專利名稱：促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物分離培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基及誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海洋和鹽湖中微生物系的重要成員，主要存在于海水、海底沉積污泥、魚貝類產(chǎn)品和鹽潰食品中，是一種重要的食源性致病菌。此菌存活能力強(qiáng)，在抹布和砧板上能生存I個(gè)月以上，海水中可存活47d。臨床上以腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀，多在夏秋季發(fā)生于沿海地區(qū)，常造成集體發(fā)病。近年來，由于海鮮空運(yùn)，內(nèi)地城市病例也逐漸增多，由副溶血弧菌引起的食物中毒事件呈現(xiàn)顯著的上升趨勢(shì)，它的檢出率也具有明顯的季節(jié)性，在夏秋季溫暖的季節(jié)容易檢出，而在冬季寒冷的季節(jié)則檢出率比較低。最新研究發(fā)現(xiàn)，食源致病細(xì)菌在外界環(huán)境的刺激下，生命體征會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)入一種特殊的自我保護(hù)生存狀態(tài)，活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(Viable But Nonculturable State,VBNC)。處于該狀態(tài)下，致病細(xì)菌體積不斷縮小，表面積與體積之比擴(kuò)大，提高了對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的親和力，不但可以忍受饑餓的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，而且增強(qiáng)了對(duì)其他環(huán)境脅迫因子如防腐劑、溫度沖擊、氧化環(huán)境、滲透壓改變等的保護(hù)能力。處于VBNC狀態(tài)下的細(xì)菌，其最大的特點(diǎn)就是喪失了平板上的生長(zhǎng)繁殖能力，但生命體征是活的，并且保留原菌的毒力和致病性。所以，VBNC狀態(tài)的食源細(xì)菌在適合生長(zhǎng)條件下能夠恢復(fù)生長(zhǎng)繁殖，很快達(dá)到致病劑量，成為逃避檢測(cè)的“隱性傳染源”，對(duì)食品安全構(gòu)成潛在威脅。副溶血弧菌在不同的貯藏環(huán)境以及寒冷的外界刺激下也會(huì)發(fā)生生命特征的改變，進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)。研究副溶 血弧菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的生理、生化以及遺傳因子等方面的生物學(xué)特性，對(duì)于食品安全檢測(cè)、預(yù)防食物的二次生物污染具有重要的實(shí)際意義。而在科學(xué)研究過程中，活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的人工培養(yǎng)獲得是首要因素，現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，利用低溫結(jié)合寡營(yíng)養(yǎng)條件，誘導(dǎo)正常的副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)需要半個(gè)月月甚至更長(zhǎng)的時(shí)間，這無疑增加了科研成本、拖緩了科研進(jìn)度。因此，發(fā)明一種加快副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的方法對(duì)于提升研究此種狀態(tài)細(xì)菌的進(jìn)度起到非常積極的促進(jìn)作用，而且對(duì)于其他的食源致病細(xì)菌的非可培養(yǎng)狀態(tài)的研究也起到重要的實(shí)驗(yàn)參考。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基。本發(fā)明的另一目的在于提供一種促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的誘導(dǎo)方法。本發(fā)明利用具有一定濃度的食品防腐劑山梨酸鉀結(jié)合低溫條件，能夠在短時(shí)間內(nèi)促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一種促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基，其配方為每1000mL培養(yǎng)基包含如下組分蛋白胨5 15g，牛肉膏1 5g，氯化鈉20 40g，山梨酸鉀0.1 lg，力口蒸懼水至1000mL,調(diào)節(jié)pH為5 8。優(yōu)選的，所述的促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基，其配方為每1000mL培養(yǎng)基包含如下組分蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉30g，山梨酸鉀0.1 lg，加蒸餾水至1000mL,調(diào)節(jié)pH為7. 4。以上培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，如配制固體培養(yǎng)基，還需在上述配方中加15 20g瓊脂。一種促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的誘導(dǎo)方法，包含如下步驟將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的副溶血弧菌接種到上述(液體)培養(yǎng)基中，-10 -20°c靜置誘導(dǎo)至副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)。所述的靜置誘導(dǎo)優(yōu)選為-1CTC靜置誘導(dǎo)105h。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果(1)本發(fā)明提供的促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基配制簡(jiǎn)單。(2)本發(fā)明促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的方法，誘導(dǎo)時(shí)間短，僅為105h,大大節(jié)約科研成本。


圖1是副溶血弧菌在誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用下的存活曲線圖。圖2是熒光顯微鏡下正常狀態(tài)與活的非可培養(yǎng)狀態(tài)副溶血弧菌的形態(tài)特征圖；A 正常狀態(tài)副溶血弧菌B =VBNC狀態(tài)副溶血弧菌。圖3是掃描電鏡下正常狀態(tài)與活的非可培養(yǎng)狀態(tài)副溶血弧菌的形態(tài)特征圖；A :正常狀態(tài)副溶血弧菌B =VBNC狀態(tài)副溶血弧菌。圖4是透射電鏡下正常狀態(tài)與活的非可培養(yǎng)狀態(tài)副溶血弧菌的形態(tài)特征圖；A :正常狀態(tài)副溶血弧菌B =VBNC狀態(tài)副溶血弧菌。圖5是副溶血弧菌在_20°C誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下的存活曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1(1)促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基的配制稱取蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉30g，山梨酸鉀0. lg，加蒸餾水至1000mL,用1MHCl和1M Na0H調(diào)節(jié)pH為7. 4，于121 °C、1. 05MPa滅菌15m1n得到促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活
的非可培養(yǎng)狀態(tài)的液體培養(yǎng)基。稱取蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉30g，山梨酸鉀0. lg，瓊脂15g加蒸餾水至1000mL, 1M HCl和1M Na0H調(diào)節(jié)pH為7. 4，于121°C、1. 05MPa滅菌15m1n得到促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的固體培養(yǎng)基。(2)副溶血弧菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的快速誘導(dǎo)
