天山雪蓮SikTrxh基因在植物抗逆中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種天山雪蓮SikTrxh基因在培育抗逆植物中的應(yīng)用，本發(fā)明從天山雪蓮中克隆SikTrxh基因，利用上述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗逆轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明從天山雪蓮中克隆SikTrxh基因，并在轉(zhuǎn)基因植物中得到表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性，通過該基因的過量表達(dá)，使植物對(duì)低溫、干旱、鹽以及氧化脅迫的抵抗性能得到提高，最終獲得抗逆能力明顯增強(qiáng)的植物。從天山雪蓮中篩選、克隆出與抗寒直接相關(guān)的基因，并將其用于農(nóng)作物品種改良，具有重要的學(xué)術(shù)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利說明】天山雪蓮SikTrxh基因在植物抗逆中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種從菊科鳳毛菊屬植物天山雪蓮(Saussurea involucrata Kar.etKir)中克隆得到SikTrxh基因，構(gòu)建組成型植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物，并對(duì)抗逆效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，增強(qiáng)植物的抗逆性。
【背景技術(shù)】:
[0002]低溫、干旱和鹽等非生物脅迫是影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。植物遭受非生物脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，直接損害植物細(xì)胞，使膜系統(tǒng)破壞，細(xì)胞脫水，從而影響細(xì)胞代謝。通常植物會(huì)通過調(diào)節(jié)自生抗氧化酶類來消除或減緩過多的ROS帶來的損害，而機(jī)體內(nèi)的硫氧還蛋白也是消除細(xì)胞過多ROS的重要成員(Xu WS, Ngo L, Perez G,Dokmanovic M，Marks PA(2006).1ntrinsicapoptotic and thioredoxin pathways inhuman prostate cancer cell response to histone deacetylase inhibitor.Proc NatlAcad Sci USA，103:15540-15545)。
[0003]目標(biāo)蛋白氧化還原的調(diào)節(jié)，越來越多的通過巰基二硫化的轉(zhuǎn)變而改變。硫氧還蛋白(Thioredoxins，Trxs)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的小分子穩(wěn)定類蛋白，在進(jìn)化中形成高度保守的氧化還原位點(diǎn)WCGPC，通過這兩個(gè)Cys殘基參與氧化還原反應(yīng)(HolmgrenA (1989).Thioredoxin and ghtaredoxinsystems.J Biol Chem，264:13963-13966)。高等植物包含兩類硫氧還蛋白系統(tǒng):鐵氧還蛋白/硫氧還蛋白系統(tǒng)(FTR/Trx)和NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTR/Trx)。前者是定位在葉綠體，由核編碼的硫氧還蛋白f和m組成，通過FTR提供電子將硫氧還蛋白還原；后者由硫氧還蛋白h組成，在非光合組織中通過NTR提供電子還原硫氧還蛋白(Buchanan, BB (1991).Regulation of CO2 assimilation inoxygenicphotosynthesis:the ferredoxin/thioredoxin system.Perspective on its discovery,present status andfuture development.Arch Biochem Biophys，288:1-9)。對(duì)擬南芥完整的基因組測(cè)序顯示，高等植物硫氧還蛋白屬于多基因家族，根據(jù)氨基酸序列同源性將硫氧還蛋白分為六大類(Trxf，Trxh, Trxm, Trxo, Trxx 和 Trxy)。Trxf，Trxm, Trxx 和 Trxy 定位在葉綠體，通過調(diào)節(jié)碳代謝相關(guān)酶活來參與磷酸戊糖和C4途徑(Gelhaye E，Rouhier N，Navrot N，Jacquot J P (2005).The plant thioredoxin system.Cell Mol LifeSci,62:24-35)。而Trxo定位在線粒體，具有調(diào)節(jié)線粒體的基本功能(Balmer，Y.，Vensel，I H.，Tanaka，C.K.，Hurkman, W.J.，Gelhaye, E.，Rouhier，N.，J acquot，J.P.，Manieri，W.，Schiirmann, P., Droux, M.，et al.，(2004).Thioredoxin links redox to the regulationof fundamental processes of plant mitochondria.PNAS,101(8):2642-2647)。
