專利名稱：不對(duì)稱水解酶及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適用于α-取代的氨基酸酯衍生物的不對(duì)稱水解的酶，編碼所述酶的多核苷酸等。
背景技術(shù)：
旋光α -取代的β -氨基酸衍生物作為用于制備藥物本體(bulk)化合物、農(nóng)業(yè)化學(xué)品或生物活性物質(zhì)的原料和中間體是有用的。例如，專利文獻(xiàn)I公開了被用作用于制備抗菌劑的物質(zhì)的旋光α-取代的β_氨基酸衍生物。此外，非專利文獻(xiàn)I和2公開了被用作用于制備細(xì)胞毒性酯肽念珠草環(huán)肽(cryptophycin)的中間體的旋光α-取代的β-氨基酸衍生物。
水解酶具有水解底物的能力，并且近年來，已被用于制備例如用作藥物或農(nóng)業(yè)化學(xué)品的活性成分的化合物或其中間體的有機(jī)合成反應(yīng)。尤其，水解酶已被用于制備旋光化合物或其中間體的有機(jī)合成反應(yīng)。例如，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列并且具有水解底物的能力的酶已知作為水解酶(參見例如，專利文獻(xiàn)2)。
理想的是，這樣的用于制備旋光化合物或其中間體等的可用于工業(yè)的水解酶，具有以下性質(zhì):產(chǎn)生具有高光學(xué)純度的水解反應(yīng)產(chǎn)物的能力；高度識(shí)別底物的絕對(duì)構(gòu)型的能力；對(duì)各種反應(yīng)條件如溫度，ΡΗ，溶劑或壓力的高度穩(wěn)定性；等等。尤其，如果反應(yīng)產(chǎn)物具有高光學(xué)純度(即水解酶的光學(xué)選擇性高)，則在酶反應(yīng)后不需要純化步驟以致于旋光化合物可以以有利的產(chǎn)率被合成。
引用列表
專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1:W0 02/102790
專利文獻(xiàn)2:日本專利號(hào)3875283
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn)I J.Am.Chem.Soc.1995，117，2479
非專利文獻(xiàn)2 :J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1,2000,1461發(fā)明內(nèi)容
為了減少反應(yīng)步驟并提高生產(chǎn)率，強(qiáng)烈需要開發(fā)具有高光學(xué)選擇性的水解酶。
本發(fā)明提供，例如，具有優(yōu)異光學(xué)選擇性的水解酶以及編碼所述酶的多核苷酸。
在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供以下1)-8):
I)以下(a)或(b)的酶(下文中，有時(shí)被稱為本發(fā)明的酶):
(a)包含SEQ ID NO:1的至少第I位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ IDNO:1的第277位的酪氨酸被丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸取代，
并且所述酶具有水解底物的能力；或者
(b)包含SEQ ID NO:1的至少第I位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ IDNO:1的第277位的酪氨酸被不同于酪氨酸的氨基酸取代，
并且所述酶具有水解底物的能力；
2)包含編碼根據(jù)I)的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(下文中，有時(shí)被稱為本發(fā)明的多核苷酸)；
3)包含根據(jù)2)的多核苷酸的載體(下文中，有時(shí)被稱為本發(fā)明的載體)；
4)引入有根據(jù)2)的多核苷酸的轉(zhuǎn)化體(下文中，有時(shí)被稱為本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體)；
5)包含根據(jù)3)的載體的轉(zhuǎn)化體；
6) 一種生產(chǎn)酶的方法，所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)4)或5)的轉(zhuǎn)化體；
7) —種修飾包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括以下步驟:將SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第277位的酪氨酸用丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸取代(下文中，有時(shí)被稱為本發(fā)明的酶修飾方法)；以及
8) —種修飾包含編碼SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟:將編碼SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列中第829至831位的編碼酪氨酸的密碼子用編碼丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸的密碼子取代(下文中，有時(shí)被稱為本發(fā)明的多核苷酸修飾方法)。
根據(jù)本發(fā)明，可以提供具有優(yōu)異光學(xué)選擇性等的水解酶，所述水解酶可用于制備旋光化合物或所述旋光化合物的中間體、如旋光α-取代的氨基酸衍生物的有機(jī)合成反應(yīng)，所述旋光化合物可用作藥物或農(nóng)業(yè)化學(xué)品中的活性成分。
具體實(shí)施方式
下文中，更具體地說明本發(fā)明。
當(dāng)在本文中使用時(shí)，本發(fā)明的酶可以被描述為SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置號(hào)與表示氨基酸的字母表的一個(gè)字母的組合。例如，"2771"表示這樣的酶，所述酶包含相當(dāng)于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列，不同之處在于它具有氨基酸突變，其中SEQ ID NO:1的第277位的酪氨酸被異亮氨酸取代。
關(guān)于本發(fā)明的酶，"水解底物的能力"(下文中，有時(shí)被稱為水解酶活性)可以例如通過以下方法確定:在水的存在下將所述酶與其底物如α-取代的β_氨基酸酯衍生物(具體地，例如，2-正丁基-3_[(Ν-芐氧基-N-甲?；?氨基]丙酸乙酯)混合，隨后將該混合物在25°C孵育，并且然后通過高效液相色譜定量α-取代的β_氨基酸衍生物(具體地，例如，2-正丁基-3-[(N-芐氧基-N-甲?；?氨基]丙酸)在獲得的反應(yīng)溶液中的光學(xué)純度和化學(xué)純度。
本發(fā)明的酶是通過以下(a)或(b)表征的酶:
(a)包含SEQ ID NO:1的至少第I位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ IDNO:1的第277位的酪氨酸被丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸取代，
并且所述酶具有水解底物的能力；或者
(b)包含SEQ ID NO:1的至少第I位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ IDNO:1的第277位的酪氨酸被不同于酪氨酸的氨基酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力。
