專利名稱：Tcrp1基因在制備腫瘤細(xì)胞鉑類耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地講，涉及TCRPl基因在制備腫瘤細(xì)胞鉬類耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的新用途。
背景技術(shù)：
自1967年發(fā)現(xiàn)順鉬(cisplatin )具有抗腫瘤活性以來(lái)，鉬類金屬抗腫瘤藥物的合成、應(yīng)用和研究得到了迅速的發(fā)展，目前其發(fā)展已經(jīng)歷了三代順鉬、卡鉬和奧沙利鉬。憑借其良好的療效，鉬類藥物已被廣泛應(yīng)用于多種惡性實(shí)體腫瘤的一線治療，如卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、肺癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌等頭頸部實(shí)體瘤，成為癌癥化療不可或缺的藥物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在中國(guó)以鉬類藥物為主或有其參加配伍的化療方案占所有化療方案的70%-80%。但腫瘤細(xì)胞對(duì)鉬類藥物耐藥性的產(chǎn)生常使化療難以奏效并最終導(dǎo)致化療失敗。因此研究鉬類藥物耐藥分子機(jī)制及尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的靶點(diǎn)已成為目前腫瘤治療研究中的一個(gè)焦點(diǎn)。腫瘤鉬類耐藥的產(chǎn)生是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，其耐藥機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。目前認(rèn)為耐藥的主要機(jī)制有1.胞內(nèi)藥物蓄積減少。包括胞內(nèi)藥物攝取減少和藥物排出增多。如與攝取鉬類藥物相關(guān)的膜蛋白CTRl (copper transporter I)的表達(dá)降低；與藥物排出相關(guān)的多藥耐藥蛋白，MDR、MRP2、ATP7A/7B等表達(dá)增高。2.活化減少，失活增加。一些內(nèi)生的親核物質(zhì)，如谷胱甘肽，蛋氨酸和金屬硫蛋白能與鉬類藥物結(jié)合導(dǎo)致其在體內(nèi)失活。3. DNA修復(fù)能力增強(qiáng)。如DNA修復(fù)系統(tǒng)蛋白ERCCl、BRCA1/BRCA2的活性與鉬類藥物敏感性負(fù)相關(guān)。4.鉬類藥物對(duì)細(xì)胞損傷能力減弱。如p53基因的突變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡抑制，存活能力增強(qiáng)。5. DNA甲基化以及信號(hào)傳導(dǎo)通路異常等。TCRPl (Tongue Cancer Resistance-associated Protein I )基因是本課題組前期在分析自主建立的多藥耐藥 細(xì)胞株人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113/PYM (對(duì)平陽(yáng)霉素、順鉬、奧沙利鉬等耐藥，耐藥指數(shù)RI>18)與其親本敏感細(xì)胞株Tca8113的cDNA芯片結(jié)果時(shí)，得到一個(gè)新的EST序列。通過(guò)利用生物信息學(xué)分析技術(shù)，申請(qǐng)人對(duì)這一個(gè)EST序列(GenBank ID:AL707095; UniGene Cluster ID:Hs475334)進(jìn)行 Blast 延伸拼接分析，結(jié)合 PCR 擴(kuò)增，得到一個(gè)全長(zhǎng)cDNA序列，命名為T(mén)CRPl基因(NCBI提交號(hào)EF363480)。TCRPl 基因位于人類染色體 Ilql3. 4 (NCBI Human Genome Project database,Build37. 3)也命名為 FAM168A 或者 KIAA0280。其于 1996 被日本 Kazusa DNA ResearchInstitute報(bào)道為預(yù)測(cè)基因，命名為KIAA0280，但生物學(xué)功能一直不明。TCRPl在NCBIBuild 37.3中確定其mRNA全長(zhǎng)為1834bp，共8個(gè)外顯子，預(yù)測(cè)可轉(zhuǎn)錄編碼235個(gè)氨基酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供TCRPl基因作為腫瘤細(xì)胞鉬類耐藥逆轉(zhuǎn)劑的新的應(yīng)用，為腫瘤耐藥機(jī)制提供新的資料，并且為抗腫瘤耐藥藥物的設(shè)計(jì)和篩選提供了新的靶點(diǎn)。