專利名稱：Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變(I型、III型、X型和XIX型)篩查引物及試劑盒。
背景技術(shù)：
Citrin蛋白是由SLC25A13基因編碼的一種位于線粒體內(nèi)膜上的鈣調(diào)節(jié)載體蛋白，主要在肝臟中表達(dá)。Citrin蛋白作為I丐結(jié)合性線粒體溶質(zhì)載體(Aspaetate-GlutamateCarrier, AGC),其功能一是作為天冬氨酸的運(yùn)載體向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)天冬氨酸,提供尿素、蛋白及核苷酸合成材料；二是作為線粒體內(nèi)膜上天冬氨酸-蘋果酸屏障的組成部分向線粒體內(nèi)提供還原型煙酰胺腺嘌吟二核甙酸(NADH)應(yīng)用于糖的分解代謝；三是通過調(diào)節(jié)還原型煙酰胺腺嘌吟二核甙酸(NADH)的比例參與糖異生過程。SLC25A13基因突變導(dǎo)致其所編碼的citrin蛋白功能不足或喪失，引發(fā)一系列生化代謝紊亂，并最終形成臨床表型及預(yù)后各不相同的以肝臟損害為突出臨床表現(xiàn)的常染色體隱性遺傳病-Citri n缺陷病(Citrin Deficiency, CD)。CD主要臨床表型可分為三種，分別為Citrin缺陷導(dǎo)致的新生兒肝內(nèi)膽汁游積癥(NeonatalIntrahepaticCholestasis caused by Citrin Deficiency, NICCD, 0MIM#605814)、成人發(fā)病瓜氨酸血癥 II 型(Adult-onset CitrullinemiaType II, CTLN2, 0MIM#603471)和 Citrin 缺陷導(dǎo)致的生長發(fā)育落后和血脂異常(Failure to Thrive and Dyslipidemia caused by CitrinDeficiency, FTTD⑶)。NICXD主要發(fā)病于新生兒或小嬰兒，以圓胖臉、肝大、黃疸及肝功能異常為主要表現(xiàn)，若早期干預(yù)治療大部分預(yù)后良好；CTLN2主要發(fā)病于11歲以上的兒童或是成人，以高氨血癥導(dǎo)致的神經(jīng)精神癥狀為突出臨床表現(xiàn)，往往預(yù)后不良，需要肝臟移植；FTTD⑶是不同于NICXD及CTLN2的一種新的臨床表現(xiàn)型，它主要表現(xiàn)為生長發(fā)育落后和血脂異常。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示SLC25A13基因變異頻率在中國分布呈現(xiàn)明顯的地區(qū)差異，長江以南地區(qū)人群SLC25A13基因突變攜帶率(1/48)明顯高于長江以北地區(qū)(1/940)，提示該病在我國有較高的發(fā)病率，尤其是長江以南及長江沿線地區(qū)。在已發(fā)現(xiàn)的SLC25A13基因突變類型中，I 型(851del4)、III 型(1638-1660dup)、X 型(IVS6+5G>A)和 XIX 型(IVS16ins3kb)這四種突變類型約占總突變的85%，為我國人群的高頻突變類型。Citrin缺陷病的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，至今尚未建立成熟的臨床和生化診斷標(biāo)準(zhǔn)，SLC25A13基因突變分析被認(rèn)為是診斷該病的必要手段。以往此基因的分析主要依靠基因測序，耗時且費(fèi)用聞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于提供Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變(I型、III型、X型和XIX型)篩查引物。本發(fā)明的另一目的在于提供一種Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查試劑盒。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查引物，所述的高頻突變?yōu)镮型、III型、X型和XIX型突變，I型突變的篩查引物為IF :5，-ggtatatttgttgcttgtgtttg-3，，IA :5，-tcttccagaggagcaatccg-3 ;正常擴(kuò)增片段長度為82bp，突變后擴(kuò)增片段長度為78bp。III型突變的篩查引物為IIIF :5，-tgttgtgtctctcctgcagg-3，, IIIA :5，-gcagtctatcactccgctgt-3 ;正常擴(kuò)增片段長度為123bp，突變后擴(kuò)增片段長度為146bp。X型突變的篩查引物為XF :5，-tgagggcttgttagatcaagat-3，，XA :5，-ttacccagacaacaaattaacct-3，；正常擴(kuò)增片段長度為467bp，突變后擴(kuò)增片段長度為467bp。XIX型突變的篩查引物為XIXF :5，-gtatgcctgcagcatctttag-3，, XIXA :5，_tgcttcattcccaggaggga_3，；正常擴(kuò)增片段長度為881bp，突變后擴(kuò)增片段長度為3565bp。

一種Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查試劑盒，包括上述四對引物、dNTPs、DNA聚合酶、DNA聚合酶緩沖液和Tas I限制性內(nèi)切酶組件。所述的Tas I限制性內(nèi)切酶組件包括Tas I限制性內(nèi)切酶和Tas I限制性內(nèi)切酶緩沖液。所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查試劑盒還包括從全血樣本中提取基因組DNA的試劑(一般全血DNA小量提取試劑盒即可，可選配)和四種突變類型的正常、純合子和雜合子對照DNA。I型突變的正常對照DNA為82bp的條帶，I型突變純合子對照DNA為78bp的條帶，I型突變雜合子為78bp和82bp的條帶；111型突變的正常對照DNA為123bp的條帶，III型突變純合子對照DNA為146bp的條帶，III型突變雜合子為123bp、146bp和約160bp的條帶；X型突變的正常對照DNA為225bp、119bp和72bp的條帶，X型突變純合子對照DNA為180bp、119bp和72bp的條帶，X型突變雜合子為225bp、180bp、119bp和72bp的條帶；XIX型突變的正常對照DNA為881bp的條帶，XIX型突變純合子對照DNA為3565bp的條帶，XIX型突變雜合子為881bp和3565bp的條帶。所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查試劑盒還包括核酸電泳用瓊脂糖；所述的核酸電泳用瓊脂糖為普通電泳級瓊脂糖和低熔點(diǎn)電泳級瓊脂糖。所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查試劑盒還包括DNAladderMaker 和核酸染料。所述的 DNA Ladder Maker 優(yōu)選為 20bp 和 200bp DNALadder Marker ；所述的核酸染料優(yōu)選為Goldview。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明就Citrin缺陷病致病基因SLC25A13的四種高頻突變(I型、III型、X型和XIX型)，建立了依靠PCR和PCR-限制性長度片段多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)的篩查引物和試劑盒，依靠本發(fā)明的引物和試劑盒能夠后簡單、快速、準(zhǔn)確的篩查上述四種高頻突變。


