專利名稱：唐氏綜合征21號染色體miRNA差異表達圖譜模型、構(gòu)建方法及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種唐氏綜合征21號染色體miRNA差異表達圖譜模型及構(gòu)建方法和應用。
背景技術(shù)：
唐氏綜合征(Down syndrome,簡稱DS),又名21三體綜合征,常伴有智力低下、特殊面容、免疫缺陷等80多種臨床癥狀。關(guān)于DS患者各臨床癥狀的廣生，研究學者認為是21號3染色體和2倍體基因表達紊亂的共同作用結(jié)果。而21號3染色體基因如何導致2倍體基因表達紊亂、擾亂正常發(fā)育，產(chǎn)生各種臨床有害表型的機制仍不清楚。miRNA (微小RNA，又稱microRNA,)是一類長度為18 24個核苷酸(nucleotides,簡稱nt)的內(nèi)生性單鏈非編碼RNA。miRNA可與其靶基因mRNA的:V -端特異性結(jié)合，使靶基因mRNA降解或抑制靶基因編碼蛋白的表達，在基因轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控中具有重要作用，是一種有效的基因表達調(diào)控因子。21號染色體miRNA基因的異常表達與DS相關(guān)臨床表型的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。因此，鑒別與DS各臨床表型相關(guān)miRNA的表達譜和染色體分布特征，將有助于了解DS疾病臨床表型發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控機制，為進一步研究DS患者全基因組基因表達紊亂及其與相關(guān)臨床癥狀的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，有必要提供一種唐氏綜合征21號染色體miRNA差異表達圖譜模型及構(gòu)建方法和應用。一種與唐氏綜合征21號染色體相關(guān)的miRNA差異表達圖譜模型，與健康對照組比較，由序列為 SEQ ID NO.1 的表達上調(diào) miRNA、序列為 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ IDNO. 4 及 SEQ ID NO. 5 的表達下調(diào) miRNA 以及序列為 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ IDNO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO.1USEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13 及 SEQ IDNO. 14的零表達miRNA構(gòu)成。上述miRNA差異表達圖譜模型在制備診斷或檢測唐氏綜合征檢測試劑中的應用。一種用于診斷或檢測唐氏綜合征患者的基因檢測芯片，包括用于檢測分類號為miR-3118、miR-3156、miR-3197、miR-3648、miR-3687、miR-4327、miR-4759、miR-4760 及miR-548x中至少一種miRNA的檢測探針，各所述分類號是國際miRNA數(shù)據(jù)庫的人類miRNA分類號?！N與唐氏綜合征21號染色體相關(guān)的miRNA差異表達圖譜模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟收集唐氏綜合征胎兒和健康胎 兒的臍帶血單個核細胞樣品；提取所述樣品中的總RNA，用15被％聚丙烯胺凝膠電泳分離所述總RNA，回收并純化長度為18 30nt的小RNA分子，在T4RNA連接酶的作用下，在回收的小RNA的5’端加上SEQ ID NO. 15的接頭序列，3’端加上SEQ ID NO. 16的接頭序列，再經(jīng)RT-PCR擴增生成小RNA文庫，用Illumina HiSeqTM2000測序儀進行深度測序分析；對測序后所得的小RNA分子進行去接頭和去污染處理，用SOAP軟件將所得序列與人全基因組序列進行比對分析，除去重復序列、rRNA、tRNA, mRNA降解片段、scRNA、snoRNA、snRNA及piRNA，將剩下的序列與miRNA數(shù)據(jù)庫中人miRNA序列比對，得到兩組樣品已知miRNA的含量、表達豐度和染色體分布信息；分別對兩組樣本中的miRNA作歸一化處理,使每個miRNA的表達量處于同一個量級，其中，歸一化處理公式為歸一化表達量=(miRNA表達量/樣品總表達量)X 106 ;利用Audic and Claverie test統(tǒng)計學方法比較兩組樣本miRNA的表達差異,得到所述與唐氏綜合征21號染色體相關(guān)的miRNA差異表達圖譜模型，與健康對照組比較，miRNA差異表達圖譜模型由序列為SEQ ID NO.1的表達上調(diào)miRNA、序列為SEQ ID NO. 2、SEQ IDNO. 3、SEQ ID NO. 4 及 SEQ ID NO. 5 的表達下調(diào) miRNA 以及序列為 SEQ ID NO. 6、SEQ IDNO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ IDNO. 13及SEQ ID NO. 14的零表達miRNA構(gòu)成。通過Illumina深度測序技術(shù)對DS胎兒全基因組miRNA表達譜和染色體分布特征的研究，得到miRNA與DS全基因組基因表達紊亂之間的關(guān)系；差異顯著和特異表達的miRNA分子有助于了解DS疾病臨床表型發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控機制，為進一步研究DS患者全基因組基因表達紊亂及其與相關(guān)臨床癥狀的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。


