專(zhuān)利名稱(chēng)：一種座囊霉菌突變株及其催化生產(chǎn)樺木酮醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物及應(yīng)用生物催化領(lǐng)域，具體涉及一種座囊霉菌突變株及其催化樺木醇區(qū)域選擇性氧化制備樺木酮醇的方法。
背景技術(shù)：
樺木醇是一種羽扇烷類(lèi)五環(huán)三萜化合物，具有抗炎及抗病毒等活性，并且顯示出與其它藥物不同的作用機(jī)制，對(duì)腫瘤細(xì)胞也具有一定的毒性(林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2009，29(1)，87)，但較低的生物活性及選擇性等阻礙了其在臨床上的應(yīng)用。為此，以樺木醇為先導(dǎo)化合物，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以提高其生物活性成為了近年來(lái)的研究熱點(diǎn)(Natural Product Reports, 2006，23，394)。樺木酮醇是樺木醇3-輕基氧化后的羰基衍生物。大量研究表明，樺木酮醇的生物活性遠(yuǎn)高于樺木醇。例如，樺木酮醇對(duì)肺癌NSCLC-N6細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)高于樣木醇(Phytochemistry, 2004, 65, 1159);樣木醇的3-輕基經(jīng)氧化修飾后，明顯增強(qiáng)了其誘導(dǎo)小鼠黑素瘤細(xì)胞分化活性(Journal of NaturalProducts, 2002，65，645)。同時(shí)樺木酮醇也是制備具有重要應(yīng)用價(jià)值的異構(gòu)樺木酮醇(allobetulone)的關(guān)鍵合成砲塊(Molecules, 2011, 16, 2443)。盡管許多植物如大柄冬青(Ilex macropoda)及紅樹(shù)林植物瓶花木(ScyphiphorahydrophylIacea)等中均含有樺木酮醇(熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2007, 15(3)，249;Archivesof Pharmacal Research, 2002, 25，617)，但含量甚低，極大地限制了該化合物的研究與應(yīng)用。因此，必須開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便的制備樺木酮醇的新技術(shù)及新工藝。樺木醇是樺木酮醇的生物合成前提物，在植物中含量較高，尤其是在白樺樹(shù)皮中其含量高達(dá)25%。故以廉價(jià)、易得的樺木醇為原料，通過(guò)化學(xué)/生物催化法制備樺木酮醇是一條極具應(yīng)用潛力的合成路線。在樺木醇分子中有三個(gè)活性官能團(tuán)(3-羥基，28-羥基及C2tl-C29雙鍵)，由于化學(xué)法的選擇性較差，故如想對(duì)其中的3-羥基進(jìn)行選擇性氧化修飾時(shí)，通常需要繁瑣的保護(hù)及脫保護(hù)步驟，并且通常 需要使用化學(xué)計(jì)量的、環(huán)境不友好的氧化劑CrO3和KMnO4等。盡管利用生物催化與生物轉(zhuǎn)化手段能有效避免化學(xué)法的上述缺點(diǎn)，但28-羥基為伯羥基，而3-羥基為仲羥基，前者空間位阻相對(duì)較小，故前者通常比后者活潑，更易被修飾。事實(shí)上，目前已報(bào)道的生物催化劑也只能催化28-羥基氧化及環(huán)上其他位點(diǎn)的羥基化反應(yīng)(ProcessBiochemistry 2011, 46:1-15;Enzyme and Microbial Technology, 2009, 45:175-180; Journal of Applied Microbiology, 2011，110:90-97),仍無(wú)法實(shí)現(xiàn)低活性的 3-輕基的區(qū)域選擇性氧化。最近，我們篩選到一株能區(qū)域選擇性催化樺木醇3-羥基氧化合成樺木酮醇的座囊霉菌HQ 316564,在最適條件下，產(chǎn)率為43%(Journal of Molecular CatalysisB:Enzymatic, 2013，88:32-35)。但以該原始菌株為生物催化劑，轉(zhuǎn)化效率較低、反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)(需預(yù)培養(yǎng)菌株3天，加入底物后反應(yīng)6天)，并且產(chǎn)率不高。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，利用紫外隨機(jī)突變技術(shù)對(duì)原始菌株座囊霉菌Dothideomycete sp.HQ 316564進(jìn)行誘變,篩選獲得一株高效催化催化樺木醇區(qū)域選擇性氧化合成樺木酮醇的突變株。本發(fā)明的目的在于提供該座囊霉菌突變株及其催化樺木醇區(qū)域選擇性氧化合成樺木酮醇的方法。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種座囊霉菌突變株，該突變株為座囊霉菌(Dothideomycete sp.)UV 14，于2012年12月11日，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC，保藏號(hào):CCTCC N0.M 2012523，保藏地址:武漢，武漢大學(xué)。該突變株的菌落形態(tài)如圖2 (b)所示。利用上述座囊霉菌催化生產(chǎn)樺木酮醇的方法，包括如下步驟:(I)座囊霉菌(Dothideomycete sp.) UV 14經(jīng)活化后,在生理鹽水中配置濃度為IXio7個(gè)孢子/mL的種子液，接種至含氯化鈉的土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)廣3天；(2)加入底物樺木醇和助溶劑二甲基亞砜后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至5.