具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的酶(下文中被稱為野生型水解酶)是本領(lǐng)域中已知的來源于色桿菌(Chromobacterium) SC-YM-1菌株(FERMBP-6703)的水解酶。當(dāng)在重組大腸桿菌(E.coli)中生產(chǎn)該野生型水解酶時(shí)，除了全長(zhǎng)水解酶以外，還產(chǎn)生缺少全長(zhǎng)水解酶的八個(gè)C端氨基酸的截短的水解酶。該截短的水解酶具有水解活性，并且其C端氨基酸是Glu，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第362位的Glu。因此，本發(fā)明的酶可以具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的至少第I位至第362位的氨基酸序列。
上述"不同于酪氨酸的氨基酸"是指構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中除酪氨酸之外的任何氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。優(yōu)選地，上述"不同于酪氨酸的氨基酸"是指丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸。
本發(fā)明的酶的具體實(shí)例包括以下酶:
基本上由SEQ ID NO:1的第I位至第362位的氨基酸序列組成的酶，其中SEQ IDNO:1的第277位的酪氨酸被丙氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO:1的第277位的酪氨酸被丙氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；
基本上由SEQ ID NO:1的第I位至第362位的氨基酸序列組成的酶，其中SEQ IDNO:1的第277位的酪氨酸被色氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO:1的第277位的酪氨酸被色氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；
基本上由SEQ ID NO:1的第I位至第362位的氨基酸序列組成的酶，其中SEQ IDNO:1的第277位的酪氨酸被異亮氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO:1的第277位的酪氨酸被異亮氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；
基本上由SEQ ID NO:1的第I位至第362位的氨基酸序列組成的酶，其中SEQ IDNO:1的第277位的酪氨酸被組氨酸`取代，并且所述酶具有水解底物的能力；以及
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO:1的第277位的酪氨酸被組氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力。
為獲得包含編碼本發(fā)明的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，例如，可以使用以下方法。
首先，獲得包含編碼野生型水解酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(下文中，有時(shí)被稱為野生型多核苷酸)。編碼SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列的實(shí)例包括SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
野生型多核苷酸可以根據(jù)常規(guī)遺傳工程技術(shù)獲自色桿菌SC-YM-1菌株(根據(jù)布達(dá)佩斯條約，在1999年4月15日保藏于國(guó)際專利生物保藏中心(InternationalPatent Organism Depositary) (IPOD),國(guó)家技術(shù)和評(píng)估研究所(National Instituteof Technology and Evaluation)(NITE), Tsukuba Central6,1-1-1, Higashi, Tsukuba,Ibaraki 305-8566，日本，保藏編號(hào)為FERMBP-6703)，所述遺傳工程技術(shù)描述于，例如，J.Sambrook, E.F.Fritsch, T.Maniatis ；Molecular Cloning(第二 版)，Cold SpringHarbor Laboratory，1989中。具體地，根據(jù)常規(guī)方法從色桿菌SC-YM-1菌株抽提基因組DNA。例如，通過常規(guī)方法如超聲波均化作用將細(xì)菌細(xì)胞破碎，之后是蛋白酶處理等并且隨后抽提基因組DNA。將獲得的基因組DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈?，并使用連接酶將其插入到例如噬菌體載體λ gtll或質(zhì)粒載體pUC19中，從而由此制備基因組DNA文庫(kù)?？梢酝ㄟ^篩選方法從獲得的基因組DNA文庫(kù)獲得野生型多核苷酸，所述篩選方法例如使用針對(duì)野生型水解酶的抗體的免疫學(xué)方法，使用對(duì)應(yīng)于野生型水解酶的部分氨基酸序列的合成的DNA探針的雜交方法，或測(cè)定野生型水解酶活性的方法。備選地，野生型多核苷酸也可以通過以下方法來制備:使用合適的引物進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增包含編碼SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。
可以通過如下所示的位點(diǎn)定向誘變來突變獲得的野生型多核苷酸，由此制備本發(fā)明的多核苷酸。位點(diǎn)定向誘變方法是這樣的方法，其中使用整合有原始的多核苷酸(即野生型多核苷酸)的質(zhì)粒的單鏈DNA作為模板以及包含要被突變的核苷酸序列的合成的寡核苷酸作為引物來合成變體多核苷酸(即本發(fā)明的多核苷酸)。在本發(fā)明中，可以制備用于誘變的引物以通過PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，以使SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第277位的氨基酸可以被不同于酪氨酸的氨基 酸取代。優(yōu)選的是第277位的氨基酸被丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸取代的特定突變。
在本文的上下中，"位點(diǎn)定向誘變方法"的實(shí)例可以包括Olfert Landt等的方法(Gene 96,125-128,1990), Smith 等的方法(Genetic Engineering 3,1, Setlow,J.和 Hollaender, A, Plenum:New York), Vlasuk 等的方法(Experimental Manipulationof Gene Expression, Inouye, M.:Academic Press, New York),以及 Hos.N.Hunt 等的方法(Gene 77, 51,1989),以及使用市售試劑盒如 Mutan-Express Km(由 Takara ShuzoC0.，Ltd.生產(chǎn))，TaKaRa LaPCR 體外誘變?cè)噭┖?由 Takara Shuzo C0.，Ltd.生產(chǎn))，和QuikChange II位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖?由Stratagene Corp.生產(chǎn))。
