專利名稱：豇豆白蛋白亞組分1b及其制備與在綠色殺蟲劑中應(yīng)用的制作方法
豇豆白蛋白亞組分1b及其制備與在綠色殺蟲劑中應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于植物生物工程和無公害生物殺蟲劑的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種豇豆白蛋白亞組分Ib及其制備與在綠色殺蟲劑中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
儲(chǔ)糧害蟲的危害是世界上糧食儲(chǔ)藏中的一個(gè)重要問題，它們能夠嚴(yán)重降低儲(chǔ)糧的產(chǎn)量和質(zhì)量。我國(guó)每年糧食收獲后由于儲(chǔ)糧害蟲造成約3% 5%的損失。據(jù)國(guó)家糧食局相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)字表明2004年中國(guó)的糧食總產(chǎn)量約為4. 5億噸，農(nóng)戶儲(chǔ)糧約為2. 7億噸，若能將儲(chǔ)糧損失由10%減少到4%左右，就等于增產(chǎn)了 1620萬噸糧食，這相當(dāng)于我國(guó)產(chǎn)糧大省山東一年的小麥產(chǎn)量。因此，儲(chǔ)糧害蟲的防治工作應(yīng)引起大家的高度重視。這在當(dāng)前我國(guó)人口不斷增加，耕地面積不斷減少，糧食產(chǎn)量逐年下降，糧食缺口日益增大的形勢(shì)下，減少已經(jīng)收獲糧食的損失，開發(fā)“無形糧田”，有著特別重要的意義。
目前，我國(guó)在國(guó)家糧庫(kù)和地方糧庫(kù)中主要采用熏蒸劑和化學(xué)防護(hù)劑防治儲(chǔ)糧害蟲，由此產(chǎn)生的3R問題即殘留(Residue)、抗性(Resistance)及害蟲再娼獗(Resurgence) 也日趨明顯。因此，尋找更有效、安全的方法來控制儲(chǔ)糧害蟲的危害，一直都是我們所面臨的緊迫課題。
利用植物次生代謝產(chǎn)物開發(fā)與環(huán)境和諧的殺蟲劑是當(dāng)今生物農(nóng)藥的研究熱點(diǎn)。植物次生代謝產(chǎn)物是植物長(zhǎng)期與昆蟲協(xié)同進(jìn)化過程中抵御昆蟲植食行為而產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)， 這些活性物質(zhì)可以經(jīng)過加工成為植物性殺蟲劑，對(duì)害蟲具有多種生物活性、對(duì)天敵影響小、 在環(huán)境中容易降解、昆蟲不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，符合新世紀(jì)對(duì)農(nóng)藥的要求。隨著我國(guó)可持續(xù)植保發(fā)展戰(zhàn)略的實(shí)施，對(duì)農(nóng)藥的安全使用要求也日益嚴(yán)格，尤其對(duì)儲(chǔ)糧害蟲中應(yīng)用的殺蟲劑，要求既能防治害蟲的發(fā)生，又不對(duì)儲(chǔ)糧和環(huán)境產(chǎn)生污染，且不對(duì)人的健康造成威脅。 因此，植物源高效低毒殺蟲劑的研究與應(yīng)用是儲(chǔ)糧害蟲防治工作中一個(gè)非常重要的研究課題。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種豇豆白蛋白亞組分 Ib0
本發(fā)明的另一目的在于提供所述的豇豆白蛋白亞組分Ib的制備方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供所述的豇豆白蛋白亞組分Ib的應(yīng)用，可用于制備綠色殺蟲劑。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種豇豆白蛋白亞組分lb，氨基酸序列如下所不Ala Ser Cys Asn Gly Val Cys Ser Pro Phe Glu Met Pro Pro Cys GlyThr Ser Val Cys Arg Cys He Pro Val Gly Leu Val He Gly Tyr Cys Arg Asn Pro SerGly ;縮寫形式如下ASCNGVCSPFEMPPCGTSVCRCIPVGLVIGYCRNPSG ；