(T9.0,在23^380CU60r/min下反應(yīng)12飛O小時(shí)后，過(guò)濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取三次(等體積是指與濾液體積相等)；過(guò)濾所得菌體經(jīng)凍干后，加入1/2濾液體積的乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有機(jī)相，在真空下除去溶劑，經(jīng)柱層析后，得到產(chǎn)物樺木酮醇。優(yōu)選地,步驟(I)所述座囊霉菌(Dothideomycete sp.) UV 14的活化是在含氯化鈉的PH 7.0的土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，于28° C下活化6天。優(yōu)選地，所述含氯化鈉的土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的配方為:2%葡萄糖，20% 土豆、1.5%瓊脂和0.3%氯化鈉。優(yōu)選地，步驟(I)所述種子液的接種量為1%。優(yōu)選地，步驟(I)所述含氯化鈉的土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基的配方為:2%葡萄糖，20% 土豆和0.3%氯化鈉。

優(yōu)選地，步驟(I)所述培養(yǎng)條件為初始pH 5.(Γ7.0、23 38°C、14(Tl80r/min。優(yōu)選地，步驟(2)所述二甲基亞砜的濃度為0.2 1.0% (v/v)0優(yōu)選地，步驟(2)所述樺木醇的濃度為100mg/L。本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn):I)利用座囊霉菌Dothideomycete sp.UV14細(xì)胞作為催化劑能高區(qū)域選擇性地催化樺木醇中空間位阻較高、活性較低的3-位仲羥基氧化。2)以座囊霉菌Dothideomycete sp.UV14細(xì)胞作為催化劑合成樺木酮醇，與原始菌株Dothideomycete sp.相比，具有生物催化效率高、反應(yīng)時(shí)間短、目的產(chǎn)物收率高等優(yōu)點(diǎn)。3)本發(fā)明方法區(qū)域選擇性高、工藝簡(jiǎn)單，避免了費(fèi)時(shí)耗力的保護(hù)與脫保護(hù)步驟，并且具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為樺木醇轉(zhuǎn)化為樺木酮醇的反應(yīng)式。圖2 為原始菌 Dothideomycete sp.HQ 316564(a)及突變株(Dothideomycetesp.)UV 14 (b)在3%氯化鈉、pH 7.0的土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，于28。C下培養(yǎng)3天后的菌落形態(tài)。圖3為樺木醇及樺木酮醇分析的典型液相色譜圖(樺木醇及樺木酮醇的保留時(shí)間分別為 10.09 及 11.98min)。
具體實(shí)施例方式通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不局限于實(shí)施例。實(shí)施例1座囊霉菌(Dothideomycete sp.)UV 14在含氯化鈉、pH 7.0的土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(2%葡萄糖，20% 土豆，1.5%瓊脂，0.3%氯化鈉)上，于28° C下活化6天后，在生理鹽水中配置種子液(I X IO7個(gè)孢子/mL)，按1%的接種量接種至50mL含氯化鈉、pH 6.0的土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基(2%葡萄糖，20% 土豆，0.3%氯化鈉)中，在28° C、160r/min下培養(yǎng)3天；隨后加入5mg樺木醇和0.4%(v/v)二甲基亞砜,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至6.0,在33° C、160r/min下反應(yīng)；48小時(shí)后，過(guò)濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取三次，過(guò)濾所得菌體經(jīng)凍干后，加入1/2濾液體積的乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有機(jī)相，在真空下除去溶劑，得到產(chǎn)物樺木酮醇粗品；隨后加入0.5mL的甲醇溶解，離心后利用液相色譜(色譜圖如圖3所示)測(cè)定產(chǎn)物濃度，根據(jù)產(chǎn)物校正曲線計(jì)算得到產(chǎn)率為44%。實(shí)施例2座囊霉菌Dothideomycete sp.UV 14在含氯化鈉、pH 7.0的土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上(2%葡萄糖，20% 土豆，1.5%瓊脂，0.3%氯化鈉)，于28° C下活化6天后，在生理鹽水中配置種子液(I X IO7個(gè)孢子/mL)，按1%的接種量接種至50mL含氯化鈉、pH 6.5的土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基(2%葡萄糖，20% 土豆，0.3%氯化鈉)中，在28° C、160r/min下培養(yǎng)1.5天；隨后加入5mg樺木醇和0.6%(v/v)二甲基亞砜,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至6.5,在33° C、160r/min下反應(yīng)；48小時(shí)后，過(guò)濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取三次，過(guò)濾所得菌體經(jīng)凍干后，加入1/2濾液體積乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有機(jī)相，在真空下除去溶劑，得到產(chǎn)物樺木酮醇粗品；隨后加入0.5mL的甲醇溶解，離心后利用液相色譜測(cè)定產(chǎn)物濃度，根據(jù)產(chǎn)物校正曲線計(jì)算得到產(chǎn)率為49%。