一種用于細(xì)胞共培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于細(xì)胞共培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該生物反應(yīng)器系統(tǒng)中含有兩種或兩種以上規(guī)格粒徑的包埋型載體，每種粒徑規(guī)格載體包埋一種細(xì)胞，將包埋有不同種類細(xì)胞的不同規(guī)格載體在同一生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，從而在同一體系中實(shí)現(xiàn)了兩種或兩種以上細(xì)胞在三維生長(zhǎng)條件下的動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)，在培養(yǎng)結(jié)束后，借助粒徑篩分系統(tǒng)分別獲得包埋在不同粒徑規(guī)格載體中的各種細(xì)胞。
【專利說明】—種用于細(xì)胞共培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞共培養(yǎng)領(lǐng)域，具體說涉及一種體外三維非接觸式共培養(yǎng)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到不同種類細(xì)胞間相互作用的重要性。細(xì)胞間相互作用包括由細(xì)胞間直接接觸以及細(xì)胞間通過化學(xué)信號(hào)配體、受體(可溶性因子)所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。研究細(xì)胞間相互作用的傳統(tǒng)方法是細(xì)胞間直接接觸共培養(yǎng)，但這種方法的最大缺點(diǎn)是難以區(qū)別生物學(xué)效應(yīng)的產(chǎn)生是由于細(xì)胞間直接接觸還是化學(xué)信號(hào)(可溶性因子)傳導(dǎo)所致，且在此體系中不同種類細(xì)胞相互混合，無法實(shí)現(xiàn)目的細(xì)胞的完全分離。針對(duì)此問題，有研究者發(fā)明了 Transwell insert技術(shù)[參考文獻(xiàn):LeVisage, C;Dunham, B;Flint, P, et al..Coculture of mesenchymal stem cellsandrespiratory epithelial cells to engineer a human composite respiratorymucosa, Tissue Engineering, 2004, 10:1426-1435],實(shí)現(xiàn)了兩種細(xì)胞之間的二維非接觸共培養(yǎng)，此體系可以僅通過可溶性因子來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的相互作用，并且兩種細(xì)胞可徹底分離，但該技術(shù)的最大缺陷是無法提供能夠模擬細(xì)胞在體生長(zhǎng)狀態(tài)的三維微環(huán)境，且只能實(shí)現(xiàn)兩種細(xì)胞之間的共培養(yǎng)，難以實(shí)現(xiàn)共培養(yǎng)規(guī)模的放大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種用于細(xì)胞共培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，該生物反應(yīng)器系統(tǒng)中含有兩種或三種以上規(guī)格粒徑的包埋型載體，每種粒徑規(guī)格載體包埋一種細(xì)胞，不同粒徑規(guī)格載體中分別包埋不同種類細(xì)胞，將包埋有不同種類細(xì)胞的不同規(guī)格載體在同一生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，從而在同一體系中實(shí)現(xiàn)了兩種或三種以上細(xì)胞在三維生長(zhǎng)條件下的動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)，在培養(yǎng)結(jié)束后，借助粒徑篩分系統(tǒng)分別獲得包埋在不同粒徑規(guī)格載體中的各種細(xì)胞。
[0004]該生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的包埋型載體粒徑規(guī)格在100 μ m到2000 μ m范圍內(nèi)，各規(guī)格之間平均粒徑相差大于等于200 μ m,且每個(gè)規(guī)格的載體微球粒徑偏差±50 μ m之內(nèi)。比如:五種粒徑規(guī)格分別為 150 ± 50 μ m，350 ± 50 μ m，550 ± 50 μ m，750 ± 50 μ m，950 ± 50 μ m 等。
[0005]其中，不同粒徑規(guī)格載體的制備可借助已授權(quán)專利[精密高壓脈沖靜電式微膠囊制備儀ZL200720014715.8]和[一種具有相同變化電場(chǎng)力的多通道高效電極ZL200710158289.X]來實(shí)現(xiàn)。
[0006]該生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的生物反應(yīng)器可以是旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器、流化床或固定床型生物反應(yīng)器、或攪拌式生物反應(yīng)器。
[0007]該生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的包埋型載體為海藻酸鈉基的球形載體；
[0008]海藻酸鈉基包括海藻酸鈉，以及RGD、IKVAV、HGSR、PEG、膠原、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、魚精蛋白修飾的海藻酸鈉中的一種或二種以上，海藻酸鈉基與二價(jià)金屬離子形成的凝膠微球，即為球形載體；[0009]或，上述凝膠微球與聚陽離子靜電絡(luò)合形成的微膠囊，即為球形載體。