編碼所述的豇豆白蛋白亞 組分Ib的核苷酸序列如下所示GCTTCTTGCAACGGTGTTTGCTCTCCGTTCGAAATGCCGCCGTGCGGTACCTCTGTTTGCCGTTGCATCCCGGTTGGTCTGGTTATCGGTTACTGC CGTAACCCGTCTGGT ；
所述的豇豆白蛋白亞組分Ib優(yōu)選通過DNA體外重組的方法，構(gòu)建出表達(dá)豇豆白蛋白亞組分Ib的基因工程菌，通過液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的方式進(jìn)行豇豆白蛋白亞組分Ib的批量生產(chǎn)，具體包含以下步驟
(I)重組蛋白生產(chǎn)的基因工程菌株構(gòu)建
以豇豆cDNA文庫(kù)為模板，以上游弓丨物Xho1-PA-F和下游引物Not1-PA-R為引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段，目的基因片段與畢赤酵母表達(dá)載體pPICZa經(jīng)內(nèi)切酶Xho I和Not I雙酶切后連接，構(gòu)建表達(dá)產(chǎn)物的重組質(zhì)粒pPICZ a -1b ;重組質(zhì)粒 pPICZ a -1b經(jīng)Sal I處理成線狀后，采用電轉(zhuǎn)化的方法將其導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞GS115，在含Zeocin選擇壓力的YPD培養(yǎng)基中，篩選具有目的蛋白表達(dá)能力的基因工程轉(zhuǎn)化菌株；
上游引物Xho1-PA-F 5/ -CTC TCG AGA MA GAG AGG CTG CTT CTTGCA ACG GTG TTT G-3'；
下游引物Not1-PA-R 5/ -GAT CTC AGT GGT GGT GGT GG-3'；
(2)豇豆白蛋白亞組分Ib重組蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)
①富集菌體將步驟(I)得到的基因工程轉(zhuǎn)化菌株接種到MGYH液體培養(yǎng)基中，在 25 30°C下培養(yǎng)至0D600為2. 6，得到發(fā)酵液；將發(fā)酵液離心，收集細(xì)胞；
②誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)用BMMH液體培養(yǎng)基懸浮步驟①得到的細(xì)胞至0D600為 O. 1，繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)抗蟲蛋白表達(dá)，每24h添加甲醇，保持甲醇在培養(yǎng)體系中的終濃度為體積百分比O. 5%，維持誘導(dǎo)壓力，促使重組蛋白表達(dá)；
(3)豇豆白蛋白亞組分Ib重組蛋白的分離純化將步驟(2)經(jīng)甲醇誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的發(fā)酵液離心除去細(xì)胞后，上清液采用截留分子量IOK的超濾膜分離，濾液采用HPLC (高效液相色譜法)分離，HPLC分離條件如下色譜分離柱為5 μ NucleoSil-300C18，洗脫液為含體積百分比O. 1%三氟乙酸的乙腈溶液，其中乙腈溶液為線性梯度，乙腈起始濃度為體積百分比20%，終濃度為體積百分比99. 9%，總洗脫時(shí)間為60min，流速lml/min，收集滯留時(shí)間為28 30min的分部組分，真空干燥，得到豇豆白蛋白亞組分Ib重組蛋白；
步驟(I)中所述的PCR 的條件如下94°C 5min ；94°C 60s, 55 °C 50s, 72 °C 50s，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；
步驟(I)中所述的畢赤酵母表達(dá)載體pPICZa包括pPICZ a-A、pPICZ a-B和 pPICZa -C ；
步驟(2)中所述的MGYH液體培養(yǎng)基的組成如下1. 34% (w/v)YNB (YeastNitrogen Base), 1% (w/v)甘油，450 μ g/L 生物素，O. 004% (w/v)組氨酸;
步驟(2)中所述的BMMH液體培養(yǎng)基的組成如下100mmol/L磷酸鈉，pH6. O,1. 34% (w/v) YNB, 450 μ g/L 抗生素博萊霉素(Zeocin), 0. 5% (v/v)甲醇和 O. 004% (w/v)組氨酸；
所述的豇豆白蛋白亞組分Ib在制備綠色殺蟲劑中的應(yīng)用；綠色殺蟲劑指的是不對(duì)儲(chǔ)糧和環(huán)境產(chǎn)生污染，且不對(duì)人的健康造成威脅的殺蟲劑；