實(shí)施例3座囊霉菌Dothideomycete sp.UV 14在含氯化鈉、pH 7.0的土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(2%葡萄糖，20% 土豆，1.5%瓊脂，0.3%氯化鈉)上，于28° C下活化6天后，在生理鹽水中配置種子液(I X IO7個(gè)孢子/mL)，按1%的接種量接種至50mL含氯化鈉、pH 5.5的土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基(2%葡萄糖，20% 土豆，0.3%氯化鈉)中，在28° C、160r/min下培養(yǎng)1.5天；隨后加入5mg樺木醇和0.2%(v/v)二甲基亞砜，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至6.5，在33° C、160r/min下反應(yīng)；48小時(shí)后，過(guò)濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取三次，過(guò)濾所得菌體經(jīng)凍干后，加入1/2濾液體積乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有機(jī)相，在真空下除去溶劑，得到產(chǎn)物樺木酮醇粗品；隨后加入0.5mL的甲醇溶解，離心后利用液相色譜測(cè)定產(chǎn)物濃度，根據(jù)產(chǎn)物校正曲線計(jì)算得到產(chǎn)率為57%。實(shí)施例4座囊霉菌Dothideomycete sp.UV 14在含氯化鈉、pH 7.0的土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(2%葡萄糖，20% 土豆，1.5%瓊脂，0.3%氯化鈉)上，于28° C下活化6天后，在生理鹽水中配置種子液(I X IO7個(gè)孢子/mL)，按1%的接種量接種至50mL含氯化鈉、pH 5.5的土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基(2%葡萄糖，20% 土豆，0.3%氯化鈉)中，在23° C、160r/min下培養(yǎng)1.5天；隨后加入5mg樺木醇和0.2%(v/v)二甲基亞砜，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.0，在33° C、160r/min下反應(yīng)；48小時(shí)后，過(guò)濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取三次，過(guò)濾所得菌體經(jīng)凍干后，加入1/2濾液體積乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有機(jī)相，在真空下除去溶劑，得到產(chǎn)物樺木酮醇粗品；隨后加入0.5mL的甲醇溶解，離心后利用液相色譜測(cè)定產(chǎn)物濃度，根據(jù)產(chǎn)物校正曲線計(jì)算得到產(chǎn)率為54%實(shí)施例5座囊霉菌Dothideomycete sp.UV 14在含氯化鈉、pH 7.0的土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(2%葡萄糖，20% 土豆，1.5%瓊脂，0.3%氯化鈉)上，于28° C下活化6天后，在生理鹽水中配置種子液(I X IO7個(gè)孢子/mL)，按1%的接種量接種至50mL含氯化鈉、pH 5.5的土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基(2%葡萄糖，20% 土豆，0.3%氯化鈉)中，在28° C、160r/min下培養(yǎng)1.5天；隨后加入5mg樺木醇和0.4%(v/v)二甲基亞砜，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.0，在28° C、160r/min下反應(yīng)；48小時(shí)后，過(guò)濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取三次，過(guò)濾所得菌體經(jīng)凍干后，加入1/2濾液體積乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有機(jī)相，在真空下除去溶劑，得到產(chǎn)物樺木酮醇粗品；隨后加入0.5mL的甲醇溶解，離心后利用液相色譜測(cè)定產(chǎn)物濃度，根據(jù)產(chǎn)物校正曲線計(jì)算得到產(chǎn)率為63%。實(shí)施例6座囊霉菌Dothideomycete sp.UV 14在含氯化鈉、pH 7.0的土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(2%葡萄糖，20% 土豆，1.5%瓊脂，0.3%氯化鈉)上，于28° C下活化6天后，在生理鹽水中配置種子液(I X IO7個(gè)孢子/mL)，按1%的接種量接種至50mL含氯化鈉、pH 5.5的土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基(2%葡萄糖，20% 土豆，0.3%氯化鈉)中，在28° C、160r/min下培養(yǎng)1.5天；隨后加入5mg樺木醇和0.4%(v/v)二甲基亞砜，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.0，在33° C、160r/min下反應(yīng)；36小時(shí)后，過(guò)濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取三次，過(guò)濾所得菌體經(jīng)凍干后，加入1/2濾液體積乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有機(jī)相，在真空下除去溶劑，得到產(chǎn)物樺木酮醇粗品；隨后加入0.5mL的甲醇溶解，離心后利用液相色譜測(cè)定產(chǎn)物濃度，根據(jù)產(chǎn)物校正曲線計(jì)算得到產(chǎn)率為62%。