具體的講，我們利用RT-PCR和Western blot發(fā)現(xiàn)TCRPl在多種繼發(fā)性鉬類耐藥細(xì)胞株(A549/DDP、COCI/DDP, Tca8113/PYM)表達(dá)相對(duì)于其親本敏感細(xì)胞株升高，在肺癌原發(fā)性鉬類耐藥細(xì)胞株95D中也明顯高于其他鉬類敏感肺癌細(xì)胞株。進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)利用SiRNA干擾技術(shù)，通過(guò)降低TCRPl的表達(dá)水平可逆轉(zhuǎn)繼發(fā)性和原發(fā)性耐藥細(xì)胞株對(duì)鉬類藥物的反應(yīng)，增強(qiáng)其對(duì)鉬類藥物(順鉬、奧沙利鉬)的敏感性。因此首次提出TCRPl基因是腫瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)基因，主要為鉬類耐藥相關(guān)基因。另外TCRPl的siRNAs分子可作為腫瘤細(xì)胞鉬類耐藥逆轉(zhuǎn)劑，在逆轉(zhuǎn)腫瘤鉬類耐藥性中發(fā)揮重要作用。此外本發(fā)明還涉及該核酸分子TCRPl的抗體制備，包含TCRPl核酸分子的重組表達(dá)載體。發(fā)明保護(hù)了 TCRPl基因在制備腫瘤細(xì)胞鉬類耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用，所述的TCRPl基因的序列如SEQ ID NO:1所不；
以及TCRPl多肽在制備腫瘤細(xì)胞鉬類耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用，所述的TCRPl多肽的序列如 SEQ ID NO:2 所示；
以及TCRPl基因抑制劑在制備腫瘤細(xì)胞鉬類耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用；
以及TCRPl基因的干擾siRNAs在制備腫瘤細(xì)胞鉬類耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。上述的干擾siRNAs的核苷酸序列如SEQ ID NO:3。上述的逆轉(zhuǎn)劑為原發(fā)性腫瘤細(xì)胞鉬類耐藥逆轉(zhuǎn)劑或繼發(fā)性腫瘤細(xì)胞鉬類耐藥逆轉(zhuǎn)劑。優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為實(shí)體瘤細(xì)胞。優(yōu)選地，所述的腫瘤細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、和/或舌鱗癌細(xì)胞。作為優(yōu)選的方案 ，所述腫瘤細(xì)胞為繼發(fā)性鉬類耐藥細(xì)胞株肺癌A549/DDP、卵巢癌Cocl/DDP和舌癌Tca8113/PYM ;或原發(fā)性鉬類肺癌耐藥細(xì)胞株95D ；
優(yōu)選地，鉬類藥物為順鉬和奧沙利鉬。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在
TCRPl不僅在鉬類繼發(fā)性耐藥腫瘤細(xì)胞株A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM表達(dá)升高，也在原發(fā)性鉬類耐藥細(xì)胞株，如肺癌％D細(xì)胞中表達(dá)明顯高于肺癌其他敏感細(xì)胞株。降低TCRPl基因的表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞株對(duì)鉬類藥物的敏感性。該基因定位于人染色體llql3. 4，序列全才1834bp，開(kāi)放讀碼框708 bp，編碼235個(gè)氨基酸。本發(fā)明不僅為腫瘤耐藥機(jī)制提供新的資料，而且為抗腫瘤耐藥藥物的設(shè)計(jì)提供了新的靶點(diǎn)。本發(fā)明的TCRPl基因可作為抗鉬類耐藥腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)，進(jìn)行抗腫瘤耐藥的設(shè)計(jì)和抗耐藥腫瘤治療。以這一基因?yàn)榘悬c(diǎn)，在基因水平上和蛋白水平上設(shè)計(jì)新的化學(xué)實(shí)體，避免腫瘤細(xì)胞鉬類耐藥的產(chǎn)生或者逆轉(zhuǎn)已經(jīng)產(chǎn)生的耐藥性，從而提高治療的療效。


