專利名稱：唐氏綜合征21號染色體相關(guān)miRNA、基因、篩選方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種與唐氏綜合征21號染色體相關(guān)的miRNA、基因、篩選方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
唐氏綜合征(Down syndrome,簡稱DS)又叫21三體(Trisomy 21,Ts21)綜合征，因多出一條或部分21號染色體而導(dǎo)致的一種出生缺陷型疾病。約每700例嬰兒中就有I例。患者表現(xiàn)為先天性智力低下、精神遲鈍、體格發(fā)育不全和先天性心臟缺陷等80多種臨床癥狀。生物學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)21號染色體上含有500多個基因，包括5個miRNAUicroRNA，微小 RNA)基因miR-99a、let_7c、miR-125b_2、miR-155 和 miR-802。miRNA 是一類長度為19^25個核苷酸的內(nèi)生性單鏈非編碼調(diào)節(jié)RNA。miRNA可與靶基因mRNA的3’端特異性結(jié)合，使其降解或轉(zhuǎn)錄抑制，在細(xì)胞的增值、分化、凋亡、胚胎的發(fā)育和組織的分化等生物學(xué)過程中具有非常重要的作用。研究表明21號染色體上5個miRNA的過表達(dá)均與DS患者各種臨床性狀有關(guān)，如智力缺陷、兒童白血病、免疫缺陷、低血壓等。但與21號染色體相關(guān)的miRNA還有很多，因此，研究這些miRNA，特別是與唐氏綜合征特異性相關(guān)的miRNA具有重要的研究價值。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，有必要提供一種與唐氏綜合征21號染色體相關(guān)的miRNA、基因、篩選方法和應(yīng)用。一種與唐氏綜合征21號染色體相`關(guān)的miRNA基因，具有如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。一種與唐氏綜合征21號染色體相關(guān)的miRNA的前體，具有如SEQ ID NO. 2的核苷酸序列。一種與唐氏綜合征21號染色體相關(guān)的miRNA，具有如SEQ ID NO. 3的核苷酸序列。上述miRNA、其基因及其前體基因在制備診斷或檢測唐氏綜合征試劑中的應(yīng)用。上述miRNA、其基因及其前體基因在制備診斷或檢測唐氏綜合征基因檢測芯片中的應(yīng)用。一種唐氏綜合征21號染色體相關(guān)miRNA的篩選方法，包括如下步驟分別采集唐氏綜合征胎兒和正常胎兒的臍帶血單個核細(xì)胞樣品；提取所述樣品中的總RNA，用變性聚丙烯胺凝膠電泳分離回收長度不大于30個核苷酸的小RNA，在T4RNA連接酶的作用下，在回收的小RNA的5’端加上如SEQ ID NO. 4的核苷酸序列接頭，3’端加上如SEQ ID NO. 5的核苷酸序列接頭，經(jīng)TBE聚丙烯胺凝膠電泳純化后，經(jīng)Solexa小RNA反轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴(kuò)增后制成小RNA的cDNA文庫，再使用TBE聚丙烯胺凝膠電泳對所述cDNA文庫進(jìn)行純化并進(jìn)行測序分析；對測序后所得的小RNA分子進(jìn)行去接頭和去污染處理，并從中篩選出長度為18^30nt的核苷酸序列，用SOAP軟件將所得序列與人全基因組序列進(jìn)行比對分析，將匹配上的序列按照GenBank>Rfam>miRBasel7. 0>repeat>exon>intron的優(yōu)先級順序進(jìn)行分類注釋，然后將intron和未比對上序列的小RNA分子序列作為新miRNA的數(shù)據(jù)源，用MIREAP和MiPred兩種軟件對所述新miRNA所在的染色體進(jìn)行分析，得到所述唐氏綜合征21號染色體相關(guān)miRNA。上述唐氏綜合征21號染色體相關(guān)miRNA或其前體是與唐氏綜合征患者特異性相關(guān)的miRNA,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其與基因的表達(dá)、細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)、胚胎形態(tài)的發(fā)生和心臟的發(fā)育有關(guān)。因此，該新的miRNA的發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步研究21號染色體的功能，探索唐氏綜合征患者新的治療靶點提供了實驗理論基礎(chǔ)和新的方向，并可應(yīng)用在制備診斷或檢測唐氏綜合征患者試劑的領(lǐng)域，為唐氏綜合征疾病的診斷和檢測提供簡便的手段。


圖1為一實施方式的唐氏綜合征胎兒的臍帶血染色體核型分析結(jié)果圖；圖2為正常胎兒的臍帶血染色體核型分析結(jié)果圖；圖3為miR_nov21在21號染色體上的座位分析圖。
