專利名稱：輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
輪狀病毒(rotavirus)是世界范圍內(nèi)病毒性胃腸炎的重要病因。目前對輪狀病毒感染引起的胃腸炎治療尚無特效藥物。無論在發(fā)達(dá)國家或是發(fā)展中國家，由輪狀病毒引起的腹瀉均有較高的發(fā)病率，是嬰幼兒發(fā)病和致死的最主要病因。
輪狀病毒在離體條件下存活力很強(qiáng)，對各種理化因子有較強(qiáng)抵抗力，耐乙醚和弱酸，用氯仿、反復(fù)凍融、超聲波處理都不能使其失活，且這類病毒的序列變異較大，有多種血清型存在。近年來，輪狀病毒引起的胃腸炎流行在世界范圍內(nèi)有不斷上升的趨勢，且流行范圍廣，傳染性強(qiáng)，二次攻擊率高，常造成急性嚴(yán)重的嘔吐和腹瀉。雖然不同病毒感染的癥狀輕重不一，但一般患者都具有低燒、嘔吐、腹瀉、頭痛等嚴(yán)重的脫水樣胃腸炎的癥狀。人群對這幾種病毒普遍易感，兒童和老人最為嚴(yán)重，為胃腸炎病毒的危險人群。雖然輪狀病毒胃腸炎的流行有一定的季節(jié)性，但全年均可發(fā)生，可呈暴發(fā)流行，也可呈散發(fā)流行，因此致使對其不能進(jìn)行及時有效的防護(hù)。目前輪狀病毒病原的檢測方法有電鏡技術(shù)、病毒分離培養(yǎng)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)，但上述的前三種技術(shù)往往存在靈敏度較低、操作繁瑣耗時、需要大型昂貴的儀器設(shè)備等缺點(diǎn)，在應(yīng)用時往往有其局限性，尤其不能適用于大規(guī)模的病原篩查和檢測等實(shí)際應(yīng)用。分子生物學(xué)技術(shù)，其中尤其以RT-PCR檢測技術(shù)由于其快速、靈敏、適合處理大通量的樣品等特點(diǎn)，在病毒檢測中顯示出其優(yōu)越性并越來越多的得以應(yīng)用，但該方法從檢測到結(jié)果的判讀仍然需要多種專用儀器，操作較為繁瑣，所需時間仍然在5小時以上，常有非特異性出現(xiàn)等缺陷。與上述幾種實(shí)驗室診斷方法相比，近年來新建立的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)由于其對儀器設(shè)備要求不高，臨床上容易做到，檢測時間也較短，不超過3小時，為快速、準(zhǔn)確檢測輪狀病毒探索一種新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測輪狀病毒(rotavirus)的輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測試劑盒，利用該檢測試劑盒可以特異性的檢測輪狀病毒(rotavirus)。本發(fā)明的輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測試劑盒，包括RNA提取試劑，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑和檢測引物組，其特征在于，所述的檢測引物組由下列引物組成上游外引物F3 :5，-ACCACTCCTTAATGCACAA-3，；(如 SEQ ID NO.1 所示)；下游外引物B3 :5’ -GCCATCCITTGATTAAAAATAGCT-3’ ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)；上游內(nèi)引物FIP :5’ -CCTCTCGCGTTGAGTTCGTAT-GGAATAAATCTTCCGATTACTG G-3’ ；(如 SEQ ID NO. 3 所示)下游內(nèi)引物BIP:5’-ATGTTTGTATTACCCAACTGAAGCA-AGAAAGTGTATCCTTCCA TGAA-3，(如 SEQ ID NO. 4 所示)。所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑優(yōu)選包括反應(yīng)液A、反應(yīng)液B和反應(yīng)液C反應(yīng)液A :每 24ii L 含有 2. LlOXThermopol 反應(yīng)緩沖液、I ii 18U/ii L Bst DNA聚合酶、0. 4 u L10mmol/LdNTPs、0. 5 u LlO u mol/L 上游外引物 F3、0. 5 u LlO u mol/L 下游外引物 B3、l ii L40 ii mol/L 上游內(nèi)引物 FIPUu L40 u mol/L 下游內(nèi)引物 BIP,0. 6 u LlOOmmol/L MgSO4> 12. 5 V- L2mol/L 甜菜堿、4 u L 滅菌雙蒸水 ddH20 ；反應(yīng)液B 50mM MgCl2 ；反應(yīng)液C :100 X的熒光染料SYBR Green I。