I)將副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株GMCC1. 1614 (購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心)接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。2)吸取IO7 108CFU/mL的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的菌液ImL到1. 5mL離心管中，4°C、5000r/min離心5min,棄上清,收集沉淀后,用ImL滅菌蒸懼水溶解。3)將溶解的菌液接種于200mL實(shí)施例1配制的液體培養(yǎng)基(誘導(dǎo)培養(yǎng)基)中，搖勻，-10°c靜置誘導(dǎo)。同時(shí)，與傳統(tǒng)方法做比較，傳統(tǒng)方法1:將溶解的菌液注入到200mL滅菌的陳海水中，混勻，靜置于4°C誘導(dǎo)；傳統(tǒng)方法2 :將溶解的菌液注入到200mL鹽度O. 5%的水溶液中，混勻，靜置于4 °C誘導(dǎo)。4)對(duì)初始菌液濃度進(jìn)行計(jì)數(shù)，每隔IOh取樣，選擇合適稀釋度的菌懸液IOOyL涂布2216E平板，30°C培養(yǎng)，次日觀察計(jì)數(shù)；當(dāng)無菌落生長(zhǎng)時(shí)，加大接種量；連續(xù)培養(yǎng)105h后，均無菌落生長(zhǎng)，副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)。三種方法的誘導(dǎo)結(jié)果如圖1所示。5)結(jié)合吖啶橙熒光顯微鏡計(jì)數(shù)法進(jìn)行判斷取ImL帶菌樣品于1. 5mL的離心管中，加入2wt%的甲醛(終濃度)使之固定。在避光的條件下加入濃度為O. lwt%的吖啶橙溶液1(^1^，避光染色51^11。吸取10 μ L混合液于潔凈的載玻片上，蓋上蓋玻片；熒光顯微鏡于480nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀察，進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)測(cè)定，并選擇典型的細(xì)胞拍照觀察，結(jié)果如圖2所示(A :正常狀態(tài)的副溶血弧菌GMCC1. 1614，B :進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的副溶血弧菌GMCC1. 1614 ;活的菌發(fā)出綠色熒光，而死菌是發(fā)出紅色的熒光。)，表明菌液中存在大量呈綠色熒光的活細(xì)胞。利用掃描電鏡和透射電鏡觀察此時(shí)的菌體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變，由原來正常狀態(tài)的弧形，轉(zhuǎn)變成了圓形，結(jié)果如圖3、4所示(A:正常狀態(tài)的副溶血弧菌GMCC1. 1614，B :進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的副溶血弧菌GMCC1. 1614。)。實(shí)施例2(I)促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基的配制稱取蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉30g，山梨酸鉀lg，加蒸餾水至IOOOmL,用IMHCl和IM NaOH調(diào)節(jié)pH為7. 4，于121°C、1. 05MPa滅菌15min得到促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的液體培養(yǎng)基。稱取蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉30g，山梨酸鉀lg，瓊脂20g加蒸餾水至IOOOmL, IM HCl和IM NaOH調(diào)節(jié)pH為7. 4，于121。。、1. 05MPa滅菌15min得到促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的固體培養(yǎng)基。(2)副溶血弧菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的快速誘導(dǎo)按照實(shí)施例1 (2)的方法使用實(shí)施例2配制的液體培養(yǎng)基在_20°C進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果如圖5，105h后副溶血弧菌涂布平板可培養(yǎng)菌數(shù)目降為0，而吖啶橙染色直接計(jì)數(shù)法顯示，活菌的濃度仍保持在IOVmL以上，說明副溶血弧菌在_20°C誘導(dǎo)105h后成功進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)。上述結(jié)果表明，利用本發(fā)明的培養(yǎng)基和誘導(dǎo)方法105h后成功誘導(dǎo)副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株GMCC1. 1614進(jìn)入了活的非可培養(yǎng)狀態(tài)。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的 精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基的配方為每IOOOmL培養(yǎng)基包含如下組分蛋白胨5 15g，牛肉膏I 5g，氯化鈉20 40g，山梨酸鉀O.1 Ig,加蒸懼水至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH為5 8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基的配方為每IOOOmL培養(yǎng)基包含如下組分蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉30g,山梨酸鉀O.1 Ig,加蒸餾水至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH為7. 4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基的配方為每IOOOmL培養(yǎng)基還包含15 20g瓊脂。
4.一種促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的誘導(dǎo)方法，其特征在于包括如下步驟將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的副溶血弧菌接種到權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基中，-10 _20°C靜置 誘導(dǎo)至副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的誘導(dǎo)方法，其特征在于所述的靜置誘導(dǎo)為-10°C靜置誘導(dǎo)105h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基及方法，屬于微生物分離培養(yǎng)領(lǐng)域。促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基其配方為每1000mL培養(yǎng)基包含如下組分蛋白胨5～15g，牛肉膏1～5g，氯化鈉20～40g，山梨酸鉀0.1～1g，加蒸餾水至1000mL，調(diào)節(jié)pH為5～8。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的副溶血弧菌接種到上述培養(yǎng)基中，-10～-20℃靜置誘導(dǎo)105h后副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)。本發(fā)明提供的促進(jìn)副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基配制簡(jiǎn)單，使副溶血弧菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的誘導(dǎo)時(shí)間短，大大節(jié)約了科研成本。
文檔編號(hào)C12R1/63GK103060230SQ201210556338
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者王麗, 鐘青萍, 陳穎翹 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)