實(shí)施例7座囊霉菌Dothideomycete sp.UV 14在含氯化鈉、pH 7.0的土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(2%葡萄糖，20% 土豆，1.5%瓊脂，0.3%氯化鈉)上，于28° C下活化6天后，在生理鹽水中配置種子液(1 X 207個(gè)孢子/mL)，按1%的接種量接種至50mL含氯化鈉、pH 5.5的土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基(2%葡萄糖，20% 土豆，0.3%氯化鈉)中，在28° C、160r/min下培養(yǎng)1.5天；隨后加入5mg樺木醇和0.4%(v/v)二甲基亞砜，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.0，在33° C、160r/min下反應(yīng)；48小時(shí)后，過(guò)濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取三次，過(guò)濾所得菌體經(jīng)凍干后，加入1/2濾液體積乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有機(jī)相，在真空下除去溶劑，得到產(chǎn)物樺木酮醇粗品；隨后加入0.5mL的甲醇溶解，離心后利用液相色譜測(cè)定產(chǎn)物濃度，根據(jù)產(chǎn)物校正曲線計(jì)算得到產(chǎn)率為72%。
權(quán)利要求
1.一種座囊霉菌突變株，其特征在于，該突變株為座囊霉菌(Dothideomycete sp.)UV 14，于2012年12月11日，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC，保藏號(hào)=CCTCCN0.M 2012523。
2.利用權(quán)利要求1所述座囊霉菌催化生產(chǎn)樺木酮醇的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)座囊霉菌(Dothideomycetesp.)UV 14經(jīng)活化后，在生理鹽水中配置濃度為I X IO7個(gè)孢子/mL的種子液，接種至含有氯化鈉的土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)f 3天； (2)加入底物樺木醇和助溶劑二甲基亞砜后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至5.(T9.0，在23 38°C、160r/min下反應(yīng)12飛O小時(shí)后，過(guò)濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取三次；過(guò)濾所得菌體經(jīng)凍干后，加入1/2濾液體積的乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有機(jī)相，在真空下除去溶齊U，經(jīng)柱層析后，得到產(chǎn)物樺木酮醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,步驟(I)所述座囊霉菌(Dothideomycetesp.) UV 14的活化是在含氯化鈉、pH 7.0的土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，于28° C下活化6天。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述含氯化鈉的土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的配方為:2%葡萄糖，20% 土豆、1.5%瓊脂和0.3%氯化鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述種子液的接種量為1%。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述含氯化鈉的土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基的配方為:2%葡萄糖，20% 土豆和0.3%氯化鈉。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述培養(yǎng)條件為初始pH5.0 7.0、23 38°C、14(Tl80r/min。
8.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述二甲基亞砜的濃度為 0.2 1.0%v/vo
9.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述樺木醇的濃度為100mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種座囊霉菌突變株及其催化生產(chǎn)樺木酮醇的方法，該突變株為座囊霉菌(Dothideomycete sp.)UV 14，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC NO.M 2012523。生產(chǎn)樺木酮醇的方法包括如下步驟座囊霉菌經(jīng)活化后，接種至含有氯化鈉的土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1~3天；加入樺木醇和二甲基亞砜后，反應(yīng)12~60小時(shí)過(guò)濾，濾液用乙酸乙酯萃??；過(guò)濾所得菌體經(jīng)凍干后，加入乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有機(jī)相，在真空下除去溶劑，經(jīng)柱層析后，得到產(chǎn)物樺木酮醇。本發(fā)明具有區(qū)域選擇性高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、轉(zhuǎn)化效率高，反應(yīng)時(shí)間短、目的產(chǎn)物收率高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/14GK103114042SQ20121056028
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者宗敏華, 李寧, 胡瑩丹 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)