具體實施例方式下面主要結(jié)合具體實 施例和附圖對唐氏綜合征21號染色體相關(guān)miRNA、基因、篩選方法和應(yīng)用作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。一實施方式的篩選方法、結(jié)果及相關(guān)檢測包括如下步驟1、篩選1.1、樣本收集及胎兒臍帶血的采集和保存收集2011年2月 2011年6月于深圳市人民醫(yī)院行產(chǎn)前診斷、經(jīng)常規(guī)G顯帶染色體核型分析確診為標(biāo)準(zhǔn)型DS胎兒的臍帶血樣本5例，正常胎兒臍帶血3例。5例DS胎兒臍帶血中，2例用于小RNA建庫進(jìn)行測序分析，3例用于PCR驗證。該研究由深圳市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且征得所有孕婦知情同意。在超聲引導(dǎo)下，抽取If 22孕周DS胎兒和正常胎兒臍帶血2 3mL于EDTA抗凝管中(BD公司)，然后運(yùn)用淋巴細(xì)胞分離液(Invitrogen公司)提取臍帶血單個核細(xì)胞,融入Trizol試劑(Invitrogen公司)，置于凍存管中，凍存于_80°C備用。1. 2、臍帶血RNA提取和Solexa測序臍帶血單個核細(xì)胞小RNA文庫的建立與測序、生物信息學(xué)分析在華大基因研究院協(xié)助下完成，整個實驗過程嚴(yán)格按照試劑和儀器操作說明書進(jìn)行。主要實驗流程包括采用Invitrogen T rizol試劑盒抽提2例DS胎兒臍帶血樣本的總RNA，再把2個樣本等量混合，取10μ g混合RNA樣品用15%的變性聚丙烯胺凝膠電泳分離回收核苷酸(nucleotide, nt)長度不大于30個核苷酸的小RNA ;再在T4RNA連接酶(Promega公司)作用下，在小RNA兩端分別加上接頭，其中，5 ’端接頭的序列是 5 ’ -GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3 ’ (SEQ ID NO. 4 )和 3 ’ 端接頭的序列是5’-pUCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGidT-3’ (SEQ ID NO. 5) (P 表示磷酸基團(tuán)(phosphate);idT 表不反向脫氧胸腺卩密唳(inverteddeoxythymidine)),經(jīng) 10wt% 的 tr1-borate-EDTA (TBE)聚丙烯胺凝膠電泳純化后，由Solexa小RNA反轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴(kuò)增后制成小RNA的cDNA文庫。然后用6wt%TBE聚丙烯胺凝膠電泳對cDNA文庫進(jìn)行純化,用Illumina Hiq-2000測序儀進(jìn)行測序分析。1. 3、數(shù)據(jù)處理和新miRNA的預(yù)測首先對測序所得的小RNA分子序列進(jìn)行去接頭、去低質(zhì)量和去污染等處理得到18 30個核苷酸長度的干凈序列。然后用SOAP (2.0)軟件將所得干凈序列與人全基因組序列進(jìn)行比對分析，將匹配上的序列按照GenBank>R fam (10.0)>miRBasel7. 0>repeat>exon>intron的優(yōu)先級順序進(jìn)行分類注釋,對未比對上任何注釋信息的序列用“Unanno”表示。然后將Intron和Unanno的小RNA分子序列作為新miRNA預(yù)測的數(shù)據(jù)源，運(yùn)用MIREAP和MiPred兩種軟件進(jìn)行新miRNA的預(yù)測分析。1. 4、Stem-loop RT-PCR 驗證為驗證Solexa測序分析結(jié)果的可靠性以及21號染色體上新miRNA基因在DS胎兒和正常胎兒中的表達(dá)變化，運(yùn)用SYBR Green Stem-loop RT-PCR對21號染色體上新miRNA的成熟體進(jìn)行驗證。運(yùn)用Invitrogen Trizol試劑盒分別提取剩余3例DS胎兒臍帶血和3例正常胎兒臍帶血單個核細(xì)胞的總RNA ;在AB1- 7500實時定量PCR儀上，采用20 μ L反應(yīng)體系，運(yùn)用miRNA分子特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物(中國上海吉瑪公司)和M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，在95°C預(yù)變性5min，95°C變性15s，60°C退火15s，72°C延伸32s的反應(yīng)條件下連續(xù)擴(kuò)增40個循環(huán)，每個基因設(shè)置3個復(fù)孔，cDNA濃度為1:20，以rRNAU6為內(nèi)參，采用2-Λ Aet方法計算21號染色體上新miRNA基因的相對表達(dá)量。2、結(jié)果2.1、胎兒臍帶血染色體核型分析如圖1所示，5例DS胎兒臍帶血經(jīng)染色體核型分析，顯示均為標(biāo)準(zhǔn)DS核型。