳標(biāo)記,開(kāi)創(chuàng)了直接用DNA作為遺傳標(biāo)記的先河，從而揭開(kāi)了分子標(biāo)記研究的序幕。經(jīng)過(guò)數(shù)十年的發(fā)展，尤其是1985年Mullis等[27]發(fā)明了 PCR技術(shù)以后，分子標(biāo)記研究呈現(xiàn)出“百家爭(zhēng)鳴”的景象。分子標(biāo)記之所以能反映DNA水平的遺傳變異情況主要是基于被研究的DNA分子由于缺失、插入、易位、倒位、重排或存在長(zhǎng)短與重排不一的重復(fù)機(jī)制而產(chǎn)生多態(tài)性。經(jīng)過(guò)大量的研究發(fā)現(xiàn)，DNA分子標(biāo)記有許多特點(diǎn)，如直接以DNA的形式表現(xiàn)；某些標(biāo)記表現(xiàn)共顯性；標(biāo)記數(shù)量多；表現(xiàn)為中性；多態(tài)性高等。如今，分子標(biāo)記在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，在遺傳標(biāo)記中占主導(dǎo)地位。單核苷酸多態(tài)性(sinTle nucleotide polymorphism, SNP)是由美國(guó)麻省理工學(xué)院的人類基因組研究中心的學(xué)者Lander (1996)提出的一類遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，就是指基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸(A/T/C/T)的變化而引起的多態(tài)性。它的變異形式有:顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失等，主要由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起。具有轉(zhuǎn)換型的堿基變異的SNPs約占2/3。在任何已知或未知的基因內(nèi)或附近都可能找到數(shù)量不等的SNPs，基因編碼區(qū)內(nèi)的SNPs (cSNPs)比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)的變異率僅占周?chē)蛄械?/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義 ，因此倍受關(guān)注。標(biāo)記輔助選擇就是將現(xiàn)代生物技術(shù)與常規(guī)選擇方法相結(jié)合，通過(guò)對(duì)遺傳標(biāo)記的選擇來(lái)間接選擇控制某性狀的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)，使之能夠同時(shí)利用標(biāo)記位點(diǎn)信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計(jì)動(dòng)物個(gè)體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。標(biāo)記輔助選擇主要經(jīng)歷了三個(gè)階段:第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋白質(zhì)(酶)標(biāo)記對(duì)數(shù)量性狀的標(biāo)記階段；第三個(gè)階段是分子遺傳標(biāo)記階段。隨著分子標(biāo)記技術(shù)日漸成熟與豐富，使覆蓋整個(gè)基因組的標(biāo)記成為可能，通過(guò)與QTL間的連鎖分析，實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助選擇的目標(biāo)。SNP作為新的遺傳標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇(molecularmark-assist selection, MAS),該技術(shù)是借助DNA分子標(biāo)記對(duì)遺傳資源或育種材料進(jìn)行選擇，對(duì)畜禽的綜合性狀進(jìn)行品種改良，它是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合的方法，進(jìn)行新品種選育。在畜禽育種中，人們期望，通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)性狀密切相關(guān)，并且與數(shù)量性狀緊密連鎖的DNA標(biāo)記的選擇，達(dá)到早期選種和提高育種值準(zhǔn)確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進(jìn)展。近年來(lái)，人們發(fā)展了許多用于探尋分子遺傳標(biāo)記的方法，最常見(jiàn)的有單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)(SSCP) ,PCR-RFLP和直接測(cè)序技術(shù)等，SSCP它可以發(fā)現(xiàn)靶DNA片段中未知位置的堿基突變。Takao經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發(fā)現(xiàn)，他認(rèn)為現(xiàn)在知道的所有單堿基改變絕大多數(shù)可用該方法檢測(cè)出來(lái)。另外，SSCP方法可通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進(jìn)一步提純。用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器。牛的PAX6基因(paired box gene6)位于15號(hào)染色體上,長(zhǎng)28.24kb,包含13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子，該基因?qū)φ{(diào)控垂體前葉GH、ACTH、FSH、LH等激素的分泌有著至關(guān)重要的作用，而GH等激素的分泌直接關(guān)系到動(dòng)物的生長(zhǎng)性狀。當(dāng)該基因發(fā)生變異時(shí)，導(dǎo)致PAX蛋白異常，喪失了轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)作用，從而嚴(yán)重影響生物的生長(zhǎng)發(fā)育性狀。因此，對(duì)PAX6基因遺傳變異及其與生長(zhǎng)發(fā)育、經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)系進(jìn)行研究，具有重要理論和實(shí)踐意義。目前，在國(guó)內(nèi)有關(guān)家畜上PAX6基因研究的資料報(bào)道很少，作為大家畜的黃牛在國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)該基因多態(tài)性的報(bào)道。因此本研究利用PCR-SSCP技術(shù)首次對(duì)中國(guó)黃牛PAX6基因進(jìn)行遺傳變異分析，研究表明PAX6基因不同基因型對(duì)6，12和24月齡的南陽(yáng)牛體重、體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、坐骨端寬和平均日增重有顯著影響(P〈0.05)。本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果表明，PAX6基因可以作為南陽(yáng)牛生長(zhǎng)性狀有效選擇標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種檢測(cè)黃牛PAX6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，尋找與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)的SNP作為分子標(biāo)記，加快具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀黃牛種群的建立。