專利名稱：一種用于檢測宮頸癌致癌基因的引物探針、試劑盒及用于非檢測疾病目的的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測宮頸癌致癌基因的引物探針、試劑盒及用于非檢測疾病目的的檢測方法。
背景技術(shù)：
宮頸癌是全球婦女中僅次于乳腺癌和結(jié)直腸癌的第3個常見的惡性腫瘤，在發(fā)展中國家是僅次于乳腺癌居第2位常見的惡性腫瘤，是最常見的女性生殖道惡性腫瘤。2008年全球估計新發(fā)宮頸癌病例52.98萬，死亡病例25.51萬人，其中85%新發(fā)病例在發(fā)展中國家(Jemal，2011)。隨著宮頸癌篩查的開展，發(fā)達國家宮頸癌的發(fā)病率及死亡率明顯下降。宮頸癌是目前唯一一個病因明確的婦科惡性腫瘤，與高危型人乳頭瘤病毒(humanpapillomaviruses, HPV)的持續(xù)感染相關(guān)。HPV病毒是ー種雙鏈DNA病毒，具有球形外殼，直徑55nm，主要感染皮膚粘膜上皮，導致不同病變。目前已經(jīng)鑒定的HPV病毒超過200種，至少30種與生殖道粘膜感染相關(guān)。HPV婦女一生中80%可感染HPV，通常在8-10個月內(nèi)被自然清除，只有少數(shù)(5%)婦女呈持續(xù)感染狀態(tài)。根據(jù)HPV病毒與宮頸癌的關(guān)系分為高危型和低危型，高危型與宮頸癌相關(guān)，常見的亞型有:16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、73、82，宮頸鱗狀細胞癌中HPV16型最多見，其次是18、45、31和33型；宮頸腺癌中HPV18和45亞型較常見。低危型與生殖道疣相關(guān)，常見的亞型有:6、11、40、42、43、44、53、54、57、61、62、70、72、81、83、CP6108、MM4、MM7、MM9、MM9 等。在癌變初期，準確、快速、便捷地對其進行檢測，是控制和治療的關(guān)鍵。目前，多采取子宮頸刮片細胞學、宮頸管活體組織、陰道鏡等檢查方法對宮頸癌進行篩查。但是上述幾種方法操作繁瑣、準確率較低 ，對實驗條件要求高，不適于宮頸癌的早期診斷。核酸檢測技術(shù)操作簡便，反應快速，尤其是近年來發(fā)展的實時熒光定量PCR(real-timePCR)靈敏度高，且能夠監(jiān)控整個反應進程，但一直存在DNA污染造成的假陽性率高的問題，且由于其臨界值不明顯，因此檢測結(jié)果灰區(qū)較寬，無法標準化，而且由于儀器要求高，投入大，對操作人員要求高，需要進行專業(yè)技能培訓，還限制了多重檢測的應用。同時該方法對于宮頸癌含量極低的樣本仍然無法檢測，準確率較低。branch-DNA(bDNA)支鏈DNA技術(shù)利用探針捕獲待測目標，經(jīng)過雜交、信號放大、酶促化學發(fā)光，實現(xiàn)對待測核酸的定量檢測，可以對mRNA做精確的定量檢測及動態(tài)水平研究。它克服了傳統(tǒng)的real-time PCR技術(shù)中的種種缺陷與不確定因素，無需抽提純化RNA，無需反轉(zhuǎn)錄，無需PCR擴增，只要將樣本用特定裂解液裂解后，經(jīng)探針雜交與信號放大即可迅速得到更加精確的實驗結(jié)果。除各種普通樣本外，該技術(shù)對qPCR很難分析的血液樣本與保存多年后mRNA高度降解的FFPE樣本同樣具有極高的準確度與重現(xiàn)性。目前還未見利用bDNA技術(shù)對宮頸癌致癌基因的檢測的相關(guān)報道，設(shè)計、特異性強的探針具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種用于檢測宮頸癌致癌基因的探針、試劑盒及用于非檢測疾病目的的檢測方法。該探針特異性好，降低了假陽性率。該方法經(jīng)過雜交、信號放大、酶促化學發(fā)光，實現(xiàn)對待測核酸的定量檢測，不經(jīng)過呈指數(shù)增長的擴增過程，放大倍數(shù)確定，重復性,穩(wěn)定性高。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:本發(fā)明提供了一種用于檢測宮頸癌致癌基因的探針，包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；其中，標記延伸探針的序列如SEQ ID N0.1、2、7、8、13、14、19、20、25、26、31、32、37、38、43、44、49、50、55、56、61、62、67、68、73、74 中任一序列所示；捕獲延伸探針的序列如SEQ ID N0.3、4、9、10、15、16、21、22、27、28、33、34、39、40、45、46、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76 中任一序列所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.5、6、11、12、17、18、23、24、29、30、35、36、41、42、47、48、53、54、 59、60、65、66、71、72、77、78 中任一序列所示。本發(fā)明的探針設(shè)計是針對E6/E7mRNA的靶向性設(shè)計，特異性捕獲Hela細胞中的E6/E7mRNA 片段。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV16致癌基因的探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.1或2所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.3或4所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.5或6所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV18致癌基因的探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.7或8所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.9或10所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.11或12所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV31致癌基因的探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.13或14所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.15或16所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.17或18所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV33致癌基因的探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.19或20所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.21或22所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.23或24所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV35致癌基因的探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.25或26所示；
捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.27或28所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.29或30所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV39致癌基因的探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.31或32所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.33或34所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.35或36所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV45致癌基因的探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.37或38所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.39或40所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.41或42所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV51致癌基因的探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.43或44所示；
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捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.45或46所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.47或48所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV52致癌基因的探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.49或50所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.51或52所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.53或54所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV56致癌基因的探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.55或56所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.57或58所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.59或60所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV58致癌基因的探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.61或62所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.63或64所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.65或66所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV59致癌基因的探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.67或68所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.69或70所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.71或72所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV68致癌基因的探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；
標記延伸探針的序列SEQ ID N0.73或74所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.75或76所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.77或78所示。本發(fā)明還提供了上述探針用于制備檢測宮頸癌致癌基因的試劑盒；其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列如SEQ ID N0.1、2、7、8、13、14、19、20、25、26、31、32、37、38、43、44、49、50、55、56、61、62、67、68、73、74 中任一序列所示；捕獲延伸探針的序列如SEQ ID N0.3、4、9、10、15、16、21、22、27、28、33、34、39、40、45、46、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76 中任一序列所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.5、6、11、12、17、18、23、24、29、30、35、36、41、42、47、48、53、54、59、60、65、66、71、72、77、78 中任一序列所示。本發(fā)明還提供了一種用于檢測宮頸癌致癌基因的試劑盒，包括探針；探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；其中，標記延伸探針的序列如SEQ ID N0.1、2、7、8、13、14、19、20、25、26、31、32、37、38、43、44、49、50、55、56、61、62、67、68、73、74 中任一序列所示；捕獲延伸探針的序列如SEQ ID N0.3、4、9、10、15、16、21、22、27、28、33、34、39、40、45、46、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76 中任一序列所示；