一種豆科植物源性儲(chǔ)糧害蟲無公害綠色殺蟲劑，包含活性成分豇豆白蛋白亞組分 Ib，豇豆白蛋白亞組分Ib的含量為質(zhì)量百分比O. 02 O. 10% ；
所述的豆科植物 源性儲(chǔ)糧害蟲無公害綠色殺蟲劑，優(yōu)選包含以下按質(zhì)量百分比計(jì)的成分
0.02 0.10%5.0~ 15.0%10.0 25.0%1.0 2.0% 50.0 85.0%;SlTji白蛋白亞組分Ib 木質(zhì)素磺酸鹽拉開粉苯甲酸鈉淀粉
所述的淀粉優(yōu)選為小麥面粉；
所述的豆科植物源性儲(chǔ)糧害蟲無公害綠色殺蟲劑的制備方法，包含以下步驟
(I)將豇豆白蛋白亞組分Ib溶解于O. 05mol/L、pH6. O的磷酸鹽緩沖液中，然后加入淀粉混勻，制成顆粒，室溫放置過夜干燥；
(2)在步驟(I)干燥后的顆粒中加入木質(zhì)素磺酸鹽、拉開粉和苯甲酸鈉，混勻后，粉碎，得到豆科植物源性儲(chǔ)糧害蟲無公害綠色殺蟲劑；
其中，各成分的質(zhì)量百分含量如下丨蛋白亞組分Ib 木質(zhì)素磺酸鹽拉開粉苯甲酸鈉0.02 0.10%5.0—15.0%10.0—25.0%1.0 2.0%浞粉50.0 85.0%;
步驟(I)中所述的顆粒的粒徑優(yōu)選為O. 5mm。
所述的豆科植物源性儲(chǔ)糧害蟲無公害綠色殺蟲劑特別適合作用于米象。
本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果
(I)本發(fā)明提供的豇豆白蛋白亞組分Ib對(duì)于米象具有良好的生物毒活性。由于豇豆白蛋白亞組分Ib來自可食用的生物，因此對(duì)人體無毒。
(2)本發(fā)明通過液體深層發(fā)酵密集培養(yǎng)的方式來批量獲得目的產(chǎn)物，首次實(shí)現(xiàn)了豆科植物活性組分豇豆白蛋白亞組分Ib資源的規(guī)?；a(chǎn)。本 發(fā)明工藝簡(jiǎn)便，成本低，產(chǎn)量高，重組蛋白獲得率約為150. Omg/L，在植物資源的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。


圖1是O. 5%甲醇誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析圖。
圖2是為HPLC分離重組蛋白的分部收集示意圖，其中曲線I為原始菌株對(duì)照；曲線2為重組菌株。
圖3為重組蛋白分尚純化SDS-PAGE分析圖,其中泳道M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記,泳道I為空質(zhì)粒對(duì)照，泳道2為HPLC分離組分，泳道3為超濾分離組分。
圖4為重組蛋白對(duì)糧儲(chǔ)象蟲的毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)比圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例1
制備豇豆白蛋白亞組分Ib
(I)表達(dá)重組蛋白的基因工程菌構(gòu)建；
選擇畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZ a A (Invitrogen Co.公司)作為目的基因的表達(dá)載體，使目的蛋白上游與α因子分泌信號(hào)肽和Glu-Lys-Arg識(shí)別序列(該序列能被氨基肽酶 Kex2識(shí)別)直接融合，從而使表達(dá)蛋白可能分泌在發(fā)酵培養(yǎng)基中，有利于后面的分離、純化過程。
設(shè)計(jì)引物
上游引物Xho1-PA-F 5/ -CTC TCG AGA AAA GAG AGG CTG CTT CTTGCA ACG GTG TTT G-3/ ；
下游引物Not1-PA-R 5/ -GAT CTC AGT GGT GGT GGT GG-3'；
以豇豆cDNA文庫(kù)(Qiagen Co.公司)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段① 使用 Taq DNA 聚合酶(Promega 公司)94°C 5min ；94°C 60s、55°C 50s,72°C 50s，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin。