圖1為繼發(fā)性耐藥腫瘤細(xì)胞株肺癌A549/DDP、卵巢癌Cocl/ DDP、舌鱗癌Tca8113/PYM、乳腺癌MCF7/5Fu，對(duì)順鉬耐藥性的檢測(cè)圖，顯示A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM繼發(fā)性耐藥細(xì)胞株，相對(duì)各自敏感細(xì)胞株A549、Cocl、Tca8113，對(duì)順鉬有強(qiáng)的耐藥抵抗性，而乳腺癌MCF7/5FU對(duì)順鉬敏感，無(wú)耐藥性。圖2為繼發(fā)性耐藥腫瘤細(xì)胞株肺癌A549/DDP、卵巢癌Cocl/ DDP、舌鱗癌Tca8113/PYM、乳腺癌MCF7/5Fu，對(duì)奧沙利鉬耐藥性的檢測(cè)圖，顯示A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM繼發(fā)性耐藥細(xì)胞株，相對(duì)各自敏感細(xì)胞株A549、Cocl、Tca8113，對(duì)奧沙利鉬有強(qiáng)的耐藥抵抗性，而乳腺癌MCF7/5FU對(duì)奧沙利鉬敏感，無(wú)耐藥性。圖3為T(mén)CRPl在繼發(fā)性耐藥腫瘤細(xì)胞株中表達(dá)量；
A :TCRP1基因的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)圖，顯示TCRPl在mRNA水平上，在順鉬和奧沙利鉬耐藥性強(qiáng)的繼發(fā)性腫瘤耐藥細(xì)胞株A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM表達(dá)水平高于各自敏感株，而在對(duì)順鉬和奧沙利鉬無(wú)耐藥性的MCF7/5FU中TCRPl的表達(dá)沒(méi)有改變；
B: Western Blot檢測(cè)圖，顯示TCRPl在蛋白水平上，在順鉬和奧沙利鉬耐藥性強(qiáng)的繼發(fā)性腫瘤耐藥細(xì)胞株A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM表達(dá)高于各自敏感株，而在對(duì)順鉬和奧沙利鉬無(wú)耐藥性的MCF7/5FU中TCRPl的表達(dá)沒(méi)有改變。圖4為siRNAs干擾TCRPl后可逆轉(zhuǎn)繼發(fā)性耐藥腫瘤細(xì)胞株對(duì)鉬類藥物的敏感性；
A C0C1/DDP, A549/DDP 和 Tca8113/PYM 中 siRNA 干擾組(-sitcrpl)與對(duì)照組(-con)比較，干擾組對(duì)順鉬的藥物敏感性增強(qiáng)；
B C0C I/DDP, A549/DDP和Tca8113/PYM中siRNA干擾組與對(duì)照組比較，干擾組對(duì)順鉬的IC50值減?。?br> C C0C I/DDP, A549/DDP和Tca8113/PYM中siRNA干擾組與對(duì)照組比較，干擾組對(duì)順鉬的藥物敏感性增強(qiáng)；D C0C I/DDP, A549/DDP和Tca8113/PYM中siRNA干擾組與對(duì)照組比較，干擾組對(duì)順鉬的IC50值減小。圖5為人肺癌先天性鉬類藥物耐藥株的篩選；
A、B :顯示人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299、人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞H1975、人大細(xì)胞肺癌H460、人肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1、人肺腺癌細(xì)胞LTEP-a-2、人小細(xì)胞肺癌H446、高轉(zhuǎn)移肺癌95D、人肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1對(duì)順鉬的藥物敏感性，表明肺癌95D，LTEP-a-2和SPC-A-1，SK-MES-1細(xì)胞對(duì)順鉬敏感性較其他細(xì)胞低；
C :不同肺癌細(xì)胞對(duì)順鉬的IC50值，其中肺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞9邪對(duì)順鉬的IC50值明顯高于其他細(xì)胞；
D :肺癌％D和H1299細(xì)胞對(duì)奧沙利鉬藥物敏感性；
E :肺癌95D和H1299細(xì)胞對(duì)奧沙利鉬的IC50值。圖6為T(mén)CRPl在不同人肺癌腫瘤細(xì)胞株中表達(dá)量；
A :實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)圖，顯示在原發(fā)性耐藥肺癌細(xì)胞株95D，LTEP-a-2和SPC-A-1，SK-MES-1中TCRPl在mRNA水平上表達(dá)高于其他敏感細(xì)胞株，其中％D細(xì)胞尤其明顯；
B Western Blot檢測(cè)圖，顯示原發(fā)性耐藥肺癌細(xì)胞株95D，LTEP-a-2和SPC-A-1，SK-MES-1中TCRPl在蛋白水平上表達(dá)高于其他敏感細(xì)胞株。圖7為siRNAs干擾TCRPl后可逆轉(zhuǎn)原發(fā)性鉬類耐藥肺癌細(xì)胞株95D的敏感性； A :原發(fā)性耐藥肺癌％D細(xì)胞中siRNA干擾組與對(duì)照組比較，干擾組對(duì)順鉬的藥物敏感