預放大探針的序列SEQ ID N0.5、6、11、12、17、18、23、24、29、30、35、36、41、42、47、48、53、54、59、60、65、66、71、72、77、78 中任一序列所示。本發(fā)明還提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV16致癌基因的試劑盒，包括探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.1或2所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.3或4所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.5或6所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV18致癌基因的試劑盒，包括探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.7或8所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.9或10所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.11或12所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV31致癌基因的試劑盒，包括探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.13或14所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.15或16所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.17或18所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV33致癌基因的試劑盒，包括探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.19或20所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.21或22所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.23或24所示。
本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV35致癌基因的試劑盒，包括探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.25或26所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.27或28所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.29或30所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV39致癌基因的試劑盒，包括探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.31或32所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.33或34所示；預放大探針的序 列SEQ ID N0.35或36所示。 本發(fā)明提供了ー種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV45致癌基因的試劑盒，包括探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.37或38所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.39或40所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.41或42所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV51致癌基因的試劑盒，包括探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.43或44所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.45或46所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.47或48所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV52致癌基因的試劑盒，包括探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.49或50所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.51或52所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.53或54所示。本發(fā)明提供了ー種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV56致癌基因的試劑盒，包括探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.55或56所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.57或58所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.59或60所示。本發(fā)明提供了ー種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV58致癌基因的試劑盒，包括探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.61或62所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.63或64所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.65或66所示。 本發(fā)明提供了ー種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV59致癌基因的試劑盒，包括探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.67或68所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.69或70所示；