[0004]Trxh主要定位在細(xì)胞質(zhì)，但也發(fā)現(xiàn)存在于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核MarcusF，Chamberlain SH, ChuC，Masiarz FR，Shin S，Yee BC, Buchanan BB (1991).Plant thioredoxin h:an animal-like thioredoxinoccurring in multiple cellcompartments.Arch Biochem Biophys, 287:195-198 ；Ishiwatari Y，Honda C，KawashimaI，Nakamura S，Hirano H，Mori S，F(xiàn)ujiwara T，Hayashi H，Chino M(1995)Thioredoxin his oneof the major proteins in rice phloem sap.Planta，195:456-463 ;Serrato AJ,Cejudo F J (2003).Type-hthioredoxins accumulate in the nucleus of developingwheat seedt issues suffering oxidative stress.Planta，217:392-399)。早期認(rèn)為Trxh對(duì)種子的萌發(fā)和幼苗的發(fā)育起到重要作用(Marx C，Wong JH，BuchananBB (2003).Thioredoxin and germinating barley:targets and protein redox changes.Planta,216:454-460)，在大多數(shù)植物中也可做為信號(hào)蛋白(Schobert C，Baker L，SzederkenyiJ，Grossmann P，Komor E，HayashiH，Chino M，Lucas WJ (1998).1dentificationof immunologicalIy related proteins in sieve-tube exudatecoIlected frommonocotyledonous and dicotyledonous plants.Planta，206:245-252)。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究證明植物硫氧還蛋白是氧化脅迫應(yīng)答中的關(guān)鍵因素，而活性氧(ROS)可以誘導(dǎo)植物硫氧還蛋白基因的表達(dá)。例如擬南芥在氧化脅迫條件下，AtTrxh5的表達(dá)明顯增加(Laloi C，DominiqueMO, Marco Y，Meyer Y，Reichheld JP (2004).TheArabidopsis cytosolic thioredoxin h5 geneinduction byoxidative stress and itsW-box-mediated response to pathogen elicitor.Plant Physiol，134:1006-1016)。甲基紫精處理水稻幼苗也增加了 OsTrxh的轉(zhuǎn)錄水平(Tsukamoto SiMorita SiHira no EiYokoiHiMasumura T，Tanaka K (2005).A novel cis-element tha is respon-sive to oxidativestress regulat es three antioxidantdefense genes in rice.Plant Physiol,137(I):317-327) o AtTrxt^可做為分子伴侶增強(qiáng)擬南芥熱休克(PariiSK，Jung YJ，Lee JR，Le eYM, Jang HH, Lee SS, Park JH, Kim SY, Moon JC, Lee SY, et al (2009).Heat-shock andredox-dependent functional switching of an h-type Arabidopsis thioredoxin froma disulfidereductase to a molecular chaperone.Plant Physiol，150:552-561)。擬南芥中還存在一類基質(zhì)蛋白CDSP32，它包含2個(gè)硫氧還蛋白活性位點(diǎn)，在質(zhì)體抵抗氧化脅迫中起重要作用(Broin M，Cuine S，Eymery F，Rey P (2002).The plastidic 2-cysteineperox-1redoxin is a target for a thioredoxin involved in theprotection of thephotosynthetic apparatus against oxidative damage.Plant Cell，14: 1417-1432)。