性增強(qiáng)。而敏感肺癌H1299細(xì)胞中siRNA干擾組與對(duì)照組比較，干擾組對(duì)順鉬的藥物敏感性無(wú)明顯區(qū)別；
B :原發(fā)性耐藥肺癌％D細(xì)胞中siRNA干擾組與對(duì)照組比較，干擾組對(duì)順鉬的IC50值減小。而敏感肺癌H1299細(xì)胞中siRNA干擾組與對(duì)照組比較，干擾組對(duì)順鉬的IC50值無(wú)明顯區(qū)別；C :原發(fā)性耐藥肺癌％D細(xì)胞中SiRNA干擾組與對(duì)照組比較，干擾組對(duì)奧沙利鉬的藥物敏感性增強(qiáng)。而敏感肺癌H1299細(xì)胞中siRNA干擾組與對(duì)照組比較，干擾組對(duì)奧沙利鉬的藥物敏感性無(wú)明顯區(qū)別；
D :原發(fā)性耐藥肺癌％D細(xì)胞中siRNA干擾組與對(duì)照組比較，干擾組對(duì)奧沙利鉬的IC50值減小。而敏感肺癌H1299細(xì)胞中siRNA干擾組與對(duì)照組比較，干擾組對(duì)奧沙利鉬的IC50值無(wú)明顯區(qū)別。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此
實(shí)施例1 :細(xì)胞培養(yǎng)
A549 (人肺癌細(xì)胞系)，A549/DDP (A549細(xì)胞耐藥亞株)，Cocl (人卵巢癌細(xì)胞系)，Cocl/DDP (Cocl細(xì)胞耐藥亞株)，Tca8113 (人類舌鱗癌細(xì)胞系)，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。Tca8113/PYM由本室誘導(dǎo)建立。采用4個(gè)劑量的平陽(yáng)霉素(PYM) (1、2、5和l(^g/mL)反復(fù)間歇24 h或48 h暴露法處理舌癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞，最后直到細(xì)胞能在含PYM100 ng/mL培養(yǎng)基中呈指數(shù)生長(zhǎng)，得到耐藥細(xì)胞系命名為T(mén)ca8113/PYM。

人肺癌腫瘤細(xì)胞系，SK-MES-1 (肺鱗癌細(xì)胞)，LTEP_a_2 (肺腺癌細(xì)胞)，SPC-A-1(肺腺癌細(xì)胞)，95D (高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞)，NC1-H1299 (非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)，NC1-H1975 (肺腺癌細(xì)胞)和NC1-H446 (小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)，NC1-H460 (大細(xì)胞肺癌細(xì)胞)購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。SK-MES-1用含10%胎牛血清及1. OmM丙酮酸鈉，O.1mM非必需氨基酸和1. 5g/L碳酸氫鈉的DMEM培養(yǎng)，其余細(xì)胞均用含10%胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實(shí)施例2 :細(xì)胞系耐藥性分析
選取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，1*PBS液漂洗2次，消化后制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)以每孔1000-5000接種到96孔培養(yǎng)板中(180 μ I/孔)，37° C，5%C02培養(yǎng)箱中孵育至細(xì)胞貼壁。在96孔培養(yǎng)板中加入不同濃度藥物(如順鉬，奧沙利鉬)，每種濃度5孔，于37° C培養(yǎng)箱中孵育72h ;每孔加入MTS 20 μ I,混勻后孵育3小時(shí)，于酶標(biāo)儀上檢測(cè)490波長(zhǎng)下各組OD值。計(jì)算平均細(xì)胞存活率(Survival Rate)，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率(Survival Rate)為縱坐標(biāo)繪制回歸曲線，并通過(guò)曲線計(jì)算IC50值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)論繼發(fā)性耐藥細(xì)胞A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM，相對(duì)各自敏感細(xì)胞株A549、CocU Tca8113，對(duì)順鉬和奧沙利鉬有強(qiáng)的耐藥抵抗性，而乳腺癌MCF7/5FU對(duì)順鉬和奧沙利鉬敏感，無(wú)耐藥性(如圖1、2所示)。肺癌95D，LTEP-a-2和SPC_A_1，SK-MES-1細(xì)胞對(duì)順鉬敏感性較其他細(xì)胞低，其中肺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞％D對(duì)順鉬和奧沙利鉬的敏感性明顯低于于其他肺癌細(xì)胞(如圖5所示)。實(shí)施例3 :實(shí)時(shí)定量PCR分析TCRPl在各細(xì)胞系中的表達(dá)