將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠(質(zhì)量體積比1%)電泳，在紫外燈透射條件下回收 362bp 位置凝膠,用 QIAquick PCR Purification Kit 試劑盒(Qiagen Co.)純化,獲得純化后的PCR產(chǎn)物。
PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pPICZ a A分別在雙酶切反應(yīng)體系中消化，反應(yīng)體系組成如下
PCR產(chǎn)物或表達(dá)載體pPICZaA 0.5μβ XhoI (TaKaRa 公丨丨J):1.5μ1 \otI (TaKaRa 公"Γ):1.5μ I Οχ H bufferΙΟ.ΟμΙ
雙蒸水補(bǔ)足50. O μ I。
37°C下酶消化反應(yīng)3h。
雙酶切產(chǎn)物分別通過Mini preparation Kit試劑盒(Qiagen公司)純化,獲得雙酶切后的PCR產(chǎn)物(CpAlb-Xho1-NotI)和線性化后的表達(dá)載體(pPICZ a A—Xho1-NotI)。
上述兩個(gè)產(chǎn)物在連接反應(yīng)體系中進(jìn)行連接反應(yīng)，其反應(yīng)體系組成如下
IOx連接緩沖液2·0μ1PCR產(chǎn)物酶切片段(0.2pg)2.0μ1線性化表達(dá)載體(O.l pg)2.0μ1Τ4 DNA 連接酶(TaKaRa 公司)Ι.ΟμΙ
雙蒸水補(bǔ)足20. O μ I。
混勻，16 °C下連接反應(yīng)12h。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(大連寶生生物公司)，通過PCR擴(kuò)增后測(cè)序，確定得到重組質(zhì)粒pPICZ a Alb。
將約10 μ g重組質(zhì)粒pPICZ a Alb經(jīng)Sal I處理成線狀后，采用電轉(zhuǎn)化的方法(電壓1. 5kv，電容25 μ F，電阻200 Ω，電擊時(shí)間4 IOmsec)將其導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞(Pichia pastoris strain GS115, his4, Invitrogen 公司)。在含 100yg/ml Zeocin 選擇壓力的 YI3D培養(yǎng)基中，篩選具有目的蛋白表達(dá)能力的基因工程轉(zhuǎn)化菌。采用Northern blot雜交技術(shù)(參見 Sambrook J, Fritsch E F，Maniatis T. MolecularCloning. A Laboratory Manual, 2nd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1999)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯不部分轉(zhuǎn)化菌株中(如G9和G22)目的蛋白mRNA存在轉(zhuǎn)錄的情況，表明表達(dá)重組蛋白的基因工程菌株已經(jīng)被成功構(gòu)建。
(2)畢赤酵母菌體的培養(yǎng)(采用兩步培養(yǎng)法)
第一步，富集菌體基因工程轉(zhuǎn)化菌株接種到含50ml MGYH培養(yǎng)基1. 34% (w/v) YNB, Yeast Nitrogen Base, Invitrogen 公司的酵母培養(yǎng)基產(chǎn)品)，1% (w/v)甘油，450 μ g/ L生物素，O. 004% (w/v)組氨酸的250ml三角瓶中，在30°C下培養(yǎng)24h (0D600約2. 6)，搖床轉(zhuǎn)速約300r/min。30°C下,發(fā)酵液在離心力3000Xg下離心IOmin,移去上清液,收集細(xì)胞。
第二步，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)將上一步收集的細(xì)胞用約200ml BMMH培養(yǎng)基100mmol/L 憐酸納，pH6. O,1. 34% (w/v) YNB, 450 μ g/L 抗生素 Zeocin, 0. 5% 甲醇(v/v)和0.004%組氨酸(w/v)，重新懸浮細(xì)胞至A600為0. 1，放入IL燒瓶中培養(yǎng)，誘導(dǎo)抗蟲蛋白表達(dá)。每24h添加100%甲醇保持甲醇終濃度為0.5% (v/v)，維持誘導(dǎo)壓力，促使重組蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖1所示0. 5% (v/v)的甲醇誘導(dǎo)72小時(shí)，融合蛋白開始表達(dá)，到96小時(shí)開始維持較高的表達(dá)量，120小時(shí)后開始出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。