本發(fā)明通 過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):一種檢測(cè)黃牛PAX6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，以包含PAX6基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛PAX6基因；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大?。挥米冃詣┨幚鞵CR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)變性后的擴(kuò)增片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛PAX6基因第17056位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對(duì)P為:上游引物:5’-ATCTTGATTTGATTTGCAGGT-3’ ；下游引物:5’-CAAACACCCATCCTCAA-3’ ；所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 30s，59.1°C退火 30s，72°C延伸 30s，34 個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOrnin0瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，所用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1.5%。所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳質(zhì)量濃度為10%。所述根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛PAX6基因第17056位的單核苷酸多態(tài)性為:TT基因型表現(xiàn)為17056位為核苷酸T純合；TC基因型表現(xiàn)為17056位為核苷酸T/C雜合；CC基因型表現(xiàn)為17056位為脫氧核苷酸C純合；其中，單核苷酸多態(tài)性CC基因型為突
變純合基因型。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下獨(dú)特的技術(shù)效果:本發(fā)明根據(jù)已公布牛PAX6 基因(GenBank Accession N0.NW001493316.1)的序列設(shè)計(jì)引物，分別以3個(gè)黃牛品種的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序后得到的黃牛PAX6基因的部分序列與NCBI公布的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在PAX6基因的第17056位存在SNP多態(tài)性。針對(duì)上述第17056位的SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開(kāi)了其篩查和檢測(cè)方法，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，用變性劑處理擴(kuò)增產(chǎn)物后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，能夠簡(jiǎn)單、快速、低成本、精確地檢測(cè)其單核苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法為PAX6基因的SNP與黃牛部分生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，研究表明基因型對(duì)南陽(yáng)牛群體的體重等性狀有顯著影響(p〈0.05)。以上研究表明，PAX6基因結(jié)果表明該位點(diǎn)能夠作為提高黃牛體重和日增重等性狀的分子標(biāo)記，以便用于中國(guó)黃牛肉用生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。本發(fā)明還涉及一種用于實(shí)施本發(fā)明所述方法的專用試劑盒，所述試劑盒內(nèi)容包括:一、試劑盒成分:1.1特異引物，所述的特異引物包括:上游引物:5’-ATCTTGATTTGATTTGCAGGT-3’ ；下游引物:5’-CAAACACCCATCCTCAA-3，；1.2生化試劑，所述生化試劑包括:
TaqDNA聚合酶；滅菌超純水；內(nèi)含Mg2+、dNTPs 的 2 X Buffer ；包含600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和 IOObp 的 DNAMarker I ；二、試劑盒操作說(shuō)明:2.1PCR操作說(shuō)明(I) PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2。(2) PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序95°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 30s，59.1°C退火 30s，72°C延伸 30s，34 個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOrnin02.2電泳檢測(cè)與基因型判斷( I) PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為211bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，表現(xiàn)唯一的211bp的PCR條帶，見(jiàn)圖2所示。 (2 ) PCR 產(chǎn)物的 SSCP 分析對(duì)每個(gè)個(gè)體擴(kuò)增片段變性處理后，進(jìn)行10%聚丙稀酰胺凝膠電泳檢測(cè)，其個(gè)體可以出現(xiàn)CC，或CT，或TT帶型，見(jiàn)圖4所示。2.3待檢個(gè)體的選擇與淘汰依據(jù)表4的分析結(jié)果(南陽(yáng)牛PAX6基因的TT基因型個(gè)體的體重、體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、坐骨端寬和平均日增重顯著大于TC和CC基因型個(gè)體)，將TC，CC型個(gè)體淘汰；ττ型個(gè)體留種進(jìn)行擴(kuò)繁，將形成一個(gè)優(yōu)良的群體。2.4注意事項(xiàng)(I)DNA的提取可以按照以上提供的步驟操作，也可以依據(jù)不同廠家的全血DNA提取試劑盒的要求來(lái)提取，但是要保證DNA的純度，若提取效果不佳，需要純化后再進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。(2)反應(yīng)體系和反應(yīng)程序可以依據(jù)不同的廠家產(chǎn)品的要求來(lái)操作，但要保證擴(kuò)增的特異性和擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度，以免影響后續(xù)的試驗(yàn)結(jié)果。