取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的各種培養(yǎng)細(xì)胞，TRIZOL方法提取總RNA。DNaseI消化后，測(cè)量RNA.以 oligdT 為引物取等量的 RNA 按照 Fermentas 公司 Reverse Transcription System 程序逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，按照SYBGreen操作說(shuō)明，用以下引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，TCRPl基因編碼區(qū)引物
SEQ ID NO:6 Forward :5’-CCAATAGTCCCAGTTATGCTCCA-3’
SEQ ID NO:7 Reverse :5’-TGCTTGGTAAGTTCGGTTCTCG-3’
擴(kuò)增片段為134bp GAPDH基因編碼區(qū)引物
SEQ ID NO:8 Forward :5’-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3’
SEQ ID NO:9 Reverse :5’-TTCTCCATGGTGGTGAAGACGCCA-3’
擴(kuò)增片段為156bp PCR 反應(yīng)參數(shù)95°C 5min ；95°C 30sec, 59°C 30sec, 72°C 30min 共 40 個(gè)循環(huán)。70°C至95°C繪制溶解曲線。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，通過(guò)2_Λ 法計(jì)算各組之間目標(biāo)基因TCRPl表達(dá)水平的差異；按照下列公式計(jì)算樣本的相對(duì)表達(dá)量其中Λ ACt =Δ Ct 處理組一Λ Ct 對(duì)照組；Λ Ct = Ct TCRPl - Ct GAPDH ；
結(jié)論在繼發(fā)性順鉬和奧沙利鉬耐藥細(xì)胞A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM中TCRPl的表達(dá)明顯高于各自敏感細(xì)胞株A549、Cocl、Tca8113 ;而在對(duì)順鉬和奧沙利鉬敏感的而乳腺癌MCF7/5FU細(xì)胞中，TCRPl表達(dá)無(wú)明顯的改變(如圖3A所示)。在原發(fā)性順鉬和奧沙利鉬耐藥肺癌細(xì)胞95D、LTEP-a-2、SK-MES-1中TCRPl的表達(dá)明顯高于其他敏感肺癌細(xì)胞。表明TCRPl的表達(dá)與順鉬和奧沙利鉬的耐藥性成正相關(guān)(如圖6A所示)。實(shí)施例4 :Western Blot分析TCRPl在各細(xì)胞系中的表達(dá)
取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑的新鮮細(xì)胞裂解液，裂解細(xì)胞提取總蛋白。用Bio-Rad公司Bradford方法測(cè)定蛋白濃度。按每個(gè)泳道加40Pg蛋白質(zhì)計(jì)算細(xì)胞蛋白體積，按1:4的比例加5XSDS上樣緩沖液將其溶解，100° C變性5min，立即置于冰上5min，短暫快速離心。上樣后進(jìn)行電泳，先在80V下電泳至溴酚藍(lán)染料進(jìn)入分離膠，再將電壓調(diào)至120V繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部。Bio-Rad電泳儀120mV恒壓進(jìn)行70min蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移，使分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上。濾膜用PBST溶劑配制的5%脫脂牛奶在室溫下封閉2H。反貼法孵育一抗4H，一抗孵育后用PBST洗膜3次，每次15min。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔及鼠二抗以1:4000稀釋在5%脫脂牛奶中，室溫孵育濾膜1H，PBST洗膜3次，每次15min。