所述的lOXThermopol反應(yīng)緩沖液是現(xiàn)有技術(shù)中的物質(zhì)，可以從試劑公司購買至丨J，其含有200mmol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化鉀(KCl)、100mmol/L 硫酸銨(NH4) 2S04、20mmol/L 硫酸鎂(MgSO4)和 1% 曲拉通 X-100(TtitonX-100)，余量為水。本發(fā)明根據(jù)輪狀病毒的基因保守序列設(shè)計了兩個特異性內(nèi)引物和兩個特異性外引物，該保守基因序列為輪狀病毒所共有。本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，特異性強(qiáng)，且比PCR檢測方法有更高的靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，只需普通的水浴箱即可，且結(jié)果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用熒光染料來觀察即可，簡單而快速，可用于輪狀病毒的檢測，特別適合于基層現(xiàn)場應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(Loop-mediatedIsothermal Amplif ication, LAMP)技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速且成本低等優(yōu)點(diǎn)，其特點(diǎn)是對靶基因的6個部位設(shè)計4種引物，利用鏈置換反應(yīng)在恒溫下使靶基因高效擴(kuò)增。由于其反應(yīng)是多種引物共同啟動，使得反應(yīng)結(jié)果比PCR更特異，另外，由于實(shí)行的等溫擴(kuò)增，反應(yīng)在恒溫水浴箱內(nèi)便可完成，不僅節(jié)約儀器成本，而且操作方法更簡單，適用于現(xiàn)場快速檢測。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測輪狀病毒的方法所需周期長、靈敏度較低、成本高等缺陷，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)院、食品行業(yè)、出入境檢驗檢疫及質(zhì)量監(jiān)督等部門及領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 :利用輪狀病毒LAMP檢測試劑盒檢測輪狀病毒待測樣本制備以臨床腹丨與樣本為例本實(shí)施例收集了 3份醫(yī)院收集的臨床腹瀉樣本，分別按照以下方法進(jìn)行檢測。( I)樣本處理取醫(yī)院收集的臨床腹瀉樣本，用pH7. 4的PBS稀釋成10%的懸液，4°C、IOOOOg離心取上清，用于提取病毒RNA。(2)病毒RNA提取(a)取200 ii L步驟(I)的上清，加800 ii L Trizol試劑，用移液器反復(fù)混勻幾次后靜置5min ；(b)加入200 ii L氯仿，用力振搖15S，再靜置2 3min ;
(c) 4°C, 12000g,離心 15min,棄去上層液體；(d)加入500 u L異丙醇，充分混勻，室溫放置IOmin ；(e) 4°C, 12000g,離心 IOmin,再次棄去上清；(f)加入75 %的乙醇，振搖，充分洗滌沉淀；(g) 4°C, 7500g,離心 5min,小心棄去乙醇；(h)充分干燥后，將RNA沉淀懸浮于適量的無RNA酶的水中，由此得到RNA樣品。(3)病毒RNA反轉(zhuǎn)錄取2 ii L RNA 樣品，I ii LdNTP, 0. 5 u L RNasin, I u L MLV，各 I U L 的外引物 F3(5，-ACCACTCCTTAATGCACAA-3，)和外引物 B3 (5，-GCCATCCITTGATTAAAAATAGCT-3，)， 2. 5 u LlO X RT buffer,1. 5u LMgCl2,加入RNase free水至終體積為25 u L，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42°C，30min，然后 95°C，2min，由此得到 cDNA。(4)環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增在裝有24 ii L反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入I ii L上述步驟3中的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，于65 °C恒溫水浴箱中放置60min。(5)擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測在上述反應(yīng)管中依次加入I y L反應(yīng)液B和I ii L反應(yīng)液C,室溫放置IOmin,用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色，則說明樣品中含有輪狀病毒；如果顏色為黃色，說明待檢樣品不含有輪狀病毒。