圖1為健康對照組的各種小RNA匹配序列的比例分布圖，圖中other代表其它小RNA，下同；圖2為DS組的各種小RNA匹配序列的比例分布圖；圖3為21號染色體上14個編碼miRNA的PCR檢測結(jié)果圖，其中，control group表示健康對照組，DS group表示DS組,下同；圖4為miRNA編碼基因在兩組樣本中的染色體分布圖；圖5為兩組樣本中miRNA表達豐度的染色體分布圖。
具體實施例方式下面主要結(jié)合附圖及具體實施例對與唐氏綜合征21號染色體相關(guān)的miRNA差異表達圖譜模型、其應用及構(gòu)建方法作進一步詳細的說明。一實施方式的構(gòu)建方法、結(jié)果及相關(guān)檢測結(jié)果如下1.構(gòu)建1.1、樣本收集及胎兒臍帶血的采集和保存臍帶血標本由深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心遺傳室提供，標準型DS胎兒臍帶血6例(2男性，4女性)，正常胎兒臍帶血6例(2男性，4女性)，分別設(shè)為DS組和健康對照組。每例樣本均由常規(guī)G顯帶染色體核型分析確診，孕周18 22周，孕婦年齡30~34歲。該研究經(jīng)深圳市人民醫(yī)院倫理委員會批準，且征得所有孕婦知情同意。按照單個核細胞提取標準步驟,運用淋巴細胞分離液(Invitrogen公司)提取1mLEDTA抗凝臍帶血單個核細胞,溶入ImL TRIzol試劑(Invitrogen公司)混合均勻，置于凍存管中，凍存于一 80°C備用。1. 2、總 RNA 的提取將凍存樣本常溫下解凍，按照TRIzoI試劑盒(InvitiOgen公司)操作說明提取總RNA0 經(jīng) Agilent2000Bioanalyzer 分析儀檢測合格后(RIN 彡 8. O 且 28S/18S>1. 5)，用于small RNA建庫Illumina測序分析。1. 3、Small RNA 文庫構(gòu)建和 Illumina 測序用15%聚丙烯胺凝膠電泳(PAGE電泳)分離混合RNA樣本，回收純化18 30nt長度的小RNA分子。在T4RNA連接酶作用下，給小RNAs分子的加上SEQ ID NO. 15的接頭序列，3’端加上SEQ ID NO. 16的接頭序列，再由RT-PCR擴增生成small RNA文庫，運用IlluminaHiSeq 2000測序儀進行深度測序分析。文庫的構(gòu)建和測序均在深圳華大基因研究院的協(xié)助下完成。1. 4、Small RNA數(shù)據(jù)處理和注釋首先對Illumina測序所得序列進行去adaptor、去低質(zhì)量、去污染、去冗余等處理，獲得高質(zhì)量干凈序列并進行長度分布分析；再運用SOAP (2. O)軟件將高質(zhì)量干凈序列與相關(guān)數(shù)據(jù)庫(repeatmarker、genbank、rfam (10. 0)、UCSC和piRNA數(shù)據(jù)庫)進行序列比對分類注釋，分析過程中允許堿基錯配不 大于2個，以盡可能去除重復序列、rRNA、tRNA、mRNA降解片段、scRNA、snoRNA、snRNA及piRNA等非編碼RNA序列；再將余下序列與miRNA數(shù)據(jù)庫(miRBasel7. O)中人miRNA序列比對，獲取兩組樣本已知miRNA的含量、表達豐度和染色體分布等信息。1. 5、兩樣本miRNA表達差異比較首先對兩組樣本表達miRNA作歸一化處理，使每個miRNA的表達量處于同一個量級[公式歸一化表達量(TPM)= (miRNA表達量/樣品總表達量)XlO6];再利用Audic andClaverie test統(tǒng)計學方法比較兩組樣本miRNA的表達差異,并計算P值。若miRNA在兩組樣本間的倍比值> 2且P〈0. 001，該miRNA在兩組樣本間的表達差異顯著；對于歸一化后在兩組樣本中的表達量都小于IOTPM的miRNA不參與差異表達分析。1. 6、兩樣本miRNA染色體分布為研究兩組樣本表達miRNA編碼基因的染色體分布，根據(jù)miRBasel7. O人類miRNA注釋基因，作如下處理1)對miRNA基因表達產(chǎn)物作如上歸一化處理，使兩組樣本miRNA基因表達水平處于同一量級；2)篩除多染色體多位點miRNA編碼基因；3)若一個miRNA基因在兩組樣本中同時表達成熟體miRNA和miRNA* (miRNA* :miRNA功能單鏈的互補鏈)，或miRNA-5p和miRNA_3p (新的miRNA命名，分別位于同一 miRNA基因的5'端和3'端)，取兩者較高值進行統(tǒng)計。1. 7、stem-loop qRT-PCR 驗證提取各樣本總RNA等量混合，用含miRNA特異莖環(huán)引物的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega 公司)合成 cDNA,反應條件為 85°C 5111；[11、42。0 ΘΟη Γκδδ IOmin0 real-time PCR反應采用 SYBR green real-time PCR Kit (T0Y0B0 公司)在 ABT PR丨SM 7500PCR 儀上進行。以U6為內(nèi)參，95°C預反應5min后，在94°C 15s、60°C 15s、72°C 32s條件下，運行40個循環(huán)，重復3次。檢測結(jié)果采用2_法進行分析。