洗膜后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光、X光片曝光并顯影、定影，分析結(jié)果。結(jié)論在繼發(fā)性順鉬和奧沙利鉬耐藥細(xì)胞A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM中TCRPl的蛋白表達(dá)水平高于各自敏感細(xì)胞株A549、Cocl、Tca8113 ;而在對(duì)順鉬和奧沙利鉬敏感的而乳腺癌MCF7/5FU細(xì)胞中，TCRPl蛋白的表達(dá)無(wú)明顯的改變(如圖3B所示)。在原發(fā)性順鉬和奧沙利鉬耐藥肺癌細(xì)胞95D、LTEP-a-2、SK-MES-1中TCRPl的蛋白表達(dá)水平高于其他敏感肺癌細(xì)胞。表明TCRPl在蛋白水平上的表達(dá)與順鉬和奧沙利鉬的耐藥性也成正相關(guān)(如圖6B所示)。實(shí)施例5 :篩選高效的干擾TCRPl的siRNAs片段
設(shè)計(jì)和合成針對(duì)TCRPl基因的瞬時(shí)干擾寡核苷酸序列三條 SEQ ID NO:3 5’ -AACCGAACUUACCAAGCAU-3，
SEQ ID NO:4 5’ -ACCCUAAGAACAUGGCCUA-3’
SEQ ID NO:5 5’ -AUGGCAACCCUAAGAACAU-3’按Lipofectamin2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,步驟如下于轉(zhuǎn)染前24小時(shí)接種細(xì)胞于六孔板，待細(xì)胞融合至60 80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將IOOpM siRNA溶于250 μ I無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基中混勻，5. O μ I Lipofectamin2000溶于另外250 μ I無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基中混勻，室溫放置5min后將以上兩者混合，總體積為500 μ 1，室溫放置20min后將其加入待轉(zhuǎn)染孔中，再加入1. 5ml無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5小時(shí)后更換成含血清細(xì)胞培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，提取細(xì)胞總蛋白驗(yàn)證siRNA干擾效果。結(jié)果SEQ ID NO: 3干擾序列，轉(zhuǎn)染入各組細(xì)胞后其干擾效果顯著。遂本實(shí)驗(yàn)皆采用SEQ ID NO:3處理細(xì)胞進(jìn)行下一步研究。實(shí)施例6 :siRNA干擾TCRPl的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)繼發(fā)性和原發(fā)性腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉬和奧沙利鉬的敏感性
用TCRPl的siRNA干擾序列SEQ ID NO: 3，按Lipofectamin 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染繼發(fā)性順鉬和奧沙利鉬耐藥細(xì)胞A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM，或者原發(fā)性順鉬和奧沙利鉬耐藥肺癌細(xì)胞95D ;同時(shí)以轉(zhuǎn)染干擾序列的相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞作為對(duì)照(Control);具體步驟如下于轉(zhuǎn)染前24小時(shí)接種細(xì)胞于六孔板，待細(xì)胞融合至60 80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將IOOpM siRNA溶于250 μ I無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基中混勻，5. O μ I Lipofectamin2000溶于另外250 μ I無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基中混勻，室溫放置5min后將以上兩者混合，總體積為500 μ 1，室溫放置20min后將其加入待轉(zhuǎn)染孔中，再加入1. 5ml無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5H后更換成含血清細(xì)胞培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24H后，分析腫瘤細(xì)胞耐藥性的改變。結(jié)果降低TCRPl在繼發(fā)性耐藥細(xì)胞A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM，或者原發(fā)性耐藥肺癌細(xì)胞95D的表達(dá),可增強(qiáng)其 對(duì)順鉬和奧沙利鉬的敏感性,逆轉(zhuǎn)其對(duì)順鉬和奧沙利鉬的耐藥性。顯示TCRPl的siRNA干擾序列可作為一個(gè)鉬類藥物耐藥逆轉(zhuǎn)劑(如圖4、7所示)。發(fā)明所涉及的序列