預放大探針的序列SEQ ID N0.71或72所示。本發(fā)明提供了一種用于檢測高危亞型人乳頭瘤病毒HPV68致癌基因的試劑盒，包括探針，其中，探針包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針；標記延伸探針的序列SEQ ID N0.73或74所示；捕獲延伸探針的序列SEQ ID N0.75或76所示；預放大探針的序列SEQ ID N0.77或78所示。在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的試劑盒中還包括酶標記的放大探針、陽性校準品、陰性對照品、底物、底物催化劑、裂解液、緩沖液。在本發(fā)明的另ー些實施例中，本發(fā)明提供的試劑盒中還包括固定探針、酶標記的放大探針、陽性校準品、陰性對照品、底物、底物催化劑、裂解液、緩沖液。作為優(yōu)選，酶標記的放大探針中的所述酶為堿性磷酸酶。作為優(yōu)選，陽性校準品為高危亞型人乳頭瘤病毒mRNA的同源性序列合成的DNA寡核苷酸。本發(fā)明提供的試劑盒中，高危亞型人乳頭瘤病毒為HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59 或 HPV68。本發(fā)明還提供了一種用于非檢測疾病用途的宮頸癌致癌基因的檢測方法，包括如下步驟:步驟1:取不同濃度梯度的高危亞型人乳頭瘤病毒的mRNA，通過捕獲延伸探針、固定探針與固相載體連接，高危亞型人乳頭瘤病毒的mRNA通過標記延伸探針與預放大探針連接后，預放大探針與酶標記的放大探針連接，獲得標準復合物；取酶標記的放大探針中酶的底物及其底物催化劑與標準復合物混合，孵育，獲得標準光強度，根據(jù)濃度與光強度的關(guān)系建立標準曲線；步驟2:取宮頸上皮脫落細胞，經(jīng)裂解獲得待測樣品的mRNA ；待測樣品的mRNA通過捕獲延伸探針、固定探針與固相載體連接；待測樣品的mRNA通過標記延伸探針與預放大探針連接后，預放大探針與酶標記的放大探針連接，獲得待測復合物；取酶標記的放大探針中所述酶的底物及其底物催化劑與待測復合物混合，孵育，獲得待測光強度；步驟3:根據(jù)待測光強度以及步驟I中標準曲線獲得待測樣品的濃度。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的檢測方法中，孵育溫度為53 56°C，孵育時間為3 4h。與HCII法相比，本發(fā)明提供的方法陽性預測值較低。首先，這是由DNA和RNA的生理作用機理決定的，DNA是穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，而mRNA是單鏈線性結(jié)構(gòu)，在整個細胞活動周期中，DNA承載者全部遺傳信息，而mRNA只是在特定時期、特定的場合才會通過DNA轉(zhuǎn)錄出來，完成蛋白質(zhì)的翻譯后，mRNA就會被Rnase降解。通常DNA的這種調(diào)節(jié)時間比較短暫,導致mRNA存在周期比DNA短的很多，這就決定了 RNA的陽性預測值比DNA低。其次，由HPV病毒的結(jié)構(gòu)決定的。HPV病毒的結(jié)構(gòu)為雙鏈環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)，分別由L1、L2、EU E2、E3、E4、E5、E6、E7等片段組成，HCII檢測的是LI片段，是高保守片段，這段區(qū)域主要作用是負責合成形成HPV病毒的外殼，對于早期游離的HPV感染，是普遍可以檢測到LI片段的，因為，此時的HPV病毒剛侵入宿主，正處于頻繁的復 制期，所以，陽性預測值很高，但是，此時的感染通常是ー過性的，會被人體的自身免疫系統(tǒng)自動清除掉，雖然，陽性預測值高，DNA會混入很多臨床無關(guān)條件，如上皮衰亡細胞、細胞碎屑、已經(jīng)失活的病毒、及其他干擾等，所以，DNA檢測無法區(qū)分病毒活性。
與HCII相比，本發(fā)明提供的方法具有如下優(yōu)點:更高的特異性，檢測標本中的HPVmRNA E6/E7可直接體現(xiàn)宮頸細胞病變的程度，避免了 HPV DNA因自身免疫清楚及其它臨床無關(guān)條件造成的假陽性，特殊的探針設(shè)計避免了探針混和物與其他HPV病毒的交叉反應，能消除假陰性和假陽性；相關(guān)性，與上皮病變程度的相關(guān)性優(yōu)于基于DNA的檢測方法；取樣簡單，樣品保存無需嚴格條件，樣品可源自液基細胞學檢測后剩余宮頸細胞或新鮮采集宮頸細胞，對于常溫放置的48天內(nèi)的標本仍然可以用于檢測；可靠，無需DNA/RNA純化，無需樣品PCR擴增，從而避免繁瑣操作導致的變異和錯誤；具有更高的敏感度，毎次檢測的檢測范圍< 200拷貝；靈活，可區(qū)分HPV各種亞型并可根據(jù)客戶需要提供不同組合的HPV病毒亞型測試試劑盒；操作流程簡單，無需特殊實驗環(huán)境；設(shè)備簡単，QuantiVirusTM冷光儀便宜可靠(96孔/12孔)，可應用于不同級別醫(yī)院，操作方便；反應條件的優(yōu)化，孵育溫度由50°C調(diào)整為53 56°C，孵育時間由過夜孵育(15h)縮短為3 4h，在得到相近或更優(yōu)的試驗結(jié)果的同時節(jié)省了檢測所需時間。本發(fā)明提供一種用于檢測宮頸癌致癌基因的探針、試劑盒及用于非檢測疾病目的的檢測方法。該探針特異性好，降低了假陽性率。該方法經(jīng)過雜交、信號放大、酶促化學發(fā)光，實現(xiàn)對待測核酸的定量檢測，不經(jīng)過呈指數(shù)增長的擴增過程，放大倍數(shù)確定，重復性，穩(wěn)定性高。