2.結(jié)果2·1、兩樣本small RNA數(shù)據(jù)處理和注釋DS組(以P表示)和健康對照組(以N表示)分別獲得高質(zhì)量干凈序列21770729(P)和17482100 (N)條，主要分布在22nt長度左右。其中分別有8087250 (P)和12536630(N)條序列與全基因組匹配，如圖1和圖2所示。兩組樣本表達miRNA/miRNA*序列共有395種編碼于316個miRNA基因，其中DS組miRNA表達序列243種(218種miRNA和25種miRNA*)，共計2208096條(約占28%);對照組miRNA表達序列349種(295種miRNA和54種miRNA*)，共計6369123條(約占51%)。在兩組樣本中都有表達的miRNA和miRNA*序列分別有178種和19種。2. 2、兩樣本miRNA表達譜的差異兩組樣本顯著差異表達的miRNA共有149種,如表I所不,其中有6種在DS組中表達上調(diào)，143種表達下調(diào)。此外，如表2所示,有51種miRNA特異性表達于對照組。如圖3所示為21號染色體上14個miRNA基因stem-loopqRT-PCR驗證結(jié)果，其中，P值小于O. 05，其中1-14號miRNA的序列分別如序列表中的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO. 14的miRNA序列所

表I歸一化后表達量大于1000TPM的差異表達miRNA/miRNA*
權(quán)利要求
1.一種與唐氏綜合征21號染色體相關(guān)的miRNA差異表達圖譜模型，其特征在于，與健康對照組比較，由序列為SEQ ID NO.1的表達上調(diào)miRNA、序列為SEQ ID NO. 2、SEQ IDNO. 3、SEQ ID NO. 4 及 SEQ ID NO. 5 的表達下調(diào) miRNA 以及序列為 SEQ ID NO. 6、SEQ IDNO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ IDNO. 10,SEQ ID NO.1USEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13及SEQ ID NO. 14的零表達miRNA構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求1所述的miRNA差異表達圖譜模型在制備診斷或檢測唐氏綜合征檢測試劑中的應用。
3.一種用于診斷或檢測唐氏綜合征患者的基因檢測芯片，其特征在于，包括用于檢測分類號為 miR-3118、miR-3156、miR-3197、miR-3648、miR-3687、miR-4327、miR-4759、miR-4760及miR-548x中至少一種miRNA的檢測探針，各所述分類號是國際miRNA數(shù)據(jù)庫的人類miRNA分類號。
4.一種與唐氏綜合征21號染色體相關(guān)的miRNA差異表達圖譜模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟 收集唐氏綜合征胎兒和健康胎兒的臍帶血單個核細胞樣品； 提取所述樣品中的總RNA，用15被％聚丙烯胺凝膠電泳分離所述總RNA，回收并純化長度為18 30nt的小RNA分子，在T4RNA連接酶的作用下，在回收的小RNA的5’端加上SEQID NO. 15的接頭序列，3’端加上SEQ ID NO. 16的接頭序列，再經(jīng)RT-PCR擴增生成小RNA文庫，用Illumina Hiseq 2000測序儀進行深度測序分析； 對測序后所得的小RNA分子進行去接頭和去污染處理，用SOAP軟件將所得序列與人全基因組序列進行比對分析，除去重復序列、rRNA、tRNA、mRNA降解片段、scRNA、snoRNA、snRNA及piRNA,將剩下的序列與miRNA數(shù)據(jù)庫中人miRNA序列比對,得到兩組樣品已知miRNA的含量、表達豐度和染色體分布信息； 分別對兩組樣本中的miRNA作歸一化處理，使每個miRNA的表達量處于同一個量級，其中，歸一化處理公式為歸一化表達量=OniRNA表達量/樣品總表達量)X IO6 ; 利用Audic and Claverie test統(tǒng)計學方法比較兩組樣本miRNA的表達差異,得到所述與唐氏綜合征21號染色體相關(guān)的miRNA差異表達圖譜模型，與健康對照組比較，miRNA差異表達圖譜模型由序列為SEQ ID NO.1的表達上調(diào)miRNA、序列為SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4 及 SEQ ID NO. 5 的表達下調(diào) miRNA 以及序列為 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQID NO. 9, SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO.1USEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 及SEQID NO. 14的零表達miRNA構(gòu)成。
全文摘要
通過Illumina深度測序技術(shù)對DS胎兒全基因組miRNA表達譜和染色體分布特征的研究，得到與唐氏綜合征21號染色體相關(guān)的miRNA差異表達圖譜模型，其由1個表達上調(diào)的miRNA、4個表達下調(diào)的miRNA和9個零表達的miRNA構(gòu)成。差異顯著和特異表達的miRNA分子有助于了解DS疾病臨床表型發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控機制，為進一步研究DS患者全基因組基因表達紊亂及其與相關(guān)臨床癥狀的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/68GK103045736SQ20121055523
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者徐勇, 李武縣, 戴勇 申請人:徐勇