此外，硫氧還蛋白還參與調(diào)節(jié)SOD、CAT、GLP等酶活，保護(hù)植物減緩氧化脅迫的損傷。在體外，OsTRXhl也同樣具有活性，它能夠?qū)^氧化氫敏感的Trx缺失酵母突變體重新獲得抗性(Zhang CJ, Zhao BC, GeWN, Zhang YF, Song Y，Sun DY，and Guo Y (2011).An ApoplasticH-Type Thioredoxin Is Involved in theStress Response through Regulation of theApoplastic Reactive Oxygen Species in Rice.Plant Physiology, 157:1884-1899)。
[0005]作為新疆的特色植物，新疆雪蓮(Saussurea involucrata Kar.et Kir)，又名天山雪蓮、雪蓮花等。屬菊科鳳毛菊屬，主要生長(zhǎng)于海拔2400~4100m的高山草甸、高山冰磧石和流石灘石隙、懸崖峭壁石縫等處。那里氣候多變，冷熱無常，雨雪交替，最高月平均溫3~5°C，最低月平均溫-19~_21°C，年降水量約800毫米，無霜期僅有50天左右。
[0006]天山雪蓮經(jīng)過長(zhǎng)期的自然選擇，形成了穩(wěn)定的特殊結(jié)構(gòu)、功能和遺傳基因，產(chǎn)生了適應(yīng)極端環(huán)境條件下的生理和生化機(jī)制，這種與環(huán)境相適應(yīng)的機(jī)制，與一般的耐冷、抗寒應(yīng)答性的適應(yīng)機(jī)制不同，主要表現(xiàn)在其低溫條件下能夠正常的生長(zhǎng)發(fā)育，而一般的抗寒性植物在相應(yīng)的低溫條件下，生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制。近年來植物抗寒基因工程得到迅速發(fā)展，并研究出了多種轉(zhuǎn)基因抗寒植物，為培育抗寒植物開辟了新途徑。雪蓮生活在極端環(huán)境中，是一種極好的抗寒基因的資源，至今，國(guó)內(nèi)外對(duì)雪蓮硫氧還蛋白的研究還未見文獻(xiàn)報(bào)道。利用這種具有特色稀有植物，從中篩選、克隆出與抗寒乃至更多抗逆直接相關(guān)的基因，揭示雪蓮適應(yīng)性的機(jī)制，研究其遺傳基礎(chǔ)，充分發(fā)掘其潛在的基因資源，并將其用于表作物品種改良，具有巨大的學(xué)術(shù)和經(jīng)擠價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0007]在前期的研究中，我們利用GateWay技術(shù)構(gòu)建的低溫脅迫下天山雪蓮葉片組織的cDNA文庫(kù)，從天山雪蓮文庫(kù)中篩選克隆到了天山雪蓮硫氧還蛋白基因SikTrxh。為了研究該基因的功能，我們構(gòu)建了該基因的植物表達(dá)載體，并將此基因?qū)霟煵葜?，提高植物的抗逆性?br> [0008]本發(fā)明的一個(gè)目的是為植物抗逆育種提供有價(jià)值的天山雪蓮硫氧還蛋白基因SikTrxh，其發(fā)明目的還在于構(gòu)建植物表達(dá)載體:PBI121-SikTrxh，在轉(zhuǎn)基因植物中得到表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植物的抗寒性、抗旱性和耐鹽性，通過該基因的過量表達(dá)，使植物的抗逆脅迫性能得到提高，最終獲得抗寒性、抗旱性和耐鹽性能力明顯增強(qiáng)的植物。
[0009]本發(fā)明的目的是通過以下過程和方法實(shí)現(xiàn)的:
[0010]本發(fā)明所述的從天山雪蓮中克隆SikTrxh基因，其序列為〈210>1。
[0011]本發(fā)明的從天山雪蓮中克隆SikTrxh基因的過程如下:
[0012]提取經(jīng)低溫處理的天山雪蓮RNA，并以RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，利用Primer5.0設(shè)計(jì)分別帶有 BamHI和SacI的PCR引物Pl和P2進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的基因；
[0013]構(gòu)建SikTrxh基因植物表達(dá)載體pBI121_SikTrxh ；
[0014]利用上述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植物:
[0015]將生長(zhǎng)在光照培養(yǎng)室中2個(gè)月的對(duì)照植株和2種不同株系的轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)低溫、干旱、鹽脅迫處理，分別剪取葉片進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定，所有實(shí)驗(yàn)每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次。