圖2為正常胎兒的臍帶血染色體核型。2. 2、小RNA分子序列分類注釋通過Solexa高通量測序技術(shù)對DS胎兒臍帶血單個核細(xì)胞小RNA文庫的測序分析，總共得到23324424條1(Γ30核苷酸長度的高質(zhì)量序列，經(jīng)去接頭、去低質(zhì)量和去污染序列等處理后獲得21770729條18 30核苷酸長度的干凈序列，占總量的90. 6%，合計280056種小RNA。運(yùn)用S0AP(2. O)軟件把所得各種小RNA與人全基因組序列(hgl9)進(jìn)行比對，比對過程中最多允許2個堿基的錯配，得到8087250匹配序列，共58523種小RNA分子。與公共數(shù)據(jù)庫比對，將匹配上全基因組的小RNA序列分類注釋為miRNA、tRNA、rRNA、細(xì)胞核小RNA序列(snRNA)、核仁小RNA序列(snoRNA)>piRNA>mRNA降解片段、重復(fù)序列(repeat)、細(xì)胞漿小RNA序列(scRNA)、信號識別顆粒小RNA序列(srpRNA)、內(nèi)含子序列(Intron)和未注釋序列(Unanno)，共12類。見表I。表I與全基因組序列匹配的小RNA分類注釋表
權(quán)利要求
1.一種與唐氏綜合征21號染色體相關(guān)的miRNA基因，具有如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的miRNA基因在制備診斷或檢測唐氏綜合征試劑中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的miRNA基因在制備診斷或檢測唐氏綜合征基因檢測芯片中的應(yīng)用。
4.一種與唐氏綜合征21號染色體相關(guān)的miRNA的前體，具有如SEQ IDNO. 2的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求1所述的miRNA的前體在制備診斷或檢測唐氏綜合征試劑中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求1所述的miRNA的前體在制備診斷或檢測唐氏綜合征試劑中的應(yīng)用。
7.一種與唐氏綜合征21號染色體相關(guān)的miRNA，具有如SEQ ID NO. 3的核苷酸序列。
8.如權(quán)利要求1所述的miRNA在制備診斷或檢測唐氏綜合征試劑中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求1所述的miRNA在制備診斷或檢測唐氏綜合征基因檢測芯片中的應(yīng)用。
10.一種唐氏綜合征21號染色體相關(guān)miRNA的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟 分別采集唐氏綜合征胎兒和正常胎兒的臍帶血單個核細(xì)胞樣品； 提取所述樣品中的總RNA，用變性聚丙烯胺凝膠電泳分離回收長度不大于30個核苷酸的小RNA，在T4RNA連接酶的作用下，在回收的小RNA的5’端加上如SEQ ID NO. 4的核苷酸序列接頭，3’端加上如SEQ ID NO. 5的核苷酸序列接頭，經(jīng)TBE聚丙烯胺凝膠電泳純化后，經(jīng)Solexa小RNA反轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴(kuò)增后制成小RNA的cDNA文庫，再使用TBE聚丙烯胺凝膠電泳對所述cDNA文庫進(jìn)行純化并進(jìn)行測序分析； 對測序后所得的小RNA分子進(jìn)行去接頭和去污染處理，并從中篩選出長度為18 30nt的核苷酸序列，用SOAP軟件將所得序列與人全基因組序列進(jìn)行比對分析，將匹配上的序列按照GenBank>Rfam>miRBasel7. 0>repeat>exon>intron的優(yōu)先級順序進(jìn)行分類注釋，然后將intron和未比對上序列的小RNA分子序列作為新miRNA的數(shù)據(jù)源，用MIREAP和MiPred兩種軟件對所述新miRNA所在的染色體進(jìn)行分析，得到所述唐氏綜合征21號染色體相關(guān)miRNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與唐氏綜合征21號染色體相關(guān)的miRNA及其前體序列，其具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，該miRNA位于21號染色體“DS關(guān)鍵區(qū)域”內(nèi)，與DS疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。因而，該新的miRNA可以廣泛應(yīng)用在制備診斷或檢測DS基因檢測芯片或相關(guān)試劑的制備過程中。此外，本發(fā)明還涉及一種該miRNA的篩選方法。
文檔編號C12Q1/68GK103045596SQ201210555209
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者徐勇, 李武縣, 戴勇 申請人:徐勇