(3)豇豆白蛋白亞組分Ib重組蛋白的分離純化
取200ml經(jīng)96小時(shí)誘導(dǎo)的發(fā)酵液，3000 X g離心除菌后，上清液采用Ultrafree_15 超濾膜(10K)分離。濾液進(jìn)一步用HPLC分離，色譜分離柱為5μΝικ:1θΟ 1-300α8，洗脫液為含體積百分比0. 1%三氟乙酸的乙腈溶液，其中乙腈溶液為線性梯度，乙腈起始濃度為體積百分比20 %，終濃度為體積百分比99. 9% ;流速lml/min下洗脫60min，收集滯留時(shí)間為 28 30min的分部組分，真空干燥，得到豇豆白蛋白亞組分Ib重組蛋白干粉。重組蛋白干粉的產(chǎn)量約為150. 0mg/L，結(jié)果如圖2和圖3所示。
本發(fā)明通過獨(dú)特的工藝，簡(jiǎn)便的方法，使豆科植物豇豆白蛋白亞組分Ib的來源實(shí)現(xiàn)了深層發(fā)酵的規(guī)?；a(chǎn)，而且畢赤酵母表達(dá)重組蛋白的成本低，產(chǎn)量高，分離純化工藝簡(jiǎn)便，在稀缺資源的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例2
以畢赤酵母表達(dá)生產(chǎn)的豇豆白蛋白亞組分Ib重組蛋白為主要活性成分的殺蟲劑制備
準(zhǔn)確稱取重組白蛋白0.1g ;加入2. Oml濃度為0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液(每 IOOml 由 0. 05mol/L KH2PO4 68. 5ml 與 0. 05mol/L K2HPO4 31.5ml 組成，下同)(ρΗ6·5)，充分溶解；再加入70. Og小麥面粉，充分混合均勻，并搓成0. 5_左右的小顆粒，于室溫下放置過夜干燥。接著加入木質(zhì)素磺酸鹽lO.Og、拉開粉15. Og和苯甲酸鈉鹽2. 0g，充分拌勻，并粉碎，得到豆科植物源性儲(chǔ)糧害蟲無公害綠色殺蟲劑。
取樣,喂食米象(Sitophilus oryzae)進(jìn)行毒性檢測(cè)。
毒性檢測(cè)包含以下步驟
實(shí)驗(yàn)室中,米象(亦稱象鼻蟲,Sitophilus oryzae)在27. 5°C和70%的相對(duì)濕度下生長(zhǎng)，喂食小麥或豇豆。實(shí)驗(yàn)用象鼻蟲培養(yǎng)近30代。實(shí)驗(yàn)所用的象鼻蟲為chine株系(抗性株系，廣州中山大學(xué)生物防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)和benin株系(敏感株系，廣州中山大學(xué)生物防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)。
將豆科植物源性儲(chǔ)糧害蟲無公害綠色殺蟲劑分別給30個(gè)抗性成蟲和敏感性成蟲喂食,每天觀察象鼻蟲死亡個(gè)數(shù),直到敏感性蟲死亡率達(dá)到95%，利用軟件(StatView program of SAS Institute Inc.)分析半致死劑量 LC50。
結(jié)果表明，重組蛋白對(duì)敏感型蟲表現(xiàn)出很高的毒性，半致死劑量達(dá)到4. 7，與來源于天然植物豇豆活性蛋白的毒性一致；而對(duì)抗性蟲的毒性效果不明顯，結(jié)果如圖4所示。
實(shí)施例3
(I)制備含有豇豆白蛋白亞組分Ib重組蛋白的畢赤酵母細(xì)胞干粉
在實(shí)施例1步驟(2)的基礎(chǔ)上，取200ml經(jīng)96小時(shí)誘導(dǎo)的發(fā)酵液，3000 X g離心 15min，收集酵母細(xì)胞，用蒸餾水洗滌3X20ml，于50°C烘箱中放置過夜，取出研碎塊狀物即為含有豇豆白蛋白亞組分Ib重組蛋白的畢赤酵母細(xì)胞干粉。
(2)以含有豇豆白蛋白亞組分Ib重組蛋白的畢赤酵母細(xì)胞干粉為主要活性成分的殺蟲劑制備