具體地，為制備編碼包含SEQ ID NO:1的至少第I位至第362位的氨基酸序列(其中使用例如Olfert Landt等的方法(Gene 96,125-128,1990)用不同于酪氨酸的氨基酸取代SEQ ID NO:1的第277位的酪氨酸)的水解酶的多核苷酸，首先根據(jù)例如以下文獻(xiàn)中所述的方法制備整合了野生型基因的載體(DNA):J.Sambrook, E.F.Fritsch, T.Maniatis ；Molecular Cloning 第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, 1989。
隨后，將所獲得的載體(DNA)用作模板從而通過PCR方法擴(kuò)增DNA片段，所述PCR方法使用，例如，包含編碼其中SEQ ID NO:1的第277位的酪氨酸被丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸取代的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID N0:2的核苷酸序列的寡核苷酸)作為正義引物和包含與正義引物互補(bǔ)的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的寡核苷酸)作為反義引物。在本文中，PCR反應(yīng)的條件的實(shí)例可以包括以下條件:在95°C孵育I分鐘；并且隨后是95°C孵育處理50秒、然后550C I分鐘以及68°C 5分鐘進(jìn)行12個(gè)循環(huán)；并且最后在4°C孵育。將DpnI限制酶加入到含擴(kuò)增的DNA片段的PCR反應(yīng)溶液中，并且然后在37°C孵育I小時(shí)，之后用所得的溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌?？梢詮乃@得的轉(zhuǎn)化體中純化載體，由此獲得所需的本發(fā)明的多核苷酸。
也可以基于本發(fā)明的多核苷酸的核苷酸序列，根據(jù)常規(guī)方法如亞磷酸三酯法(HunkapiIler,M.等,Nature, 310,105,1984),通過化學(xué)合成包含所需核苷酸序列的核酸來制備本發(fā)明的多核苷酸。
為了獲得本發(fā)明的酶，制備允許本發(fā)明的多核苷酸在宿主細(xì)胞如微生物中表達(dá)的載體，并且將所述載體引入到宿主細(xì)胞中以制備轉(zhuǎn)化體。隨后，可以根據(jù)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法來培養(yǎng)所制備的轉(zhuǎn)化體。以此方式，可以大量制備并獲得本發(fā)明的酶。
本發(fā)明的載體包含本發(fā)明的多核苷酸。
本發(fā)明的載體可以通過以下方法構(gòu)建:根據(jù)常規(guī)遺傳工程技術(shù)將本發(fā)明的多核苷酸整合到載體中，所述載體可以用于要引入本發(fā)明的多核苷酸的宿主細(xì)胞中，例如，所述載體包含在宿主細(xì)胞中可復(fù)制的遺傳信息，可以自主增殖，可以從宿主細(xì)胞分離和純化，并且具有可檢測(cè)的標(biāo)記物(下文中，有時(shí)被稱為基本載體)。
在本文中，在將大腸桿菌用作宿主細(xì)胞的情況中，"基本載體"的實(shí)例包括:載體 pUC119(由 Takara Shuzo C0.，Ltd.生產(chǎn))和曬菌粒 pBluescript II (由 StratageneCorp.生產(chǎn))。此外，在將芽殖酵母用作宿主細(xì)胞的情況中，"基本載體"的實(shí)例可以包括載體 pGBT9，pGAD424，和 pACT2(由 ClontechLaboratories，Inc.生產(chǎn))。此外，在將哺乳動(dòng)物細(xì)胞用作宿主細(xì)胞的情況中，"基本載體"的實(shí)例可以包括載體如pRc/RSV和pRc/CMV (由InvitrogenCorp.生產(chǎn))，包含來源于病毒的自主復(fù)制起點(diǎn)的載體如牛乳頭瘤病毒(bovine papilloma virus)載體 pBPV(由 Amersham Pharmacia Biotech Inc.生產(chǎn))和EB病毒載體pCEP4(由Invitrogen Corp.生產(chǎn))，以及病毒如牛痘病毒。此外，在將昆蟲細(xì)胞用作宿主細(xì)胞的情況中，"基本載體"的實(shí)例可以包括昆蟲病毒如桿狀病毒。
當(dāng)使用含自主復(fù)制起點(diǎn)的載體(具體地，例如，用于酵母的載體pACT2，牛乳頭瘤病毒載體PBPV，或EB病毒載體pCEP4)構(gòu)建本發(fā)明的載體時(shí)，在被引入到宿主細(xì)胞后，該載體在細(xì)胞內(nèi)保持為附加體。
可以通過以下方法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞:向其中引入允許本發(fā)明的多核苷酸在宿主細(xì)胞如微生物中表達(dá)的載體，由此制備轉(zhuǎn)化體?？梢愿鶕?jù)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)所制備的轉(zhuǎn)化體，由此大量生產(chǎn)并獲得本發(fā)明的酶。
允許本發(fā)明的多核苷酸在宿主細(xì)胞如微生物中表達(dá)的載體可以通過以下方法制備:將在宿主細(xì)胞如微生物中可操作的(operable)啟動(dòng)子可操作地連接到本發(fā)明的多核苷酸的上游，并將此整合到上 述基本載體中。
在本文中，短語(yǔ)" 可操作地連接或可操作連接的"是指連接啟動(dòng)子和本發(fā)明的多核苷酸以使本發(fā)明的多核苷酸在引入有本發(fā)明的多核苷酸的宿主細(xì)胞如微生物中在啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。
在宿主細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子的實(shí)例可以包括在轉(zhuǎn)移有本發(fā)明的多核苷酸的宿主細(xì)胞中顯示啟動(dòng)子活性的DNA。在宿主細(xì)胞是大腸桿菌的情況中，在宿主細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子的實(shí)例可以包括大腸桿菌乳糖操縱子啟動(dòng)子(IacP)，色氨酸操縱子啟動(dòng)子(trpP)，精氨酸操縱子啟動(dòng)子(argP)，半乳糖操縱子啟動(dòng)子(galP)，tac啟動(dòng)子，T7啟動(dòng)子，T3啟動(dòng)子，和λ噬菌體啟動(dòng)子(λ-pL和λ-PR)。此外，在宿主細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞或裂殖酵母的情況中，在宿主細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子的實(shí)例可以包括勞斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒(RSV)啟動(dòng)子，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，猿病毒(SV40)早期或晚期啟動(dòng)子，和鼠乳瘤病毒(mouse mammary tumor virus,MMTV)啟動(dòng)子。此外,在宿主細(xì)胞是芽殖酵母的情況中,在宿主細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子的實(shí)例可以包括ADHl啟動(dòng)子(ADH1啟動(dòng)子可以通過常規(guī)遺傳工程方法從例如攜帶有ADHl啟動(dòng)子和ADHl終止子的酵母表達(dá)載體pAAH5 [可從WashingtonResearch Foundation 獲得；Ammerer 等，Method in Enzymology, 101 部分(ρ.192-201)]制備)。