[0010]所述二價(jià)金屬離子為鈣離子、鋇離子、鋅離子中的一種或兩種以上；
[0011]所述聚陽離子為殼聚糖、聚賴氨酸、聚鳥氨酸及它們衍生物中的一種或兩種以上。
[0012]將細(xì)胞包埋在海藻酸鈉基球形載體中的方法是一種公知的技術(shù)，比如采用靜電液滴法、氣動(dòng)液滴法、乳化-外部凝膠化法、乳化-內(nèi)部凝膠化、膜乳化/內(nèi)部凝膠化、膜乳化/外部凝膠化、微通道陣列技術(shù)、震動(dòng)噴嘴技術(shù)等均可以制備出本發(fā)明所述的海藻酸鈉基球形載體，為簡(jiǎn)明起見，本發(fā)明對(duì)這些公知技術(shù)不作詳細(xì)描述。有關(guān)這些公知技術(shù)的詳細(xì)報(bào)道可參閱:
[0013]靜電液滴法[參閱文獻(xiàn):HommelM, Sun AM, Goosen MFA.Dropletsgeneration.Canadian patent N0.1241598, 1988];
[0014]氣動(dòng)液滴法[參閱文獻(xiàn):MiyawakiO, Nakamura K, Yano T.Agric.Biol.Chem.1980，44:2865-2870];
[0015]乳化/內(nèi)部凝膠化[參閱文獻(xiàn):劉群，馬小軍，劉袖洞。一種乳化/內(nèi)部凝膠化制備海藻酸鈣凝膠珠的方法。中國(guó)專利N0.ZLOl 109449.4];
[0016]膜乳化/內(nèi)部凝膠化[參閱文獻(xiàn):劉袖洞，馬小軍，劉群。一種制備海藻酸鈣凝膠珠的膜乳化/內(nèi)部凝膠化耦合技術(shù)，中國(guó)專利N0.ZL01104365.2]；
[0017]乳化/ 外部凝膠化[參閱文獻(xiàn):Lucinda-silva RM, Evangelista RC.J.Microencapsulation, 2003, 20:145-152]
[0018]膜乳化/外部凝膠化[參閱文獻(xiàn):YouJO, Park SB, Park HY, Haam S，Chung CH, KimWS.J.Microencapsulatio n, 2001, 18:521-532]
[0019]海藻酸鈉微膠囊[參閱文獻(xiàn):MaX, Vacek I, Sun A.Artif Cells BloodSubstitTmmobi I Biotechnol,1994，22:43-69;參閱文獻(xiàn) 2:Mcknight C.A., Ku A,GoosenM.F.A.，Sun D, Penney C.J BIOACT COMPAT POL, 1988，3:334-355]
[0020]微通道陣列技術(shù)[參閱文獻(xiàn):Α.M.Chuah, T.Kuroiwa, 1.Kobayashi, etal.Preparation of uniformly sized alginate microspheres using the novelcombinedmethods of microchannel emulsification and external gelation.ColloidsandSurfaces a-Physicochemical and EngineeringAspects, 2009，351 (1-3):9-17]
[0021]震動(dòng)噴嘴技術(shù)[參閱文獻(xiàn):H.H.Lee, 0.J.Park, J.M.Park, etal.Continuousproduction of uniform calcium alginate beads by sound wave inducedvibration.Journal of Chemical Technology and Biotechnology,1996，67 (3):255-259]
[0022]該生物反應(yīng)器系統(tǒng)用于一種或兩種以上基質(zhì)細(xì)胞與目的細(xì)胞之間通過非直接接觸方式由化學(xué)信號(hào)傳遞進(jìn)行相互作用的不同細(xì)胞組合，通過細(xì)胞組合間的三維共培養(yǎng)可以相互影響細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、細(xì)胞外泌功能中的一種或二種以上。
[0023]上述基質(zhì)細(xì)胞為對(duì)目的細(xì)胞定向分化、增殖、組織化或凋亡等多種行為具有調(diào)控作用的多來源體細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或細(xì)胞株；
[0024]其中，多來源體細(xì)胞是指從動(dòng)物或人的各種組織中通過分離、培養(yǎng)而得到的已分化成熟的細(xì)胞；轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是指 導(dǎo)入了人工修飾基因的細(xì)胞，該細(xì)胞能夠表達(dá)所修飾基因的特定功能；細(xì)胞株是指通過選擇法或克隆形成法獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的克隆化細(xì)胞群；[0025]上述目的細(xì)胞為多來源干細(xì)胞、體細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或細(xì)胞株；
[0026]其中，多來源干細(xì)胞包括胚胎肝細(xì)胞或成體干細(xì)胞，多來源體細(xì)胞是指從動(dòng)物或人的各種組織中通過分離、培養(yǎng)而得到的已分化成熟的細(xì)胞；轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是指導(dǎo)入了人工修飾基因的細(xì)胞，該細(xì)胞能夠表達(dá)所修飾基因的特定功能；細(xì)胞株是指通過選擇法或克隆形成法獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的克隆化細(xì)胞群。