[0016]低溫脅迫試驗(yàn)中，隨著溫度的下降，轉(zhuǎn)SikTrxh基因煙草的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量始終低于對(duì)照組煙草，且上升趨勢(shì)小于對(duì)照組煙草，傷害率較對(duì)照低；S0D、CAT、APX酶活力呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。轉(zhuǎn)SikTrxh基因煙草在低溫脅迫下表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒性。
[0017]在200mmol.T1NaCl脅迫中，轉(zhuǎn)SikTrxh基因煙草的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量始終低于對(duì)照組煙草，且上升趨勢(shì)小于對(duì)照組煙草，傷害率較對(duì)照低；S0D、CAT、APX酶活力呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。轉(zhuǎn)SikTrxh基因煙草在鹽脅迫下表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗鹽性。
[0018]干旱脅迫試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)SikTrxh基因煙草的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量始終低于對(duì)照組煙草，且上升趨勢(shì)小于對(duì)照組煙草，傷害率較對(duì)照低；S0D、CAT、APX酶活力呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。轉(zhuǎn)SikTrxh基因煙草在干旱脅迫下表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性。
[0019]轉(zhuǎn)天山雪蓮硫氧還蛋白基因SikTrxh煙草的抗逆功能研究表明，轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)低溫、高鹽和干旱都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗性水平。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0020]圖1 是天山雪蓮 SikTrxh 基因 PCR 擴(kuò)增圖 Figl:SikTrxh gene PCR amplified
[0021]圖 2 是 pGM-SikTrxh PCR 鑒定圖Fig2:PCR identification ofpGM-SikTrxh
[0022]圖 3 是 SikTrxh 進(jìn)化分析圖Fig3:Phylogenetic analysis SikTrxh
[0023]圖 4 是 pBI121-SikTrxh PCR 鑒定Fig4:PCR identification ofpBI121-SikTrxh
[0024]圖 5 是 pBI121_SikTrxh 酶切鑒定Fig5 !Restriction enzyme digestionidentification of pBI121_SikTrxh
[0025]圖 6 是轉(zhuǎn)化 GV3101PCR 鑒定Fig6:PCR identification ofpBI121-SikTrxh-GV3101
[0026]圖7 是轉(zhuǎn)化煙草 PCR 檢測(cè)Fig7:PCR identification oftransformed tobacco
[0027]圖8 是轉(zhuǎn)基因煙草 RT-PCR分析Fig8:RT_PCR analysis on transgenictobacco
[0028]圖9是低溫、鹽和干旱脅迫下煙草葉片相對(duì)電導(dǎo)率 Fig9:Change of relativeelectric conductivity intobacco leaves under low temperature， salt and droughtstress
[0029]圖10是低溫、鹽和干旱脅迫下煙草葉片MDA含量 Fig.10:Change of MDAcontent in tobaccoleaves under low temperature， salt and drought stress
[0030]圖11是低溫、 鹽和干旱脅迫下煙草葉片SOD酶活性、APX酶活性和CAT酶活性Fig.11:Changesof SOD activity, APX activity and CAT activity in tobacco leavesunder low temperature, salt and droughtstress
[0031]圖12是pBI121_SikTrxh的植物表達(dá)載體構(gòu)建流程圖
[0032]圖1 中:
[0033]1:陰性對(duì)照；2:SikTrxh ；M:Marker I
[0034]圖2 中:
[0035]1-8:pGM-SikTrxh ；9:陰性對(duì)照；10:陽(yáng)性對(duì)照；M =Marker I
[0036]圖4 中:
[0037]1:陽(yáng)性對(duì)照；2:pBI121-SikTrxh ；M =Marker I