在使用本來就攜帶有在宿主細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子的基本載體的情況中，本發(fā)明的多核苷酸可以被插入到該啟動(dòng)子的下游以使該啟動(dòng)子可操作地連接到本發(fā)明的多核苷酸。在例如pRc/RSV或pRc/CMV的情況中，將克隆位點(diǎn)設(shè)置于在動(dòng)物細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子的下游。通過將本發(fā)明的多核苷酸插入到克隆位點(diǎn)獲得的載體可以被引入到動(dòng)物細(xì)胞中，由此允許本發(fā)明的多核苷酸在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。因?yàn)檫@些載體原本就攜帶有SV40自主復(fù)制起點(diǎn)(ori)，所以當(dāng)所述載體被引入到轉(zhuǎn)化有ori缺失型SV40基因組的培養(yǎng)的細(xì)胞(例如，COS細(xì)胞)中時(shí)，該載體的拷貝數(shù)在細(xì)胞內(nèi)大量增加,并且因此，已經(jīng)整合到該載體中的本發(fā)明的多核苷酸可以大量表達(dá)。此外，用于酵母的載體PACT2具有ADHl啟動(dòng)子，并且本發(fā)明的多核苷酸可以被插入到該載體或其衍生物中的ADHl啟動(dòng)子的下游，由此構(gòu)建允許本發(fā)明的多核苷酸在芽殖酵母(例如，CG1945 (由Clontech Laboratories, Inc.生產(chǎn)))中大量表達(dá)的載體。將本發(fā)明的多核苷酸連接到核糖體結(jié)合位點(diǎn)可以獲得更高的表達(dá)。雖然關(guān)于核糖體結(jié)合位點(diǎn)已知Guarente.L等的報(bào)道(Cell 20, p.543(1980))以及Taniguchi等的報(bào)道(Genetics of IndustrialMicroorganisms (工業(yè)微生物的遺傳學(xué))，ρ.202 (1982)，Kodansha Ltd.)，但是可以根據(jù)需要設(shè)計(jì)并合成適合于本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
宿主細(xì)胞的實(shí)例可以包括微生物，例如，真核生物和原核生物。其優(yōu)選的實(shí)例可以包括大腸桿菌。上述 載體可以通過常規(guī)遺傳工程方法被引入到宿主細(xì)胞中由此轉(zhuǎn)化該宿主細(xì)胞。
適于宿主細(xì)胞的常規(guī)轉(zhuǎn)染方法可以用于將本發(fā)明的載體引入到宿主細(xì)胞中的方法。在將大腸桿菌用作宿主細(xì)胞的情況中，轉(zhuǎn)染方法的實(shí)例可以包括常規(guī)方法如氯化鈣法以及電穿孔法，所述方法描述于，例如，J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis ；MolecularCloning(分子克隆)第二版,Cold Spring Harbor Laboratory, 1989。此外,在將哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞用作宿主細(xì)胞的情況中，轉(zhuǎn)染方法的實(shí)例可以包括常規(guī)基因轉(zhuǎn)移方法如磷酸鈣方法、DEAE葡聚糖法、電穿孔法和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法。此外，在將酵母用作宿主細(xì)胞的情況中，轉(zhuǎn)染方法的實(shí)例可以包括常規(guī)方法如鋰方法，所述方法用于，例如，Yeast transformationkit (酵母轉(zhuǎn)化試劑盒)(由ClontechLaboratories, Inc.生產(chǎn))。在使用病毒作為載體的情況中，可以通過如上所述的常規(guī)基因轉(zhuǎn)移方法將病毒的基因組引入到宿主細(xì)胞中。此外，也可以通過用病毒顆粒感染宿主細(xì)胞而將病毒的基因組引入到宿主細(xì)胞中，所述病毒顆粒含有插入了本發(fā)明的多核苷酸的病毒的基因組。
對(duì)于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的選擇，例如，可以將其中標(biāo)記基因與本發(fā)明的載體一起被引入的宿主細(xì)胞通過適合于標(biāo)記基因的性質(zhì)的方法培養(yǎng)。在標(biāo)記基因是例如賦予針對(duì)選擇試劑的藥物抗性的基因的情況中，引入有本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞可以使用補(bǔ)充有該選擇試劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)，所述選擇試劑顯示對(duì)宿主細(xì)胞的致死活性。賦予藥物抗性的基因和選擇試劑的組合的實(shí)例可以包括賦予新霉素抗性的基因和新霉素的組合，賦予潮霉素抗性的基因和潮霉素的組合，以及賦予殺稻瘟菌素S(Blasticidin S)抗性的基因和殺稻瘟菌素S的組合。在標(biāo)記基因是互補(bǔ)宿主細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的基因的情況中，引入有本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞可以使用不含對(duì)應(yīng)于該營(yíng)養(yǎng)缺陷型的營(yíng)養(yǎng)物的基本培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。此外，在引入允許本發(fā)明的多核苷酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的本發(fā)明的載體的情況中，可以使用基于本發(fā)明的酶的酶活性的檢測(cè)方法。
為了獲得其中本發(fā)明的多核苷酸位于宿主細(xì)胞的染色體中的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，例如，本發(fā)明的載體和具有標(biāo)記基因的載體首先通過用限制酶等消化來線性化，并且然后通過上述方法將這些引入到宿主細(xì)胞中。隨后，通常將細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)周。然后，可以通過基于所引入的標(biāo)記基因的表達(dá)水平的選擇來獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)化體。備選地，例如，首先通過上述方法將本發(fā)明的載體引入到宿主細(xì)胞中，所述載體具有作為標(biāo)記基因的如上所述的賦予對(duì)選擇試劑的抗性的基因。隨后，將細(xì)胞在補(bǔ)充有選擇試劑的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)數(shù)周或更長(zhǎng)。然后，已經(jīng)以集落形式存活的抗選擇試劑的克隆也可以被培養(yǎng)以用于純化，由此選擇并獲得其中本發(fā)明的多核苷酸被引入到宿主細(xì)胞的染色體中的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。為確認(rèn)引入的本發(fā)明的多核苷酸被成功地整合在宿主細(xì)胞的染色體中，根據(jù)常規(guī)遺傳工程方法制備細(xì)胞的基因組DNA,并且可以使用以下方法，如PCR或DNA雜交(Southernhybridization),利用包含引入的本發(fā)明的多核苷酸的部分核苷酸序列的DNA作為引物或探針，從制備的基因組DNA檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸的存在。因?yàn)檗D(zhuǎn)化體可以冷凍保存并且如有必要的話可以在復(fù)蘇后使用，可以節(jié)約每個(gè)實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化體制備的時(shí)間和精力，并且可以使用其性質(zhì)或操作條件已被提前確認(rèn)的轉(zhuǎn)化體來進(jìn)行測(cè)試。