圖1是本發(fā)明的技術(shù)流程示意圖。圖2是本發(fā)明用來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物片段大小的瓊脂糖凝膠電泳(泳道1-7分別代表不同黃牛個(gè)體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M為Marker I，條帶分別為100_bp，200-bp，300-bp，400-bp，500-bp,600-bp)。圖3是本發(fā)明中PCR產(chǎn)物混合測(cè)序篩查到的黃牛PAX6基因序列17056位T-C突變測(cè)序結(jié)果圖(黑色方框所指處為單核苷酸突變位置，自上至下分別為T(mén)T、TC和CC基因型的測(cè)序結(jié)果圖)。圖4是本發(fā)明用來(lái)檢測(cè)各樣本突變情況的聚丙烯酰胺凝膠電泳(自左至右泳道分別代表基因型TT、TC和CC的電泳帶型)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明首先根據(jù)NCBI公布的PAX6基因序列(GenBankAccessionN0.NW001493316.1)設(shè)計(jì)引物，分別以3個(gè)黃牛品種的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，混合PCR產(chǎn)物并對(duì)其純化，測(cè)序。然后，進(jìn)行測(cè)序圖分析和序列比對(duì)篩查出SNP位點(diǎn)；其次，對(duì)待測(cè)群體進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)的PCR-SSCP檢測(cè)；最后，根據(jù)在群體中檢測(cè)到的基因型，進(jìn)行群體遺傳統(tǒng)計(jì)分析和生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析，篩選出與黃牛生長(zhǎng)性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記。下面對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。I地方黃牛品種PAX6基因部分DNA序列的克隆1、黃牛樣本采集本發(fā)明具體以3個(gè)中國(guó)地方黃牛品種的種群作為檢測(cè)對(duì)象，具體采集樣本見(jiàn)表1:河南南陽(yáng)牛(276)，陜西秦川牛(308)，河南郟縣紅牛(141)；表I黃牛樣本的 采集
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)黃牛PAX6基因單核苷酸多態(tài)性的方法,其特征在于， (1)以包含PAX6基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛PAX6基因， 所述的引物對(duì)P為: 上游引物:5 ’ -ATCTTGATTTGATTTGCAGGT-3，； 下游引物:5’ -CAAACACCCATCCTCAA-3’ ； (2)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)步驟(I)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小； (3)用變性劑處理步驟(I)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)變性后的擴(kuò)增片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛PAX6基因第17056位的單核苷酸多態(tài)性。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃牛PAX6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，步驟(I)所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)? 95°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，59.1°C退火30s，72。。延伸30s，34個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃牛PAX6基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃牛PAX6基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳為質(zhì)量濃度10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃牛PAX6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述步驟(3)中根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛PAX6基因第17056位的單核苷酸多態(tài)性為:TT基因型表現(xiàn)為17056位為核苷酸T純合；TC基因型表現(xiàn)為17056位為核苷酸T/C雜合；CC基因型表現(xiàn)為17056位為核苷酸C純合；其中，單核苷酸多態(tài)性CC基因型為突變純合基因型。
6.權(quán)利要求1-5中任意一權(quán)利要求所述的檢測(cè)黃牛PAX6基因單核苷酸多態(tài)性的方法在鑒定不同黃牛群體多態(tài)性中的診斷應(yīng)用。
7.權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于用于中國(guó)黃牛肉用和生長(zhǎng)性狀的分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
8.一種用于檢測(cè)黃牛PAX6基因單核苷酸多態(tài)性方法的專用試劑盒，所述試劑盒的內(nèi)容包括: (1)特異引物，所述的特異引物包括: 上游引物:5’ -ATCTTGATTTGATTTGCAGGT-3’ ； 下游引物:5’ -CAAACACCCATCCTCAA-3’ ； (2)生化試劑:所述生化試劑盒包括: TaqDNA聚合酶；滅菌超純水；內(nèi)含 Mg2+、dNTPs 的 2 X Buffer ；包含 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和 IOObp 的 DNAMarker I ； (3)操作說(shuō)明書(shū)所述操作說(shuō)明書(shū)包括 PCR操作說(shuō)明； 電泳檢測(cè)與基因型判斷；待檢個(gè)體的選擇與淘汰；注意 事項(xiàng)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)黃牛生長(zhǎng)性狀的基因診斷試劑盒，是一種PAX6基因檢測(cè)黃牛生長(zhǎng)性狀的方法，該方法以包含PAX6基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛PAX6基因；通過(guò)DNA測(cè)序和PCR-SSCP技術(shù)進(jìn)行基因多態(tài)性的檢測(cè)與快速分型，該方法是一種在DNA水平上篩查和檢測(cè)與黃牛生長(zhǎng)性狀密切相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，故本發(fā)明提供的檢測(cè)方法可用于黃牛生長(zhǎng)性狀的分子標(biāo)記輔助選擇，進(jìn)而快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。本發(fā)明檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、成本低，檢測(cè)結(jié)果直接、可靠，適用于對(duì)黃牛PAX6基因第17056位突變的大規(guī)模的篩查和診斷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103146810SQ20121054973
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者陳宏 , 黃永震, 魏天寶, 藍(lán)賢勇, 雷初朝, 胡沈榮 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)