專利名稱：可用于檢測與精神分裂癥相關(guān)的drd4基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助診斷精神分裂癥的檢測試劑盒，尤其是涉及一種可用于檢測與精神分裂癥相關(guān)的DRD4基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
精神分裂癥(Schizophrenia)是重大的精神疾病之一，精神分裂癥可引起思考方式及情緒反應(yīng)的崩潰，具體表現(xiàn)有感覺、知覺、思維、情感以及意志行為等障礙。精神分裂癥是一種遺傳因素和環(huán)境心理因素共同作用引起的疾病。據(jù)了解，中國目前的精神分裂癥患者高達780萬。全世界，每100人中就有一名精神分裂癥患者。當前雖然精神病學研究主要致力于神經(jīng)科學領(lǐng)域，但至今未找出合理的發(fā)病機制。因此，開展可行性的精神分裂癥研究具有很大的如景。多巴胺受體D4 (DRD4)分布于中腦邊緣區(qū)，是由基因編碼的一種G蛋白偶聯(lián)受體，而DRD4基因位于11ρ15.5 (第11號染色體短臂15區(qū)5帶)。目前國內(nèi)外的研究已經(jīng)證明“精神分裂癥的臨床癥狀是由于中樞多巴胺活動過強造成的”。而且也有研究背景表明基因的甲基化是在不改變DNA序列情況下，影響基因表達。基因甲基化和精神分裂癥之間是否存在相關(guān)性有待進一步驗證。目前，國內(nèi)外還沒有公開任何關(guān)于用于檢測與精神分裂癥相關(guān)的DRD4基因甲基化程度的試劑盒的相關(guān)研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可用于檢測與精神分裂癥相關(guān)的DRD4基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，其中DRD4基因甲基化水平與精神分裂癥患病率呈負相關(guān)，檢測效率高，針對性強。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種可用于檢測與精神分裂癥相關(guān)的DRD4基因甲基化程度的試劑盒，該試劑盒包括一對DRD4基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物及甲基化特異性測序弓丨物，其中
所述的甲基化特異性擴增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:
5’ - GTGAATTTAGGAGGTTGGGGTAGA _3’ ；
所述的甲基化特異性擴增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:
5’ -Biotin- CAAAAAAACAAACAACCCCTCTAA -3’ ；
所述的甲基化特異性測序引物如SEQ ID N0.3所示:
5，- TTGGGGTAGAGATTAGT -3'一種可用于檢測與精神分裂癥相關(guān)的DRD4基因甲基化程度的試劑盒的應(yīng)用，在外周血檢測中，該試劑盒可用于男 性人群精神分裂癥的輔助診斷、檢測或篩查藥物中。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:本發(fā)明首次公開了可用于檢測與精神分裂癥相關(guān)的DRD4基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，DRD4基因啟動子區(qū)域的高甲基化水平導致DRD4基因的低表達，從而影響DRD4在腦部通路轉(zhuǎn)運的循環(huán)量減少，最后導致精神分裂癥的發(fā)生和發(fā)展。因此DRD4基因甲基化水平與精神分裂癥患病率呈負相關(guān)，以檢測DRD4基因啟動子區(qū)甲基化水平為基礎(chǔ)的診斷試劑盒可以方便快捷地在分子水平上實現(xiàn)對精神分裂癥的檢測，檢測效率高，針對性強，同時，以DRD4基因啟動子區(qū)甲基化為靶點的藥物有望成為精神分裂癥輔助診斷、檢測和篩選的一種新手段。


圖1為DRD4基因被檢測序列所在區(qū)域以及所檢測的5個CpG點的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果；(例如CpGl與CpG2的相關(guān)系數(shù)為0.98，CpG2與CpG3的相關(guān)系數(shù)為0.95)
圖2為甲基化水平檢測結(jié)果示例:表示甲基化程度，如圖示CpGl到CpG5的甲基化程度分別為76%，68%，87%，100%, 98%, 87% ;圖中陰影部分顯示的是對應(yīng)CpG位點的信號強度，結(jié)合該位點附近堿基種類可分析得到其甲基化水平(即陰影框?qū)?yīng)的上方數(shù)字)。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