準(zhǔn)確稱取含有重組白蛋白的畢赤酵母細(xì)胞干粉(每g畢赤酵母細(xì)胞干粉含有豇豆白蛋白亞組分Ib重組蛋白0. 005g) 5. Og ;加入10. Oml濃度為0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液 (pH6. 5)，充分濕潤(rùn)拌勻；加入65. Og小麥面粉，充分混合均勻，并搓成0. 5mm左右的小顆粒， 于室溫下放置過夜干燥；加入木質(zhì)素磺酸鹽10. 0g、拉開粉10. Og和苯甲酸鈉鹽2. 0g，充分拌勻，并粉碎加工處理；
取樣，喂食實(shí)驗(yàn)儲(chǔ)糧米象進(jìn)行毒性檢測(cè)。
結(jié)果表明，以含有豇豆白蛋白亞組分Ib重組蛋白畢赤酵母細(xì)胞干粉為主要活性成分的殺蟲劑同樣對(duì)敏感型蟲表現(xiàn)出較好的毒殺作用，半致死劑量達(dá)到15. 6，按有效成分豇豆白蛋白亞組分Ib質(zhì)量百分比計(jì)算，毒性效果與實(shí)施例2相當(dāng)，對(duì)抗性蟲的毒性效果同樣不明顯。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下 所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種豇豆白蛋白亞組分lb，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述的豇豆白蛋白亞組分Ib的核苷酸序列SEQID NO. 2所示。
3.權(quán)利要求1所述的豇豆白蛋白亞組分的制備方法，其特征在于包含以下步驟Cl)重組蛋白生產(chǎn)的基因工程菌株構(gòu)建以豇豆cDNA文庫(kù)為模板，以上游引物Xho1-PA-F和下游引物Not1-PA-R為引物對(duì)， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段，目的基因片段與畢赤酵母表達(dá)載體pPICZa經(jīng)內(nèi)切酶Xho I和Not I雙酶切后連接，構(gòu)建表達(dá)產(chǎn)物的重組質(zhì)粒pPICZa -1b ;重組質(zhì)粒pPICZa -1b經(jīng) Sal I處理成線狀后，采用電轉(zhuǎn)化的方法將其導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞GS115，在含Zeocin選擇壓力的YPD培養(yǎng)基中，篩選具有目的蛋白表達(dá)能力的基因工程轉(zhuǎn)化菌株；上游引物 Xho1-PA-F 5/ -CTC TCG AGA AAA GAG AGG CTG CTT CTTGCA ACG GTG TTT G-3'；下游引物 Not1-PA-R 5/ -GAT CTC AGT GGT GGT GGT GG-3'；(2)豇豆白蛋白亞組分Ib重組蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)①富集菌體將步驟(I)得到的基因工程轉(zhuǎn)化菌株接種到MGYH液體培養(yǎng)基中，在25 30°C下培養(yǎng)至0D600為2. 6，得到發(fā)酵液；將發(fā)酵液離心，收集細(xì)胞；②誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)用BMMH液體培養(yǎng)基懸浮步驟①得到的細(xì)胞至0D600為O.1，繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)抗蟲蛋白表達(dá)，每24h添加甲醇，保持甲醇在培養(yǎng)體系中的終濃度為體積百分比O. 5%，維持誘導(dǎo)壓力，促使重組蛋白表達(dá)；(3)豇豆白蛋白亞組分Ib重組蛋白的分離純化將步驟(2)經(jīng)甲醇誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的發(fā)酵液離心除去細(xì)胞后，上清液采用截留分子量IOK的超濾膜分離，濾液采用HPLC分離， HPLC分離條件如下色譜分離柱為5μ NucleoSil-300C18，洗脫液為含體積百分比O. 1%三氟乙酸的乙腈溶液，其中乙腈溶液為線性梯度，乙腈起始濃度為體積百分比20%，終濃度為體積`百分比99. 9%,總洗脫時(shí)間為60min,流速lml/min,收集滯留時(shí)間為28 30min的分部組分，真空干燥，得到豇豆白蛋白亞組分Ib重組蛋白；步驟(2)中所述的MGYH液體培養(yǎng)基的組成如下質(zhì)量體積比1. 34%的YNB，質(zhì)量體積比 1%的甘油，450 μ g/L生物素，質(zhì)量體積比O. 