[0027]上述基質(zhì)細(xì)胞和目的細(xì)胞可以是同源同種細(xì)胞、同源異種細(xì)胞、或異源異種細(xì)胞。
[0028]該生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的粒徑篩分系統(tǒng)可以是不同目數(shù)的篩網(wǎng)分離不同粒徑規(guī)格的載體，也可以通過流化床體系，實(shí)現(xiàn)不同粒徑規(guī)格載體的分離。
[0029]在完成細(xì)胞共培養(yǎng)后，可借助粒徑篩分系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)不同粒徑規(guī)格微球載體的分離，從而實(shí)現(xiàn)不同種細(xì)胞的有效分離。其中粒徑篩分系統(tǒng)可以是不同目數(shù)的篩網(wǎng)分離不同粒徑規(guī)格的載體，也可以通過流化床體系實(shí)現(xiàn)不同粒徑規(guī)格載體的分離[參閱文獻(xiàn):一種海藻酸鈣膠珠分級(jí)的方法，中國(guó)發(fā)明專利，200810013524.9]
[0030]由此可見，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0031]1、提供不同種類細(xì)胞的非直接接觸空間；
[0032]2、實(shí)現(xiàn)不同種類細(xì)胞或組織均在三維環(huán)境中的生長(zhǎng)；
[0033]3、不同細(xì)胞間通過化學(xué)信號(hào)傳遞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)；
[0034]4、細(xì)胞間相互作用后產(chǎn)生的效應(yīng)可以通過粒徑篩分體系實(shí)現(xiàn)作用后不同種類細(xì)胞的分離；
[0035]5、實(shí)際應(yīng)用時(shí)易于規(guī)模放大與工程化；
[0036]6、對(duì)現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)微載體或微膠囊體系的生物反應(yīng)器均適用本發(fā)明的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，無需特殊改造。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，A-D微球粒徑每組依次相差200微米。
【具體實(shí)施方式】 [0038]實(shí)施例1:考察軟骨細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞兩種細(xì)胞間的相互作用
[0039]I)從SD大鼠(4周齡)取得股骨和脛骨，用一次性注射器吸取無血清DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，獲得骨髓細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞密度梯度離心法分離純化，用含15%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，于37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)傳代，至第3代后，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的驗(yàn)證；
[0040]2)從SD大鼠(4周齡)的股骨和脛骨頭表面獲取關(guān)節(jié)軟骨，剪碎后，用2g/L的胰蛋白酶消化5hr后，再按體積比1:10加入2.5g/L的II型膠原酶消化，獲取關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，用含15%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，于37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行原代培養(yǎng)，并運(yùn)用甲苯胺藍(lán)及蘇木精/伊紅染色進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的驗(yàn)證；
[0041]3)將關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以IXlO6個(gè)/ml密度均勻分散到1.5%海藻酸鈉溶液中，
0.01mol/L的CaCl2溶液作為凝膠浴，采用靜電液滴法，制備出粒徑為350 μ m包埋有關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的海藻酸鈣微球，再與0.05%聚賴氨酸水溶液反應(yīng)10min成膜，之后用55mmol/L檸檬酸鈉溶液使內(nèi)部液化，制備出內(nèi)部為液體環(huán)境的包埋有關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的海藻酸鈉微膠囊;
[0042]4)將第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以I X IO6個(gè)/ml密度共同均勻分散到1.5%海藻酸鈉溶液中，在0.01mol/L的CaCl2溶液作為凝膠浴，采用靜電液滴法，制備出粒徑為600 μ m包埋有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的海藻酸鈣微球，清洗后，將微球與步驟3)制備的包埋有關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的海藻酸鈉微膠囊用含15%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，于37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng)；