其結(jié)果為陰性對照(模板為水)黃色，不含有輪狀病毒，陽性對照(RT-PCR陽性并測序確證為陽性的輪狀病毒)綠色，含有輪狀病毒，2-4號樣品為本實(shí)施例的臨床腹瀉樣本，其顏色都為綠色，含有輪狀病毒。這與通過常規(guī)RT-PCR檢測方法檢測得到的結(jié)果相同。實(shí)施例2 :特異性試驗將I個已知輪狀病毒陰性和2個已知輪狀病毒陽性的樣品，按照實(shí)施例1的RT-LAMP法再次檢測，結(jié)果表明，已知陰性的樣品，在LAMP檢測結(jié)果中仍然呈現(xiàn)陰性，已知陽性的樣品，在LAMP檢測結(jié)果中仍然呈現(xiàn)陽性，表明LAMP檢測結(jié)果和PCR檢測結(jié)果相吻合，驗證了本發(fā)明的特異性。實(shí)施例3 :靈敏度試驗將輪狀病毒RNA梯度稀釋，按照實(shí)施例1中步驟3-5的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測，驗證本發(fā)明的靈敏度，檢測結(jié)果為陰性對照(模板為水)為黃色，不含有輪狀病毒，陽性對照(RT-PCR陽性并測序確證為陽性的輪狀病毒)為綠色，含有輪狀病毒，而100pg、10pg、lpg、0.1pg模板量的輪狀病毒RNA樣品其顏色都為綠色,都為陽性，確定其檢測靈敏度為0.1pgo
權(quán)利要求
1.一種輪狀病毒的檢測試劑盒，包括RNA提取試劑，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑和檢測引物組，其特征在于，所述的檢測引物組由下列引物組成上游外引物 F3 :5’ -ACCACTCCTTAATGCACAA-3’ ；下游外引物 B3 :5’ -GCCATCCTTTGATTAAAAATAGCT-3’ ；上游內(nèi)引物 FIP :5’ -CCTCTCGCGTTGAGTTCGTAT-GGAATAAATCTTCCGATTACTG G-3’ ；下游內(nèi)引物 BIP :5’ -ATGTTTGTATTACCCAACTGAAGCA-AGAAAGTGTATCCTTCCA TGAA-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑包括反應(yīng)液A、反應(yīng)液B和反應(yīng)液C 反應(yīng)液A :每24 μ L含有2. 5 μ LlOXThermopol反應(yīng)緩沖液、I μ 18U/ μ LBst DNA聚合酶、O. 4μ L10mmol/LdNTPs、0. 5μ L10ymol/L 上游外引物 F3、0. 5 μ LlO μ mol/L 下游外引物 B3、I μ L40 μ mol/L 上游內(nèi)引物 FIP、I μ L40 μ mol/L 下游內(nèi)引物 ΒΙΡ、0· 6 μ LIOOmmoI/L MgSO4> 12. 5 μ L2mol/L 甜菜堿、4 μ L 滅菌雙蒸水 ddH20 ；反應(yīng)液 B :50mM MgCl2 ；反應(yīng)液C :100 X的熒光染料SYBR Green I。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測試劑盒。該檢測試劑盒組包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游內(nèi)引物FIP、下游內(nèi)引物BIP，分別如SEQ ID NO.1、2、3和4所示、反應(yīng)液B和C。本發(fā)明根據(jù)輪狀病毒的基因保守序列設(shè)計了兩個特異性內(nèi)引物和兩個特異性外引物，該保守基因序列為輪狀病毒所共有。本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，特異性強(qiáng)，且比PCR檢測方法有更高的靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，只需普通的水浴箱即可，且結(jié)果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用熒光染料來觀察即可，簡單而快速，可用于輪狀病毒的檢測，特別適合于基層現(xiàn)場應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/70GK103014177SQ201210553449
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者寇曉霞, 吳清平, 薛亮, 張菊梅 申請人:廣東省微生物研究所, 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司