004%的組氨酸；步驟(2)中所述的BMMH液體培養(yǎng)基的組成如下100mmol/L磷酸鈉，pH6. 0，質(zhì)量體積比1. 34%的YNB，450 μ g/L抗生素博萊霉素，體積百分比O. 5%的甲醇和質(zhì)量體積比O. 004% 的組氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的豇豆白蛋白亞組分的制備方法，其特征在于步驟(I)中所述的 PCR 的條件如下94°C 5min ；94°C 60s,55°C 50s,72°C 50s, 35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的豇豆白蛋白亞組分的制備方法，其特征在于步驟(I)中所述的畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ α為pPICZ a -A、pPICZ a -B或pPICZ a -C。
6.權(quán)利要求1所述的豇豆白蛋白亞組分Ib在制備綠色殺蟲劑中的應(yīng)用。
7.—種豆科植物源性儲(chǔ)糧害蟲無公害綠色殺蟲劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的豇豆白蛋白亞組分lb，所述的豇豆白蛋白亞組分Ib在所述的豆科植物源性儲(chǔ)糧害蟲無公害綠色殺蟲劑的含量為質(zhì)量百分比O. 02 O. 10%。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的豆科植物源性儲(chǔ)糧害蟲無公害綠色殺蟲劑，其特征在于包含以下按質(zhì)量百分比計(jì)的成分所述的豇豆白蛋白亞組分Ib `O. 02 O. 10%、木質(zhì)素磺酸鹽·5.O 15. 0%、拉開粉10. O 25. 0%、苯甲酸鈉1. O 2. 0%、淀粉50. O 85. 0%。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的豆科植物源性儲(chǔ)糧害蟲無公害綠色殺蟲劑，其特征在于所述的淀粉為小麥面粉。
10.權(quán)利要求7所述的豆科植物源性儲(chǔ)糧害蟲無公害綠色殺蟲劑的制備方法，其特征在于包含以下步驟(1)將豇豆白蛋白亞組分Ib溶解于O.05mol/L、pH6.0的磷酸鹽緩沖液中，然后加入淀粉混勻，制成顆粒，室溫放置過夜干燥；(2)在步驟(I)干燥后的顆粒中加入木質(zhì)素磺酸鹽、拉開粉和苯甲酸鈉，混勻后，粉碎， 得到豆科植物源性儲(chǔ)糧害蟲無公害綠色殺蟲劑；其中，各成分的質(zhì)量百分含量如下豇豆白蛋白亞組分Ib O. 02 O. 10%、木質(zhì)素磺酸鹽5. O 15. 0%、拉開粉10. O ·25. 0%、苯甲酸鈉1. O 2. 0%、淀粉50. O 85. 0%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豇豆白蛋白亞組分1b及其制備與在綠色殺蟲劑中應(yīng)用。該豇豆白蛋白亞組分1b的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明采用DNA體外重組的方法，構(gòu)建出表達(dá)豇豆白蛋白亞組分1b的基因工程菌，通過液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的方式進(jìn)行豇豆白蛋白亞組分1b的批量生產(chǎn)。本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了豆科植物活性組分豇豆白蛋白亞組分1b資源的規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)便，成本低，產(chǎn)量高，重組蛋白獲得率約為150.0mg/L，在植物資源的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。該豇豆白蛋白亞組分1b對(duì)于米象具有良好的生物毒活性，可用于制備綠色殺蟲劑。
文檔編號(hào)C12N15/29GK103059113SQ20121056053
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者張毅, 林曉珊, 蔣波, 王玉海, 岳娟 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)