[0043]5)培養(yǎng)5、10、15天后，用50目篩網(wǎng)將兩種微球分離，350微米包埋有軟骨細(xì)胞的微膠囊漏出，而600微米包埋有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的海藻酸鈣微球在篩網(wǎng)內(nèi)，將篩網(wǎng)內(nèi)的海藻酸鈣微球用55mmol/L檸檬酸鈉溶液液化，釋放海藻酸鈣微球中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，1000rpm離心5min收集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,備用；
[0044]6)運(yùn)用阿利新藍(lán)比色法測(cè)定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞氨基聚糖含量，具體操作如下:將回收的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用4°C預(yù)冷的PBS清洗；加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min后，12000rpm離心5min ;吸取上清，加入PBS至Iml ;加入0.5ml5mg/L胰蛋白酶37°C水解24hr ；加入0.5ml5mg/L木瓜蛋白酶37°C水解24hr，備用；氨基聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:加入1ml濃度為1、5、10、15、20、25、35、50mg/L的標(biāo)準(zhǔn)硫酸軟骨素溶液，空白對(duì)照加入1ml去離子水，再加入1.5mll.4g/L的阿利新藍(lán)染液,混勻，IOmin后測(cè)定480nm的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；取樣品Iml,加入1.5mll.4g/L的阿利新藍(lán)染液,混勻，IOmin后測(cè)定480nm的吸光度,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中氨基聚糖含量。結(jié)果提示氨基聚糖含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，說明關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞可通過非直接接觸方式誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。
[0045]實(shí)施例2:考察腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞兩種細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用
[0046]I)將人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和人胚肺成纖維細(xì)胞HELF等比例以2 X IO6個(gè)/ml密度均勻分散到1.5%海藻酸鈉溶液中，在0.01mol/L的CaCl2溶液作為凝膠浴，采用靜電液滴法，制備出粒徑為200 μ m包埋 有人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和人胚肺成纖維細(xì)胞HELF的海藻酸鈣微球，再與0.05% (g/ml)聚賴氨酸水溶液反應(yīng)10min成膜，之后用55mmol/L檸檬酸鈉溶液使內(nèi)部液化，制備出內(nèi)部為液體環(huán)境的包埋有人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和人胚肺成纖維細(xì)胞HELF的海藻酸鈉微膠囊；
[0047]2)將包埋有人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304以2X IO6個(gè)/ml密度共同均勻分散到1.5%海藻酸鈉溶液中，在0.01mol/L的CaCl2溶液作為凝膠浴，采用靜電液滴法，制備出粒徑為400μm包埋有人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304的海藻酸鈣微球，清洗后，與步驟I)制得的包埋有人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和人胚肺成纖維細(xì)胞HELF的海藻酸鈉微膠囊，在含15%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，于37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng)；
[0048]3)培養(yǎng)I天和5天后，用50目篩網(wǎng)將兩種微球分離，包埋有人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和人胚肺成纖維細(xì)胞HELF的海藻酸鈉微膠囊從篩網(wǎng)漏出，包埋有人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304的海藻酸鈣微球留在篩網(wǎng)中，用55mmol/L檸檬酸鈉溶液使海藻酸鈣微球液化，釋放海藻酸鈣微球中的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，1000rpm離心5min收集細(xì)胞ECV304，備用；