具體實施例1、研究對象的收集
從某醫(yī)院收集精神分裂癥患者，總共354例，同時收集300名正常者作為對照組，經(jīng)過年齡(最終選定樣本的年齡均在30歲上下)、性別、知識背景以及DNA相關(guān)濃度這些數(shù)據(jù)的分析，篩選出匹配指數(shù)(年齡，學歷，性別)較高的實驗樣本量:30名精神分裂癥患者(15名男性+15名女性)，30名正常對照組(15名男性+15名女性)。2、基因組DNA的提取
應(yīng)用Lab-Aid 820全自動核酸提取儀(中國廈門致善生物科技有限公司，500ul體系)提取樣本的全血基因組DNA，再通過核酸蛋白測定儀檢測所得DNA的濃度，以供DRD4基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平的檢測。3、DNA甲基化水平測定
本研究采用重亞硫酸鹽焦磷酸測序技術(shù)對DRD4基因啟動子區(qū)的6個CpG位點(如圖1)進行了 DNA甲基化水平檢測。此技術(shù)的基本原理:用試劑盒中的重亞硫酸鹽處理DNA樣品后，再應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增，可使發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)堿基保持不變，而使未發(fā)生甲基化的C轉(zhuǎn)變成了尿嘧啶(U)，然后通過測序引物進行PCR測序，從而得到哪個位點發(fā)生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design軟件進行引物設(shè)計,用于實驗的PCR擴增引物和測序引物如下:
(1)甲基化特異性上游引物(Forwardprimer)
5’ - GTGAATTTAGGAGGTTGGGGTAGA -3’ (SEQ ID N0.1),
(2)甲基化特異性下游引物(Reverseprimer)
5’ -Biotin- CAAAAA AACAAACAACCCCTCTAA -3’ (SEQ ID N0.2)；
(3)甲基化特異性測序引物(Sequencingprimer)
5’ - TTGGGGTAGAGATTAGT -3’ (SEQ ID N0.3)。
上述擴增的具體步驟為:
A.采用QIAGEN EpiTect*亞硫酸氫鹽處理試劑盒(EpiTech BisulfiteKits; Qiagen; #59104)對樣本DNA進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。B.取步驟A中轉(zhuǎn)化過的DNA樣本20ng加入到Pyromark PCR試劑盒(PyromarkPCR Kit; Qiagen; #978703)，并加入上述一對DRD4基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物，進行PCR擴增，擴增條件:首先95°C 15min的變性；接著95°C 15s, Tm 30s, 72°C 20s，共50個循環(huán)的退火反應(yīng)；然后延伸反應(yīng)72°C 5min。(注:Tm在實驗中根據(jù)跑PCR梯度溫度確定)
C.焦磷酸測序的前期準備:在PSQ96板中預(yù)先加入45μ I含有0.3μ M上述甲基化特異性測序引物的退火緩沖液(PyroMark Annealing Buffer;產(chǎn)品貨號:Qiagen;#979009);將需要使用的混勻的瓊脂糖珠總量(每樣本3 μ I)轉(zhuǎn)移到一個Eppendorf管中；在瓊脂糖珠中加入結(jié)合緩沖液(PyroMark Binding Buffer;產(chǎn)品貨號:Qiagen;#979006)，使得平均每個樣品約有50 μ I的體積，將混合物混勻；將以上混合物加入PCR產(chǎn)物(50 μ I反應(yīng)體積)中，每樣本50 μ I ;將PCR產(chǎn)物在常溫下混勻10分鐘，使得磁珠與生物素結(jié)合；在真空預(yù)備工作站中，四個樣品板中依次加入180ml的高純水、70%乙醇、洗滌緩沖液(PyroMark Wash Buffer;產(chǎn)品貨號:Qiagen; #979008)和120ml的變性緩沖液(PyroMark Denaturation Solution; Qiagen;產(chǎn)品貨號:#979007);打開真空預(yù)備工作站的泵，將真空準備工具在高純水中清洗30秒；然后將真空準備工具(PyroMark Vacuum PrepFilter Probes;產(chǎn)品貨號:Qiagen; #979010)移到PCR板中，抓取瓊脂糖珠(在磁珠與PCR產(chǎn)物結(jié)合后三分鐘內(nèi)完成此操作)；拿起PCR板，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準備工具上；將真空準備工具放入70%乙醇中5秒；然后移到變性緩沖液中5秒；再移到洗滌緩沖液中清洗5 — 10秒；關(guān)掉泵；將真空準備工具放入含有測序引物的板中，搖動，釋放瓊脂糖珠(測序引物也可最后加入);使用高純水清洗真空準備工具；將放有樣品的PSQ96板放在加熱板上加熱到80°C 2分鐘，再冷卻到室溫，即可進行焦磷酸測序反應(yīng)。