圖1示96微孔板模擬布板示意圖；其中，行A至行B示陰性對照孔，行C至行D示hela細胞株100cells/ii L，行E至行F示hela細胞株50cells/ii L，行G至行H示hela細胞株 25cells/ V- L ；圖2示實施例1中Hela細胞株100cells/ul、hela細胞株50cells/ul與hela細胞株25cellS/ul三者的光度計平行檢測相對光度単位(RLU)結(jié)果分布；圖3示實施例1中Hela細胞株100cells/ul、hela細胞株50cells/ul與hela細胞株25cellS/Ul三者的凈平均信號值后的線性相關(guān)性圖線。
具體實施例方式本發(fā)明公開了ー種用于檢測宮頸癌致癌基因的探針、試劑盒及用于非檢測疾病目的的檢測方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進エ藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技木。本發(fā)明提供的用于檢測宮頸癌致癌基因的探針、試劑盒及用于非檢測疾病目的的檢測方法中所用高危亞型人乳頭瘤病毒及試劑均可由市場購得。下面結(jié)合實施例，進ー步闡述本發(fā)明:
實施例1取HeLa細胞設(shè)計三個梯度，原始梯度為IOOcells/ U L，次級梯度為50cells/ U L，末級梯度為25cells/iiし三個梯度的體積都一致。96微孔板模擬布板示意圖如圖1所示。取樣:取樣前，先用棉簽擦拭宮頸表面的粘液和血液，將取樣器的前面刷毛部分輕輕的深插入子宮頸的通道內(nèi)，以便后面刷毛能夠完全接觸到子宮頸移行處，柔和的向前抵住取樣器，并按同一個時針方向轉(zhuǎn)動取樣器3-5周整。樣本處理:恒溫箱設(shè)置到裂解所需溫度65°C ;將離心管和標本對應編號，確認無誤；標本管內(nèi)液體混勻后轉(zhuǎn)移到離心管中，3000rpm、離心5min，倒掉上清，加2ml去離子水、懸浮沉淀，3000rpm>5min離心,倒掉上清；姆個樣本加入200 u L裂解液、400 u L去離子水、5 U L蛋白酶K，混勻后放入恒溫箱65°C孵育I小吋，間或混勻ー兩次；如果樣本量大，則裂解液、去離子水、蛋白酶K配成裂解混合液(參照有質(zhì)控試劑配置表)，每個樣本加入605 u L細胞裂解液。布板:提前20min配液(準備配液管，管外標注對照/樣本緩沖液，以便區(qū)分)，準備封板貼紙；將96孔捕獲包被板提前20min取出，放置至室溫；所有_20°C保存試劑均放置在冰上溶解，使用后盡快放入冰箱保存；在標本裂解完成后，取出標本，將恒溫箱調(diào)至雜交所需溫度55°C;本實驗需要2個質(zhì)控孔、2個空白對照及實際標本，故需要配置兩份緩沖液(對照緩沖液和標本緩沖液);每孔緩沖液組分:對照緩沖液
權(quán)利要求
1.一種用于檢測宮頸癌致癌基因的探針，其特征在于，包括捕獲延伸探針、標記延伸探針和預放大探針； 其中，所述標記延伸探針的序列如SEQ ID N0.1、2、7、8、13、14、19、20、25、26、31、32、37、38、43、44、49、50、55、56、61、62、67、68、73、74 中任一序列所示； 所述捕獲延伸探針的序列如 SEQ ID N0.3、4、9、10、15、16、21、22、27、28、33、34、39、40、45、46、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76 中任一序列所示； 所述預放大探針的序列 SEQ ID N0.5、6、11、12、17、18、23、24、29、30、35、36、41、42、47、48、53、54、59、60、65、66、71、72、77、78 中任一序列所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針用于制備檢測宮頸癌致癌基因的試劑盒。
3.一種用于檢測宮頸癌致癌基因的試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括酶標記的放大探針、陽性校準品、陰性對照品、底物、底物催化劑、裂解液、緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括固定探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述酶標記的檢測探針，其特征在于，所述酶標記的放大探針中的所述酶為堿性磷酸酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在干，所述陽性校準品為高危亞型人乳頭瘤病毒mRNA的同源性序列合成的DNA寡核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所 述的試劑盒，其特征在于，所述高危亞型人乳頭瘤病毒為HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59 或 HPV68。
9.一種用于非檢測疾病用途的宮頸癌致癌基因的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1:取不同濃度梯度的高危亞型人乳頭瘤病毒的mRNA，通過捕獲延伸探針、固定探針與固相載體連接，所述高危亞型人乳頭瘤病毒的mRNA通過標記延伸探針與預放大探針連接后，所述預放大探針與酶標記的放大探針連接，獲得標準復合物；取所述酶標記的放大探針中所述酶的底物及其底物催化劑與所述標準復合物混合，孵育，獲得標準光強度，根據(jù)濃度與光強度的關(guān)系建立標準曲線； 步驟2:取宮頸上皮脫落細胞，經(jīng)裂解獲得待測樣品的mRNA ； 所述待測樣品的mRNA通過捕獲延伸探針、固定探針與固相載體連接； 所述待測樣品的mRNA通過標記延伸探針與預放大探針連接后，所述預放大探針與酶標記的放大探針連接，獲得待測復合物； 取所述酶標記的放大探針中所述酶的底物及其底物催化劑與所述待測復合物混合，孵育，獲得待測光強度； 步驟3:根據(jù)所述待測光強度以及步驟I中所述標準曲線獲得所述待測樣品的濃度。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述孵育溫度為53 56°C，孵育時間為3 4h。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測宮頸癌致癌基因的引物探針、試劑盒及用于非檢測疾病目的的檢測方法。該探針特異性好，降低了假陽性率。該方法經(jīng)過雜交、信號放大、酶促化學發(fā)光，實現(xiàn)對待測核酸的定量檢測，不經(jīng)過呈指數(shù)增長的擴增過程，放大倍數(shù)確定，重復性，穩(wěn)定性高。
文檔編號C12N15/11GK103114132SQ201210560628
公開日2013年5月22日 申請日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者張鷺鷺, 張愛國, 劉桐宇 申請人:張鷺鷺, 張愛國, 劉桐宇