[0049]4)運(yùn)用RT-PCR方法檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304細(xì)胞周期素Cyclin E表達(dá)，具體操作如下:將回收的ECV304細(xì)胞 用PBS清洗，采用Trizol法提取總RNA ;按照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)；上游引物:5，-CTG GAT GTT GAC TGC CTT GA-3’，下游引物:5’-CCG CTG CTCTGC TTC TTA C-3，;反應(yīng)參數(shù):95°C預(yù)變性 5min，95°C變性 40sec，53°C退火35sec，72°C延伸35sec，共30個(gè)循環(huán)，于72°C保溫IOmin終止反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行半定量分析。結(jié)果提示ECV304細(xì)胞Cyclin E表達(dá)上調(diào),說明腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞兩種細(xì)胞共培養(yǎng)可通過非直接接觸方式促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
[0050]實(shí)施例3:非接觸動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞體外三維定向分化為神經(jīng)前體細(xì)胞
[0051]I)制備精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)、異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(IKVAV)、酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸(HGSR)多肽修飾的海藻酸鈉。將海藻酸鈉(分子量430kDa，古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比1.5)溶解于含有0.5M NaCl的
0.1M2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液中(pH值6.5)，得到1%(W/V)海藻酸鈉溶液。再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)和單一種類的多肽，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24小時(shí)。EDC和海藻酸鈉摩爾比為1:20，EDC和sulfo-NHS摩爾比為2:1，多肽和海藻酸鈉質(zhì)量比為1:1000。然后進(jìn)行透析并冷凍干燥，從而得到多肽修飾的海藻酸鈉。之后，將上述三種多肽修飾的海藻酸鈉粉末分別溶解于生理鹽水中，溶液濃度均為1.5%(ff/V)，并配置體積比為1:1:1的三種多肽修飾海藻酸鈉的混合溶液，混合溶液終濃度仍為1.5%(ff/V)。
[0052]2)將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞與1.5%(ff/V)的RGD單獨(dú)修飾海藻酸鈉溶液混合，調(diào)整細(xì)胞密度為2X IO6ceIls.ml/1，將該細(xì)胞懸液經(jīng)過注射器泵滴入IOOmmol.L^1CaCl2溶液中鈣化20min，得到粒徑600微米的海藻酸鈣微膠珠。將海藻酸鈣微膠珠與0.05%(W/V)的聚賴氨酸反應(yīng)成膜lOmi n，形成非液化的海藻酸鈉/聚賴氨酸微膠囊，再與0.15%(ff/V)海藻酸鈉溶液反應(yīng)5min,最后用55mmol *L_1檸檬酸鈉液化5min,就得到了包埋有人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的海藻酸鈉/聚賴氨酸/海藻酸鈉微膠囊。將此微膠囊使用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌3次，之后按1:10的體積比(微膠囊:培養(yǎng)液)加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天。
[0053]3)將第5代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與上述1.5%(ff/V)含有三種多肽的海藻酸鈉混合溶液進(jìn)行混合，調(diào)整細(xì)胞密度為4X106cells.mL_l，將該細(xì)胞懸液經(jīng)過注射器泵滴入IOOmmol.L^1CaCl2溶液中鈣化20min，得到含有干細(xì)胞的粒徑300微米的海藻酸鈣微膠珠，使用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌3次，再加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天。
[0054]4)將含有神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的微膠囊以及含有干細(xì)胞的微膠珠分別接種在反應(yīng)器主體中，二者接種體積比例為2:1，即兩種細(xì)胞接種數(shù)量之比為1:1。將兩種微球在流化床生物反應(yīng)器中動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)4天。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，使用含有IOng.Hir1EGF和bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)液誘導(dǎo)在微膠珠中三維培養(yǎng)的干細(xì)胞以及在培養(yǎng)瓶中二維培養(yǎng)的干細(xì)胞，培養(yǎng)4天。