含本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的載體的轉(zhuǎn)化體(即，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體)的培養(yǎng)可以通過常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行。
在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是微生物的情況中，例如，轉(zhuǎn)化體可以使用適當(dāng)?shù)睾刑荚础⒌?、有機(jī)或無機(jī)鹽等的用于常規(guī)微生物的常規(guī)培養(yǎng)的各種培養(yǎng)基培養(yǎng)。
碳源的實(shí)例包括:糖類如葡萄糖、糊精和蔗糖；糖醇如甘油；有機(jī)酸如富馬酸、檸檬酸和丙酮酸；以及動(dòng)物油、植物油和糖蜜。被添加到培養(yǎng)基中的碳源的量通常為培養(yǎng)液的大約 0.1 至 30% (w/v) ο
氮源的實(shí)例包括:天然有機(jī)氮源如肉膏、蛋白胨、酵母抽提物、麥芽提取物、大豆粉、玉米漿、棉籽粉、干酵母和酪蛋白氨基酸；氨基酸；無機(jī)酸的鈉鹽如硝酸鈉；無機(jī)酸的銨鹽如氯化銨、硫酸銨和磷酸 銨；有機(jī)酸的銨鹽如富馬酸銨和檸檬酸銨；和尿素。在這些中，有機(jī)酸的銨鹽、天然有機(jī)氮源、氨基酸等在很多情況中也可以用作碳源。被添加到培養(yǎng)基中的氮源的量通常為培養(yǎng)液的大約0.1至30% (w/v)。
有機(jī)鹽或無機(jī)鹽的實(shí)例可以包括鉀、鈉、鎂、鐵、錳、鈷、鋅、銅等的氯化物、硫酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽。具體地，其實(shí)例包括氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鈷、硫酸鋅、硫酸銅、乙酸鈉、碳酸鈣、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。被添加到培養(yǎng)基中的有機(jī)鹽和/或無機(jī)鹽的量通常為培養(yǎng)液的大約0.0001至5% (w/v)。
此外，在其中引入有基因的轉(zhuǎn)化體的情況中，例如，可以將少量的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)作為誘導(dǎo)劑加入到培養(yǎng)基中以用于誘導(dǎo)本發(fā)明的酶的產(chǎn)生，所述基因是通過將異乳糖可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子和Iac啟動(dòng)子可操作地連接到本發(fā)明的多核苷酸而制備的。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)可以根據(jù)通常用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞如微生物的方法來進(jìn)行。所述方法的實(shí)例包括液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)，如試管振蕩培養(yǎng)、往復(fù)式(reciprocal)振蕩培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)和槽培養(yǎng)(tank culture)。
培養(yǎng)溫度可以在可使轉(zhuǎn)化體存活的范圍內(nèi)適當(dāng)變化，并且通常是約15°C至約40°C。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為約6至約8。培養(yǎng)時(shí)間取決于培養(yǎng)條件而不同并且通常優(yōu)選為約I天至約5天。
在常規(guī)蛋白質(zhì)純化中使用的方法可以應(yīng)用于從本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物純化本發(fā)明的酶的方法。例如，可以使用如下顯示的方法。
首先，通過離心等從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物收集細(xì)胞，并且然后將這些細(xì)胞通過例如以下方法均化:物理均質(zhì)法如超聲波處理、Dyno-mill處理或弗氏壓碎(French press)處理，或化學(xué)均質(zhì)法，其使用表面活性劑，或裂解酶如溶菌酶。可以通過離心、通過薄膜過濾器過濾等將雜質(zhì)從所獲得的勻漿溶液中除去，由此制備不含細(xì)胞的提取物溶液，然后可以適當(dāng)?shù)厥褂弥T如以下的分離和純化方法將該提取物溶液分級(jí):陽(yáng)離子交換色譜，陰離子交換色譜，疏水色譜，凝膠過濾色譜，或金屬螯合色譜，由此純化本發(fā)明的酶。
用于色譜的載體的實(shí)例包括不可溶的聚合物載體如纖維素、糊精或瓊脂糖，其中引入有竣甲基(CM),二乙氣基乙基(DEAE),苯基，或丁基?？梢允褂檬惺鄣难b填有載體(carrier-packed)的柱。市售的裝填有載體的柱的實(shí)例包括Q-Sepharose FF和苯基-Sepharose HP (商品名；都由 GEHealthcare Japan 生產(chǎn)),以及 TSK-gel G3000SW(商品名；由Tosoh Corp.生產(chǎn))。
為選擇包含本發(fā)明的酶的級(jí)分，例如，可以基于根據(jù)本發(fā)明的水解酶活性的出現(xiàn)或不出現(xiàn)或其出現(xiàn)的程度進(jìn)行所述選擇?？梢酝ㄟ^以下方法進(jìn)行該選擇:測(cè)定不對(duì)稱水解底物α-取代的β-氨基酸酯衍生物(具體地，例如，2-正丁基_3-[ (N-芐氧基-N-甲?；?氨基]丙酸乙酯)從而優(yōu)先產(chǎn)生相應(yīng)的羧酸的能力。
用本發(fā)明的酶或本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體或其加工產(chǎn)物處理α -取代的β -氨基酸酯衍生物從而優(yōu)先產(chǎn)生相應(yīng)的旋光羧酸。
與α-取代的β-氨基酸酯衍生物的α位的碳原子結(jié)合的取代基(下文中，簡(jiǎn)稱為α-取代基)是具有I至20個(gè)碳原子的烴基。所述烴基可以是以下任一:脂族烴基、月旨環(huán)族烴基和芳族烴基以及它們的組合。對(duì)于作為α -取代基的烴基，其碳原子數(shù)目?jī)?yōu)選為I至7，更優(yōu)選為3至6。脂族烴基典型地是烷基。其實(shí)例包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、辛基、癸基、十二燒基、十四燒基、十六燒基、十八燒基和二十燒基(icosyl group),所述基團(tuán)可以是直鏈的或支鏈的。脂環(huán)族烴基的實(shí)例包括環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)辛基、環(huán)癸基、降莰烷基(norbornyl)和金剛烷基。芳族烴基典型地是芳基。芳基的實(shí)例包括苯基、萘基、蒽基和聯(lián)苯基。作為α-取代基的這些烴基也可以被取代。取代基的實(shí)例包括烷基、燒氧基、芳基、芳氧基、芳燒氧基、齒素原子、硝基和氰1基。