圖1是I型突變正常對照、突變純合子和突變雜合子的PCR產(chǎn)物電泳圖。圖2是III型突變正常對照、突變純合子和突變雜合子的PCR產(chǎn)物電泳圖。圖3是X型突變正常對照、突變純合子和突變雜合子的PCR產(chǎn)物電泳圖。圖4是圖3所示PCR產(chǎn)物的的Tas I酶切產(chǎn)物電泳圖。圖5是XIX型突變正常對照、突變純合子和突變雜合子的PCR產(chǎn)物電泳圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1(I)樣本基因組DNA的提取已知I型、III型、X型和XIX型四種突變類型Citrin缺陷病患者(每種突變類型各包括突變純合子和突變雜合子各一例)和無Citrin缺陷病的正常人(正常對照)外周抗凝血標(biāo)本400 y L，使用Simgen公司的全血DNA小量試劑盒按照其說明書提取樣本的基因組DNA，得到濃度在50 150ng/ u L的基因組DNA。(2) SLC25A13I型、III型和X型突變的檢測I)以⑴所提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物見表1，DNA聚合酶為TaKaRa的rTaq酶 。表I四種SLC25A13突變檢測引物和擴(kuò)增片段長度
權(quán)利要求
1.Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查引物，所述四種高頻突變?yōu)镮型、III型、X型和XIX型突變，其特征在于 I型突變的篩查引物為IF :5’ -ggtatatttgttgcttgtgtttg-3>, IA :5’ -tcttccagaggagcaatccg-3 ； III型突變的篩查引物為IIIF :5’ -tgttgtgtctctcctgcagg-3>,IIIA :5’ -gcagtctatcactccgctgt-3 ； X型突變的篩查引物為XF :5，-tgagggcttgttagatcaagat-3>, XA :5，-ttacccagacaacaaattaacct-3 ； XIX型突變的篩查引物為XIXF :5’ -gtatgcctgcagcatctttag-3>, XIXA :5’ -tgcttcattcccaggaggga-S’。
2.—種Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求I所述的四對引物、dNTPs、DNA聚合酶、DNA聚合酶緩沖液和Tas I限制性內(nèi)切酶組件。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查試劑盒，其特征在于所述的Tas I限制性內(nèi)切酶組件包括Tas I限制性內(nèi)切酶和Tas I限制性內(nèi)切酶緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包括全血樣本中提取基因組DNA的試劑和四種高頻突變類型的正常、純合子和雜合子對照DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查試劑盒，其特征在于所述四種高頻突變類型的正常、純合子和雜合子對照DNA如下 I型突變的正常對照DNA為82bp的條帶，I型突變純合子對照DNA為78bp的條帶，I型突變雜合子為78bp和82bp的條帶； III型突變的正常對照DNA為123bp的條帶，III型突變純合子對照DNA為146bp的條帶，III型突變雜合子為123bp、146bp和約160bp的條帶； X型突變的正常對照DNA為225bp、119bp和72bp的條帶，X型突變純合子對照DNA為180bp、119bp和72bp的條帶，X型突變雜合子為225bp、180bp、119bp和72bp的條帶； XIX型突變的正常對照DNA為881bp的條帶，XIX型突變純合子對照DNA為3565bp的條帶，XIX型突變雜合子為881bp和3565bp的條帶。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包括核酸電泳用瓊脂糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查試劑盒，其特征在于所述的核酸電泳用瓊脂糖為普通電泳級瓊脂糖和低熔點(diǎn)電泳級瓊脂糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包括DNA Ladder Maker和核酸染料。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查試劑盒，其特征在于所述的DNA Ladder Maker為20bp和200bp DNA Ladder Marker ;所述的核酸染料為 Goldviewo
全文摘要
本發(fā)明公開了Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查試劑盒，所述的四種突變是I型、III型、X型和XIX型突變，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查引物的序列如SEQ ID NO.1～8所示。Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高頻突變篩查試劑盒包括上述引物、dNTPs、DNA聚合酶、DNA聚合酶緩沖液和Tas Ⅰ限制性內(nèi)切酶組件；所述試劑盒還包括從全血樣本中提取基因組DNA的試劑、四種突變類型的正常、純合子和雜合子對照DNA、核酸電泳用瓊脂糖、DNA Maker和核酸染料。本發(fā)明的引物和試劑盒能夠后簡單、快速、準(zhǔn)確的篩查上述SLC25A13基因的上述四種高頻突變。
文檔編號C12Q1/68GK103060441SQ20121055677
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者宋元宗, 張占會 申請人:暨南大學(xué)