[0055]5)動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)4天之后，用40目篩網(wǎng)將上述兩種微球分離，篩網(wǎng)內(nèi)是包埋有人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的海藻酸鈉/聚賴氨酸/海藻酸鈉微膠囊，而包埋有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的海藻酸鈣微膠珠從篩網(wǎng)中漏出，收集漏出的海藻酸鈣微膠珠，培養(yǎng)液洗滌3次后用55mmol.I/1檸檬酸鈉溶液溶解微膠珠，之后離心收獲分化細(xì)胞，分析其神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志Nestin的基因表達(dá)以及Nestin陽性細(xì)胞的百分比，并將其接種到培養(yǎng)板中，貼壁后加入含有10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，繼續(xù)分化I周，通過進(jìn)行β -tubulin III和GFAP熒光染色來檢測(cè)獲得的神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力。結(jié)果顯示，動(dòng)態(tài)三維共培養(yǎng)獲得的分化細(xì)胞與使用生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的二維以及三維分化細(xì)胞相比，其Nestin的基因表達(dá)與陽性細(xì)胞百分比顯著升高，Nestin陽性細(xì)胞百分比約為40%，并且具有向成熟神經(jīng)細(xì)胞分化的能力，這說明此生物反應(yīng)器系統(tǒng)能夠顯著促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化并維持了其繼續(xù)向成熟神經(jīng)細(xì)胞分化的能力。
[0056]實(shí)施例4多種肝基質(zhì)細(xì)胞與MSC共培養(yǎng)，促進(jìn)MSC向肝細(xì)胞的分化
[0057]1)采用灌注結(jié)合梯度離心的方法分離大鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(方法參考“昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，7:22-25 )。
[0058]2)采用成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)法獲得大鼠肝組織的成纖維細(xì)胞。
[0059]3)參考實(shí)施例1中步驟I)獲得大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0060]4)將步驟I)獲得的原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞按照實(shí)施例1步驟3)的方法，以5X 106/ml密度包埋在粒徑為500微米的海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊中。
[0061]5)將步驟I)獲得的原代內(nèi)皮細(xì)胞等非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，以5X106/ml密度包埋在粒徑為100微米的海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊中。
[0062]6)將步驟2)獲得的成纖維細(xì)胞，以2X 105/ml密度包埋在粒徑為700微米的海藻
酸鈉-聚賴氨酸微膠囊中。
[0063]7)將步驟3)獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以5X 107ml密度包埋在粒徑為300微米的海藻酸鈉微膠囊中。
[0064]8)將步驟4)、5)、6)、7)獲得的四種含有不同細(xì)胞的微膠囊用含15%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，于37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng)，四者體積比為1:1:1:1(微囊共培養(yǎng)示意圖見附圖)。
[0065]9)分別在共培養(yǎng)5、14、21天后，分別收集各種微膠囊，并用60目和30目?jī)煞N篩網(wǎng)分離三種微膠囊。將在30目篩網(wǎng)漏出但留在60目篩網(wǎng)上的微膠囊收集起來，55mM檸檬酸鈉液化后，分離清洗，即獲得分化后的MSC。結(jié)果顯示共培養(yǎng)5天后，長(zhǎng)梭形的細(xì)胞突起變短、變粗，并有卵圓形細(xì)胞出現(xiàn)。共培養(yǎng)14天，細(xì)胞呈現(xiàn)多角形、卵圓形或圓形，共培養(yǎng)21天時(shí)，細(xì)胞白蛋白mRNA的表達(dá)量顯著增加，甲胎蛋白mRNA的表達(dá)檢測(cè)不到。結(jié)果均說明MSC分化成肝細(xì)胞。
【權(quán)利要求】
1.一種用于細(xì)胞共培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于:該生物反應(yīng)器系統(tǒng)中含有兩種或三種以上規(guī)格粒徑的包埋型載體，每種粒徑規(guī)格載體包埋一種細(xì)胞，不同粒徑規(guī)格載體中分別包埋不同種類細(xì)胞，將包埋有不同種類細(xì)胞的不同規(guī)格載體在同一生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，從而在同一體系中實(shí)現(xiàn)了兩種或三種以上細(xì)胞在三維生長(zhǎng)條件下的動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)，在培養(yǎng)結(jié)束后，借助粒徑篩分系統(tǒng)分別獲得包埋在不同粒徑規(guī)格載體中的各種細(xì)胞。