權(quán)利要求
1.TCRPl基因在制備腫瘤細(xì)胞鉬類耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用，所述的TCRPl基因的序列如SEQ ID NO:1 所示。
2.TCRPl多肽在制備腫瘤細(xì)胞鉬類耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用，所述的TCRPl多肽的序列如SEQ ID NO:2 所示。
3.TCRPl基因抑制劑在制備腫瘤細(xì)胞鉬類耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。
4.TCRPl基因的干擾siRNAs在制備腫瘤細(xì)胞鉬類耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的干擾siRNAs的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
6.如權(quán)利要求1-4任意權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于所述的逆轉(zhuǎn)劑為繼發(fā)性腫瘤細(xì)胞鉬類耐藥逆轉(zhuǎn)劑或原發(fā)性腫瘤細(xì)胞鉬類耐藥逆轉(zhuǎn)劑。
7.如權(quán)利要求6任意權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于的腫瘤細(xì)胞為實(shí)體瘤細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求6任意權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于的腫瘤細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、和/或舌鱗癌細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求6任意權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤細(xì)胞為繼發(fā)性鉬類耐藥細(xì)胞肺癌A549/DDP、卵巢癌Cocl/DDP和/或舌鱗癌Tca8113/PYM ;或原發(fā)性鉬類肺癌耐藥細(xì)胞95D。
10.如權(quán)利要求1-4任意權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于所述的鉬類藥物為順鉬(cDDP)和奧沙利鉬(L-OHP)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)自主克隆的新的人類腫瘤耐藥相關(guān)基因——TCRP1,此基因與腫瘤化療鉑類藥物的耐藥產(chǎn)生有密切的關(guān)系。TCRP1不僅在鉑類繼發(fā)性耐藥腫瘤細(xì)胞株Tca8113/PYM、A549/DDP、Coc1/DDP表達(dá)升高，也在原發(fā)性鉑類耐藥細(xì)胞株，如肺癌95D細(xì)胞中表達(dá)明顯高于肺癌其他敏感細(xì)胞株。降低TCRP1基因的表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞株對(duì)鉑類藥物的敏感性。該基因定位于人染色體11q13.4，序列全長(zhǎng)1834bp，開(kāi)放讀碼框708bp，編碼235個(gè)氨基酸。本發(fā)明不僅為腫瘤耐藥機(jī)制提供新的資料，而且為抗腫瘤耐藥藥物的設(shè)計(jì)提供了新的靶點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/113GK103055326SQ20121055651
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者賀智敏, 谷依學(xué), 鄭國(guó)沛, 張志杰 申請(qǐng)人:廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院