α-取代的氨基酸酯衍生物中的α-取代基可以是，如上所述，脂族烴基和脂環(huán)族烴基的組合，脂族烴基和芳族烴基的組合，或者脂環(huán)族烴基和芳族烴基的組合。脂族烴基和脂環(huán)族烴基的組合的實(shí)例典型地包括環(huán)烷基和烷二基(alkanediyl)的組合。具體地，其實(shí)例包括環(huán)戊基甲基、環(huán)戊基乙基、環(huán)戊基丙基、環(huán)戊基丁基、環(huán)己基甲基、環(huán)己基乙基、環(huán)己基丙基、環(huán)己基丁基、環(huán)辛基甲基、環(huán)辛基乙基、環(huán)辛基丙基和環(huán)辛基丁基。脂族烴基和芳族烴基的組合典型地是芳烷基，并且其實(shí)例包括芐基和萘基甲基。脂環(huán)族烴基和芳族烴基的組合是苯基環(huán)戊基、苯基環(huán)己基、萘基環(huán)戊基、萘基環(huán)己基等。同樣，一個(gè)α-取代基或兩個(gè)彼此不同的α-取代基可以結(jié)合到α-位的碳原子。優(yōu)選地，一個(gè)α-取代基結(jié)合到α_位的碳原子。
以上根據(jù)其具體實(shí)例描述了 α -取代的β -氨基酸酯衍生物中的α -取代基。其中，α-取代基優(yōu)選是脂族烴基，更優(yōu)選是甲基、乙基、正丙基、正丁基或正戊基，尤其優(yōu)選是正丁基或正戊基。用于生產(chǎn)生物活性物質(zhì)如在以上非專利文獻(xiàn)I和2中描述的α-取代的β_氨基酸衍生物的中間體物質(zhì)可以容易地從其α-取代基是甲基或正丙基的α-取代的氨基酸酯衍生物獲得。同樣，作為藥物或農(nóng)業(yè)化學(xué)品中的活性成分的旋光化合物，或其中間體，如在以上專利文獻(xiàn)I中所述的α-取代的氨基酸衍生物，可以容易地從其α-取代基是正丁基或正戊基的α-取代的氨基酸酯衍生物獲得。
α-取代的β-氨基酸酯衍生物的β-位的氨基可以具有取代基。氨基中的取代基的實(shí)例包括常規(guī)氨基保護(hù)基。氨基保護(hù)基也可以根據(jù)例如以下文獻(xiàn)進(jìn)行適當(dāng)?shù)剡x擇:Greene 等，Protective Groups in Organic Synthesis (有機(jī)合成中的保護(hù)基)，第 3 版，1999，John Wiley & Sons，Inc。
氨基中的取代基或氨基保護(hù)基是指，例如，可以具有取代基的具有I至10個(gè)碳原子的烷基，可以具有取代基的具有2至10個(gè)碳原子的烯基，可以具有取代基的具有7至20個(gè)碳原子的芳烷基，可以具有取代基的具有I至10個(gè)碳原子的?；梢跃哂腥〈木哂?至15個(gè)碳原子的烷氧羰基，可以具有取代·基的具有2至15個(gè)碳原子的烯氧羰基，可以具有取代基的具有8至20個(gè)碳原子的芳烷氧羰基，可以具有取代基的具有6至20個(gè)碳原子的亞芐基，可以具有取代基的具有I至10個(gè)碳原子的磺酰基，羧基(-C00H)，甲酰胺基(-CONH2)，羥基(-0H)，可以具有取代基的具有I至10個(gè)碳原子的烷氧基，可以具有取代基的具有2至10個(gè)碳原子的烯氧基，可以具有取代基的具有7至20個(gè)碳原子的芳烷氧基，可以具有取代基的具有6至20個(gè)碳原子的芳氧基，可以具有取代基的具有2至15個(gè)碳原子的酰氧基，可以具有取代基的具有2至15個(gè)碳原子的烷氧羰氧基，可以具有取代基的具有2至15個(gè)碳原子的烯氧羰氧基，可以具有取代基的具有8至20個(gè)碳原子的芳烷氧羰氧基，或者可以具有取代基的具有4至10個(gè)碳原子的環(huán)狀乙烯氧基(ethenyloxy)。
烷基的實(shí)例包括甲基、乙基、丙基和丁基，它們可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的。
烯基的實(shí)例包括乙烯基和烯丙基，它們可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的。
芳烷基的實(shí)例包括芐基、4-甲氧基芐基、二苯甲基和三苯甲基。
酰基的實(shí)例包括甲酰基、乙酰基、氯乙?；⒈；⒍□；?、新戊?；⒈郊柞；袜彵蕉柞；?，它們可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的。
燒氧擬基的實(shí)例包括甲氧基擬基、乙氧基擬基、2, 2, 2- 二氣乙氧基擬基、丙氧基擬基和丁氧基羰基，它們可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的。
烯氧羰基的實(shí)例包括乙烯氧基羰基和烯丙氧基羰基，它們可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的。
芳燒氧擬基的實(shí)例包括9_荷基甲氧基擬基、節(jié)氧基擬基、4_甲氧基節(jié)氧基擬基和4-硝基芐氧基羰基。
亞芐基的實(shí)例包括亞芐基、4-甲氧基亞芐基和二苯基亞甲基。
磺?；膶?shí)例包括苯磺酰基、4-甲苯磺酰基、2-硝基苯磺酰基和4-硝基苯磺?；?。
燒氧基的實(shí)例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基，它們可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的。
烯氧基的實(shí)例包括乙烯氧基和烯丙氧基，它們可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的。
芳烷氧基的實(shí)例包括芐氧基和4-甲氧基芐氧基。
芳氧基的實(shí)例包括苯氧基和萘氧基。
酰氧基的實(shí)例包括乙?；趸?、氯乙酰基氧基、丙?；趸⒍□；趸?、新戊酰基氧基和苯甲酰基氧基，它們可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的。
燒氧擬氧基的實(shí)例包括甲氧基擬基氧基、乙氧基擬基氧基、2, 2, 2- 二氣乙氧基擬基氧基、丙氧基擬基氧基和丁氧基擬基氧基，它們可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的。
稀氧擬氧基的實(shí)例包括乙稀氧基擬基氧基和稀丙氧基擬基氧基，它們可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的。
芳烷氧羰氧基的實(shí)例包括9-芴基甲氧基羰基氧基、芐氧基羰基氧基、4-甲氧基芐氧基擬基氧基和4_硝基節(jié)氧基擬基氧基。
環(huán)狀乙烯氧基的實(shí)例包括四氫-2H-吡喃-2-基氧基、四氫呋喃-2-基氧基和1，4- 二曝?zé)齸2~基氧基。
此外，燒基，稀基，芳燒基，酸基，燒氧擬基，稀氧擬基，芳燒氧擬基，亞節(jié)基，橫酸基，燒氧擬基，甲酸胺基， 燒氧基，稀氧基，芳燒氧基，芳氧基，酸氧基，燒氧擬氧基，稀氧擬氧基，芳烷氧羰氧基，和環(huán)狀乙烯氧基可以進(jìn)一步具有取代基。所述取代基與被例舉為作為α-取代基的烴基取代基的那些是相同的。
氨基保護(hù)基可以被0、1或2個(gè)取代基取代。在2個(gè)取代基的情況中，這些取代基可以是彼此相同的或不同。
以上，根據(jù)其具體實(shí)例描述了位的氨基中的取代基。其中，位的氨基中的取代基優(yōu)選為氫原子，具有I至10個(gè)碳原子的?；?，或者具有7至20個(gè)碳原子的芳烷氧基，更優(yōu)選為甲?；蚱S氧基，尤其優(yōu)選為甲?；推S氧基的組合。
結(jié)合到位的碳原子的不同于氨基的取代基不受具體限制，并且優(yōu)選為氫原子。
α -取代的β -氨基酸酯衍生物中具有酯鍵的基團(tuán)是可以具有取代基的具有2至10個(gè)碳原子的烷氧羰基。所述烷氧羰基可以是直鏈的或支鏈的。此外，烷氧羰基的具體實(shí)例與被描述為是作為β-位的氨基中的取代基或保護(hù)基的烷氧羰基的那些相同，其中碳原子數(shù)目為2至10。對(duì)于烷氧羰基，其碳原子的數(shù)目更優(yōu)選為2至4。甲氧基羰基或乙氧基羰基是尤其優(yōu)選的。烷氧羰基中的任選取代基與作為α-取代基中的任選取代基被例舉的那些相同。