2.按照權(quán)利要求1所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于:所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的包埋型載體粒徑規(guī)格在100 μ m到2000 μ m范圍內(nèi)，各規(guī)格之間平均粒徑相差大于等于200 μ m,且每個(gè)規(guī)格的載體微球粒徑偏差±50 μ m之內(nèi)。
3.按照權(quán)利要求1所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于:所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的生物反應(yīng)器可以是旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器、流化床或固定床型生物反應(yīng)器、或攪拌式生物反應(yīng)器。
4.按照權(quán)利要求1所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于:所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的包埋型載體為海藻酸鈉基的球形載體； 海藻酸鈉基包括海藻酸鈉，以及RGD、IKVAV、YIGSR, PEG、膠原、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、魚精蛋白修飾的海藻酸鈉中的一種或二種以上，海藻酸鈉基與二價(jià)金屬離子形成的凝膠微球，即為球形載體； 或，上述凝膠微球與聚陽離子靜電絡(luò)合形成的微膠囊，即為球形載體。
5.按照權(quán)利要求1所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于:所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)用于一種或兩種以上基質(zhì)細(xì)胞與目的細(xì)胞之間通過非直接接觸方式由化學(xué)信號(hào)傳遞進(jìn)行相互作用的不同細(xì)胞組合 ，通過細(xì)胞組合間的三維共培養(yǎng)可以相互影響細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、細(xì)胞外泌功能中的一種或二種以上。
6.按照權(quán)利要求5所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于:所述基質(zhì)細(xì)胞為對(duì)目的細(xì)胞定向分化、增殖、組織化或凋亡等多種行為具有調(diào)控作用的多來源體細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或細(xì)胞株; 其中，多來源體細(xì)胞是指從動(dòng)物或人的各種組織中通過分離、培養(yǎng)而得到的已分化成熟的細(xì)胞；轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是指導(dǎo)入了人工修飾基因的細(xì)胞，該細(xì)胞能夠表達(dá)所修飾基因的特定功能；細(xì)胞株是指通過選擇法或克隆形成法獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的克隆化細(xì)胞群; 所述目的細(xì)胞為多來源干細(xì)胞、體細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或細(xì)胞株； 其中，多來源干細(xì)胞包括胚胎肝細(xì)胞或成體干細(xì)胞，多來源體細(xì)胞是指從動(dòng)物或人的各種組織中通過分離、培養(yǎng)而得到的已分化成熟的細(xì)胞；轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是指導(dǎo)入了人工修飾基因的細(xì)胞，該細(xì)胞能夠表達(dá)所修飾基因的特定功能；細(xì)胞株是指通過選擇法或克隆形成法獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的克隆化細(xì)胞群。
7.按照權(quán)利要求5所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于:所述基質(zhì)細(xì)胞和目的細(xì)胞可以是同源同種細(xì)胞、同源異種細(xì)胞、或異源異種細(xì)胞。
8.按照權(quán)利要求4所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于: 所述二價(jià)金屬離子為鈣離子、鋇離子、鋅離子中的一種或兩種以上； 所述聚陽離子為殼聚糖、聚賴氨酸、聚鳥氨酸及它們衍生物中的一種或兩種以上。
9.按照權(quán)利要求1所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于:所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的粒徑篩分系統(tǒng)可以是不同目數(shù)的篩網(wǎng)分離不同粒徑規(guī)格的載體，也可以通過流化床體系，實(shí)現(xiàn)不同粒徑規(guī)格 載體的分離。
【文檔編號(hào)】C12M3/00GK103881908SQ201210560038
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月20日
【發(fā)明者】馬小軍, 于煒婷, 劉洋 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所