[0038]圖5 中:
[0039]1,2:pBI121-SikTrxh ；3:陰性對(duì)照；M =Marker I
[0040]圖6 中:
[0041]1-12:pBI121-SikTrxh-GV3101 ；13:陽(yáng)性對(duì)照；14:陰性對(duì)照；M =MarkerIII
[0042]圖7 中:
[0043]1-8:煙草DNA PCR產(chǎn)物；9:陽(yáng)性對(duì)照；10:空白煙草對(duì)照；M =MarkerIII
[0044]圖8 中: [0045]1:陽(yáng)性對(duì)照；2:空白煙草對(duì)照；4，5，6，8，10:煙草cDNA PCR產(chǎn)物；M =MarkerIII【具體實(shí)施方式】:
[0046]實(shí)驗(yàn)所涉及的藥品瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為北京康為世紀(jì)公司生產(chǎn)；M_MLV酶購(gòu)自 TaKaRa 公司；RNA 酶、Taq 酶、pGM_T、T4-DNA 連接酶(T4-DNA ligase)、Marker、TRNzol總RNA提取試劑購(gòu)于TIANGEN公司；BamH1、SalI等限制性內(nèi)切酶為Fermentas公司原裝；IPTG、X-gaI及抗生素、植物激素購(gòu)自上海Sangon公司；其他試劑及配制MS培養(yǎng)基的各種試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。具體實(shí)驗(yàn)操作依據(jù)[美]J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。
[0047]實(shí)施例1:從天山雪蓮中克隆到SikTrxh基因
[0048]1.1天山雪蓮總mRNA的提取
[0049]1)將研缽及所用的器具在180°C烘箱烘烤6hr以上，其余所使用的槍頭、離心管均使用0.1 %的DEPC處理，高壓滅菌；
[0050]2)取植物幼嫩葉片約0.1g于研缽中，加液氮充分研磨至粉末狀；
[0051]3)將粉末分裝至1.5mL的小離心管中，加入1ml的TRNzol提取試劑，充分快速混勻，室溫放置3-5min。
[0052]4) 10000rpm,4°C離心5min,吸上清至一新的離心管,加入200 μ I氯仿,劇烈振蕩混勻；
[0053]5) 10000rpm，4°C離心5min，吸取上層液體至另一新的離心管后，加入600 μ I預(yù)冷的異丙醇，于-2011C沉淀30min ；
[0054]6) 10000rpm，4°C離心10min后，倒掉液體，在離心管底部即可見到白色沉淀，即為總 RNA。
[0055]7)用70%的乙醇(DEPC處理)洗滌沉淀2次后，吸干液體，吹干后加入30 μ IddH20 (DEPC處理)溶解，保存于_20°C備用。
[0056]1.2cDNA第一鏈的合成
[0057]在DEPC 處理的 0.2ml 離心管中加入 RNA 5 μ 1，Oligo dT 2 μ 1，ddH20 5 μ I 后，在75°C水浴IOmin后迅速置于冰上2min。然后在離心管中加入dNTP(2.5mmol/L) 2ul,Rnase Inhibitor I μ 1，M-MLV-RT 反轉(zhuǎn)錄酶 I μ 1，DEPC ddH20 5ul,42°C lhr,70°C 15min后，-20°C保存。
[0058]1.3cDNA第二鏈的合成及擴(kuò)增
[0059]在PCR反應(yīng)管中加入cDNA第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物，用Pl和P2為引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)以去離子水為模板作為陰性對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增。
[0060]P1 為:5 ’ -GGATCC AAAATGGCGGAAGAAGGA-3，
[0061]BamHI
[0062]P2:為:5，-GAGCTC GGAAACACATAAGTTGCT-3 ’
[0063]Sacl
[0064]PCR 反應(yīng)體系(20 μ I)為:
[0065]
【權(quán)利要求】
1.一種從天山雪蓮中克隆的SikTrxh基因，其序列為〈210>1，其特征在于該基因編碼區(qū)全長(zhǎng)354bp，編碼117個(gè)氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述核苷酸序列構(gòu)建的植物表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述核苷酸序列的用途，其特征在于利用上述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得的抗逆轉(zhuǎn)基因植物 。
【文檔編號(hào)】C12N9/02GK103882036SQ201210556121
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月20日
【發(fā)明者】祝建波, 劉超, 王愛英, 沈海濤, 馮玉杰 申請(qǐng)人:石河子大學(xué)