在本文中，優(yōu)選的α-取代的β-氨基酸酯衍生物的實(shí)例具體地包括2-正丁基-3-[(N-芐氧基)氨基]丙酸甲酯，2-正丁基-3-[(N-芐氧基)氨基]丙酸乙酯，2-正戊基-3-[(Ν-芐氧基)氨基]丙酸甲酯，2-正戊基-3-[ (N-芐氧基)氨基]丙酸乙酯，2-正丁基-3-[(N-芐氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸甲酯，2-正丁基-3-[ (N-芐氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸乙酯，2-正戊基-3-[(N-芐氧基-N-甲?；?氨基]丙酸甲酯，和2-正戊基-3-[(N-芐氧基-N-甲?；?氨基]丙酸乙酯。其中，2-正丁基-3-[(N-芐氧基-N-甲?；?氨基]丙酸甲酯或2-正丁基-3-[(N-芐氧基-N-甲?；?氨基]丙酸乙酯是尤其優(yōu)選的。
α -取代的β -氨基酸酯衍生物的旋光異構(gòu)體混合物可以通過本領(lǐng)域中已知的制備方法獲得。該制備方法描述于，例如，ARKIC0V 2010 ( Χ)，P.196至205中。
旋光α-取代的β-氨基酸酯衍生物可以是外消旋物，或者可以是其中旋光異構(gòu)體以任意比率混合的混合物。該外消旋物或混合物可以是新鮮制備的或者可以在溶解后使用。
通過用本發(fā)明的酶、本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體或它的加工產(chǎn)物處理α-取代的β-氨基酸酯衍生物獲得的旋光α-取代的β-氨基酸衍生物的實(shí)例具體地包括(R)-2-正丁基-3- [ (N-芐氧基)氨基]丙酸，(R) -2-正戊基-3- [ (N-芐氧基)氨基]丙酸，(R) _2_正丁基-3-[(N-芐氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸，和(R)-2-正戊基-3-[(N-芐氧基-N-甲?；?氨基]丙酸，以及其中上述的(R)被(S)取代的化合物。
當(dāng)用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體或其加工產(chǎn)物處理α -取代的β -氨基酸酯衍生物以生產(chǎn)相應(yīng)的旋光羧酸時(shí)，所述反應(yīng)通常在水的存在下進(jìn)行。用于該反應(yīng)中的水可以是緩沖的水溶液。在緩沖的水溶液中使用的緩沖液的實(shí)例可以包括:堿金屬的磷酸鹽，如磷酸鈉和磷酸鉀；堿金屬的乙酸鹽，如乙酸鈉水溶液和乙酸鉀；及其混合物。
在反應(yīng)中，可以允許有機(jī)溶劑與水共存?？梢栽试S共存的有機(jī)溶劑的實(shí)例可以包括:醚如叔丁基甲基醚，二異丙基醚，和四氫呋喃；酯如甲酸乙酯，乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸丁酯，丙酸乙酯，和丙酸丁酯；烴如甲苯，己烷，環(huán)己烷，庚烷，和異辛烷；醇如甲醇，乙醇，2-丙醇，丁醇，和叔丁醇；有機(jī)硫化合物如二甲亞砜；酮如丙酮；腈如乙腈；和它們的混合物。
例 如通過以下方式進(jìn)行反應(yīng):通過攪拌、振蕩等，將水和α-取代的β_氨基酸酯衍生物與本發(fā)明的酶或生產(chǎn)本發(fā)明的酶的轉(zhuǎn)化體或其加工產(chǎn)物混合，如有必要，在進(jìn)一步含有有機(jī)溶劑等的狀態(tài)下進(jìn)行。
反應(yīng)期間的pH可以適當(dāng)?shù)剡x擇并且通常為pH3至10。此外，反應(yīng)溫度可以適當(dāng)?shù)剡x擇，并且考慮到原料和產(chǎn)物的穩(wěn)定性以及反應(yīng)速率，通常為O至60°C。
可以例如通過液相色譜等監(jiān)視α -取代的β -氨基酸衍生物在反應(yīng)溶液中的量來確定反應(yīng)的終點(diǎn)。可以適當(dāng)?shù)剡x擇反應(yīng)時(shí)間，并且通常為0.5小時(shí)至10天。
反應(yīng)完成后的反應(yīng)溶液包含不對(duì)稱水解反應(yīng)產(chǎn)物α -取代的β -氨基酸衍生物和剩余的α-取代的β-氨基酸酯衍生物。為了分離它們，例如，采用這樣的方法，所述方法涉及進(jìn)行水/疏水有機(jī)溶劑萃取操作從而將剩余的α-取代的β_氨基酸酯衍生物和α-取代的β_氨基酸衍生物分別分配到有機(jī)層(疏水有機(jī)溶劑層)和水層中，并在有機(jī)層和水層之間進(jìn)行分離。
為了從酶、緩沖液或其他水溶性組分分離作為目的化合物的旋光α-取代的β -氨基酸衍生物，可以使用疏水有機(jī)溶劑將旋光α -取代的β -氨基酸衍生物萃取到有機(jī)層中，然后將該有機(jī)層與水層分離。
疏水有機(jī)溶劑的實(shí)例包括:醚如叔丁基甲基醚和異丙醚；烴如甲苯，己烷，環(huán)己烷，庚烷，辛烷和異辛烷；鹵代烴如二氯甲烷，二氯乙烷，氯仿，氯苯，和鄰二氯苯；以及酯如乙酸乙酯，乙酸甲酯，和乙酸丁酯。在反應(yīng)期間使用這些疏水有機(jī)溶劑的情況中，反應(yīng)完成后的反應(yīng)溶液可以直接進(jìn)行分離操作，前提是它可以分離成有機(jī)層和水層。備選地，在反應(yīng)期間不使用疏水有機(jī)溶劑或者由于所用的疏水有機(jī)溶劑或水的量少反應(yīng)溶液不容易分離成有機(jī)層和水層或者由于所用的水的量少而不能容易地分離的情況中，可以適當(dāng)添加疏水有機(jī)溶劑或水等，之后進(jìn)行分離。所用疏水有機(jī)溶劑的量不受具體限制，并且相對(duì)于I重量份的α -取代的β -氨基酸酯衍生物的旋光異構(gòu)體，通常為約0.1至200重量份，優(yōu)選為約0.2至100重量份。
目的化合物萃取期間的pH通常為約2至10，優(yōu)選為約4至8。
可以適當(dāng)?shù)厥褂盟岷蛪A將溶液調(diào)至所述pH。在從水層萃取目的化合物不充分的情況中，可以將相同的萃取和分離操作重復(fù)若干次。此外，在從有機(jī)層去除水溶性組分不充分的情況中，可以將相同的萃取和分離操作重復(fù)若干次，如上所述。
因此通過萃取與不對(duì)稱水解產(chǎn)物羧酸分離的剩余的酯可以通過蒸餾出油層中的有機(jī)溶劑而分離。所獲得的旋光α-取代的β_氨基酸酯衍生物可以進(jìn)行外消旋化處理，并且由此作為α-取代的β_氨基酸酯衍生物的旋光異構(gòu)體混合物再循環(huán)。
因此通過蒸餾出油層中的有機(jī)溶劑分離的剩余的酯可以通過柱色譜等進(jìn)一步純化。
在萃取后，作為不對(duì)稱水解產(chǎn)物的旋光α-取代的氨基酸衍生物被包含在分離的水層中，并且例如，通過蒸餾出水或在中和處理后使用有機(jī)溶劑對(duì)其進(jìn)行萃取，可以容易地將其從水層中提取出。分離的α-取代的β_氨基酸衍生物可以通過蒸餾出油層中的有機(jī)溶劑來分離。
因此獲得的旋光α-取代的氨基酸衍生物可以通過純化操作如柱色譜、再結(jié)晶或再沉淀進(jìn)一步純化。在純化操作如再結(jié)晶或再沉淀中，可以使用合適的堿將旋光α -取代的β -氨基酸衍生物進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)辂}，并且然后通過再結(jié)晶或再沉淀來純化該鹽。純化的鹽可以通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄞD(zhuǎn)變回旋光α-取代的β_氨基酸衍生物。
本發(fā)明的酶或生產(chǎn)所述酶的轉(zhuǎn)化體或所述轉(zhuǎn)化體的加工產(chǎn)物可以以多種形式用于上述方法。