D.焦磷酸測序:在PyroMark Q24焦磷酸測序儀上,采用Pyromark Gold Q24試劑盒(Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen; #978802)對步驟 C 中的 PSQ96 板中的樣本進行測序，然后應(yīng)用PyroMark CpG軟件對結(jié)果進行甲基化分析(甲基化水平檢測結(jié)果示例見圖2)。4、數(shù)據(jù)分析
本次研究采用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行整理分析，我們發(fā)現(xiàn):被檢測的6個CpG位點中有5個位點(CpGU CpG2、CpG3、CpG4和CpG6)之間存在顯著相關(guān)性(R>0.8，Ρ〈0.001，有統(tǒng)計學意義，見圖1):(Ρ < 0.05時有統(tǒng)計學意義，下同)，因此我們把CpGl-CpG4，CpG6求平均值后，分性別比較了病例組與對照組間DRD4基因啟動子區(qū)甲基化水平的差異，結(jié)果(見表I)發(fā)現(xiàn)CpG5以及CPG1-4，CPG6在男性中與精神分裂癥存在關(guān)聯(lián)(p < 0.05)。和其他技術(shù)相比，本發(fā)明設(shè)計的這種試劑盒可以從DRD4基因的甲基化程度的指標上，精確地對待測的樣品進行精神分裂癥的篩選。相比較一般采用的測量表，在定性上更具有說服力。同時，也可以通過甲基化程度的變化，可以初步判斷病情的發(fā)病程度。更加有效、簡便地對患者進行動態(tài)檢測，具有準確可靠、靈活快速和經(jīng)濟節(jié)約的優(yōu)點。表I分層后病例組與對照組間的比較(n=60)
權(quán)利要求
1.一種可用于檢測與精神分裂癥相關(guān)的DRD4基因甲基化程度的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括一對DRD4基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物及甲基化特異性測序引物，其中所述的甲基化特異性擴增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:5’ - GTGAATTTAGGAGGTTGGGGTAGA _3’ ； 所述的甲基化特異性擴增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:5’ -Biotin- CAAAAAAACAAACAACCCCTCTAA -3’ ； 所述的甲基化特異性測序引物如SEQ ID N0.3所示: 5，- TTGGGGTAGAGATTAGT -3'
2.一種如權(quán)利要求1所述的可用于檢測與精神分裂癥相關(guān)的DRD4基因甲基化程度的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于:在外周血檢測中，該試劑盒可用于男性人群精神分裂癥的輔助診斷、檢測或篩查藥物中。
全文摘要
本發(fā)明公開了可用于檢測與精神分裂癥相關(guān)的DRD4基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，特點是該試劑盒包括一對DRD4基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物及一個甲基化特異性測序引物，其中上游引物具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，甲基化特異性測序引物如SEQIDNO.3所示，優(yōu)點是該診斷試劑盒可以方便快捷地在分子水平上實現(xiàn)對精神分裂癥的檢測，檢測效率高，針對性強，同時，以DRD4基因啟動子區(qū)甲基化為靶點的藥物有望成為精神分裂癥輔助診斷、檢測和篩選的一種新手段。
文檔編號C12Q1/68GK103103256SQ20121056045
公開日2013年5月15日 申請日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者周科娜, 段世偉, 戴東君, 鄭榮炯, 章凱, 莊起東 申請人:寧波大學