具體形式的實(shí)例可以包括本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物，該轉(zhuǎn)化體的加工產(chǎn)物，不含細(xì)胞的抽提物溶液，半純化的蛋白質(zhì)，純化的蛋白質(zhì)，和它們被固定化的形式。在本文中，轉(zhuǎn)化體的處理產(chǎn)物的實(shí)例可以包括凍干的轉(zhuǎn)化體，有機(jī)溶劑處理的轉(zhuǎn)化體，干燥的轉(zhuǎn)化體，經(jīng)碾磨的轉(zhuǎn)化體，轉(zhuǎn)化體自溶物，經(jīng)超聲波處理的轉(zhuǎn)化體，轉(zhuǎn)化體抽提物，和堿處理的轉(zhuǎn)化體。用于獲得被固定化的形式的方法的實(shí)例可以包括載體結(jié)合法(該方法涉及將本發(fā)明的酶等吸附到無機(jī)載體(硅膠、陶瓷等)、纖維素、離子交換樹脂等上)和包埋法(該方法涉及使本發(fā)明的酶等被截留在聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，所述聚合物如聚丙烯酰胺、含硫的多糖凝膠(例如，角叉藻聚糖)、藻酸凝膠或瓊脂凝膠)。
考慮到使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的工業(yè)生產(chǎn)，使用其中轉(zhuǎn)化體是死亡的加工產(chǎn)物的方法比使用未處理的轉(zhuǎn)化體的方法更優(yōu)選，原因在于其較少受生產(chǎn)設(shè)備的限制。用于此目的的微生物滅活處理方法的實(shí)例可以包括物理滅菌法(加熱、干燥、冷凍、光束、超聲波、過濾和通電(electrification)),和利用化學(xué)品(堿、酸、鹵素、氧化劑、硫、硼、砷、金屬、醇、酹、胺、硫化物、醚、醛、酮、氰和抗生素)的滅菌法。通常優(yōu)選的是從這些滅菌方法中選擇這樣的處理方法，其較少通過殘余、污染等影響反應(yīng)系統(tǒng)，同時(shí)盡可能地避免本發(fā)明的酶的還原酶活性的失活。
本發(fā)明的酶修飾方法是用于修飾包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第277位的酪氨酸用丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸取代的步驟。
包括在本發(fā)明的酶修飾方法中的步驟可以根據(jù)類似于以上描述(例如，關(guān)于本發(fā)明的酶和本發(fā)明的多核苷酸的制備的描述)以及下述實(shí)施例(例如，本發(fā)明的多核苷酸的制備:位點(diǎn)定向誘變)中的那些的方法進(jìn)行。
本發(fā)明的多核苷酸修飾方法是用于修飾包含編碼SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將編碼SEQ IDNO:1的氨基酸序列的核苷酸序列中第829至831位的編碼酪氨酸的密碼子用編碼丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸的密碼子取代的步驟。
包括在本發(fā)明的多核苷酸修飾方法中的步驟可以根據(jù)類似于以上描述(例如，關(guān)于本發(fā)明的酶和本發(fā)明的多核苷酸的制備的描述)以及下述實(shí)施例(例如，本發(fā)明的多核苷酸的制備:位點(diǎn)定向誘變)中的那些的方法進(jìn)行。
實(shí)施例
下文中，將根據(jù)實(shí)施例更具體地描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
對(duì)于用于基因克隆和質(zhì)粒構(gòu)建的方法，"Molecular Cloning:ALaboratoryManual (分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))第二版"(I989) , Cold SpringHarbor LaboratoryPress, ISBN 0-87969-309-6, " Current Protocols inMolecular Biology(當(dāng)前分子生物學(xué)方法)"(1987)，John Wiley & Sons, Inc.1SBN 0-471-50338-X 等中描述的方法可以用作參考。下文中，將詳細(xì)描述諸如克隆的步驟。
實(shí)施例1 (本發(fā)明的多核苷酸的制備:位點(diǎn)定向誘變)
(1-1)位點(diǎn)定向誘變操作
合成如在SEQ ID NO:2至9中所示的合成的寡核苷酸，其用作用于誘變的引物，使得第277位的酪氨酸可 以被丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸取代。引入誘變后的氨基酸以及關(guān)于誘變用引物的相應(yīng)的SEQ IDNO和核苷酸序列顯示在表I中。
[表I]
權(quán)利要求
1.以下(a)或(b)的酶: (a)包含SEQID NO:1的至少第I位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO:1的第277位的酪氨酸被丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；或者 (b)包含SEQID NO:1的至少第I位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO:I的第277位的酪氨酸被不同于酪氨酸的氨基酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力。
2.一種多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.一種載體,所述載體包含根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸。
4.一種轉(zhuǎn)化體，在所述轉(zhuǎn)化體中已經(jīng)引入了根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸。
5.一種轉(zhuǎn)化體,所述轉(zhuǎn)化體包含根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體。
6.一種生產(chǎn)酶的方法，所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的轉(zhuǎn)化體。
7.一種修飾包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第277位的酪氨酸用丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸取代的步驟。
8.—種修飾包含編碼SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法,所述方法包括將編碼SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列中第829至831位的編碼酪氨酸的密碼子用編碼丙氨 酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸的密碼子取代的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及，例如，α-取代的β-氨基酸酯衍生物不對(duì)稱水解酶，所述酶包括以下(a)或(b)的酶(a)包含SEQ ID NO1的至少第1位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO1的第277位的酪氨酸被丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；或者(b)包含SEQ ID NO1的至少第1位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO1的第277位的酪氨酸被不同于酪氨酸的氨基酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力。
文檔編號(hào)C12N15/63GK103160481SQ20121055497
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者秋山敏彥, 平田紀(jì)彥, 寶來真志 申請(qǐng)人:住友化學(xué)株式會(huì)社